江苏省南通市中医院 药剂科 江苏南通 226001
黄连上清片具有清热通便，散风止痛之功效，主要用于头晕目眩，牙齿疼痛，口舌生疮，咽喉肿痛，耳痛耳鸣，大便秘结，小便短赤的治疗[1]。处方中的黄连清热及解毒泻火之功甚强，尤善清心胃火，凡心火、胃火上炎诸症均可直折其火势，疗效迅捷；处方中的黄柏具有抗病原微生物、抗溃疡、降压、抗心律失常等药理作用，临床上用于治疗中耳炎、皮肤感染、烧伤、慢性前列腺炎等病症[2]。处方中另一味大黄主苦寒沉降，泻热通便作用最强，对热结便秘者有良好的清热通便作用，又可引热下行，并善釜底抽薪，凡火热为患之实证者可药到病除[3]；药理研究表明本方具有解热作用，对于金黄色葡萄球菌引起的小鼠死亡有一定的保护作用，并能增强小鼠小肠推进功能[4]。
1.实验方法与结果
1.1.一测多评方法学考察
1.2.1色谱条件
色谱柱为AlltimaC18（4.6mm×150mm，5μm），流动相为0.05mol·L-1磷酸二氢钾溶液-乙腈（57：43）（每1000mL中加入1g十二烷基硫酸钠，调节pH至4.0），柱温28℃，流速0.6mL·min-1，检测波长345nm。上述色谱条件下，各组分分离度良好。
1.2.2.对照品溶液的制备
精密称取药根碱对照品6.98mg、巴马汀对照品11.36mg、小檗碱对照品80.75mg置25mL容量瓶中，加盐酸-甲醇（1：100）混合溶液适量使溶解并分稀释至刻度，摇匀，制得对照品混合储备溶液。再分别精密吸取上述对照品储备溶液1mL，置50ml量瓶中，加盐酸-甲醇（1：100）混合溶液稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液（药根碱5.584μg?mL-1、巴马汀9.088μg?mL-1、小檗碱64.6μg?mL-1）。
1.2.3供试品溶液的制备
取本品10片，除去糖衣，精密称定，研细，取约1g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-甲醇（1：100）的混合溶液50ml，称定重量，置50℃水浴中加热15分钟，取出，放冷，超声处理30min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10ml，置50℃水浴上挥干溶剂，残渣用甲醇适量使溶解，加在碱性氧化铝柱（100～200目，8g，内径为1cm）上，用甲醇35ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，并转移至10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取此溶液过0.45μm滤膜，20μl进样。
1.2.4线性范围
精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液 1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、15μL、20μL，进样分析，每个浓度进样三次，取平均值。以进样量对峰面积积分值进行回归处理，得药根碱、巴马汀和小檗碱的标准曲线合格，R值分别为0.999，0.992，1.000。
1.2.5精密度实验
精密吸取对照品混合溶液20μL连续进样6次，记录药根碱，巴马汀和小檗碱的峰面积，计算RSD分别为0.2％，0.7％和0.4％。说明仪器较稳定，精密度良好。
1.2.6稳定性及重复性实验
精密吸取同一对照品溶液20μL分别于配置后0，1，2，4，8，12，20h进样，记录药根碱，巴马汀和小檗碱的峰面积，计算RSD分别为0.2％，0.3％和0.1％，表明三种生物碱在20h内稳定。测定盐酸药根碱，盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的平均含量为0.04033 mg/片，0.07063 mg/片和0.5334 mg/片，RSD为2.0％，0.6％和1.0％，重复性良好。
1.2.7加样回收率
精密称取已知含量的黄连上清片粉末0.5g，共9份，每3份为一组，共分为三组，每组分别加入“2.2.2”项下对照品混合溶液10ml、25 ml、40 ml，再分别精密加盐酸-甲醇（1：100）的混合溶液至50ml，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，测定，计算加样回收率，药根碱，巴马汀和小檗碱的加样回收率为分别为98.0 ％，98.2％，98.9％，RSD分别为0.7％，0.8％和0.3％。
取本品10片，除去糖衣，精密称定，研细，取约1g（n=2），精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，照“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液。精密吸取上述供试品溶液及“2.2.2”项下混合对照品溶液各20μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积。再分别采用外标一点法和“一测多评”法计算黄连上清片中盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的含量，结果见表1。
3.讨论
3.1 流动相的选择
实验中考察了不同浓度的磷酸盐缓冲液对色谱峰的影响。因小檗碱和巴马汀为极性较强的生物碱类化合物，采用不同比例的乙腈-磷酸盐溶液作为流动相系统进行分析，峰型较差，且色谱峰重叠无法得到有效分离。改用乙腈-磷酸二氢钾-十二烷基硫酸钠系统后，分离效果明显改善，且峰形较好。增加流动相中乙腈的比例，可以显著缩短色谱峰的保留时间，调整乙腈的比例为43，可以使药根碱、巴马汀、小檗碱与其他杂质完全分离，且具有较短的分析时间。
3.2结论
从实验数据可以看出，有两批样品中只检出了小檗碱而未检出药根碱和巴马汀，可能是生产过程中非法添加了盐酸小檗碱来替代黄连和黄柏药材投料，存在偷工减料的可能性，而本实验建立的HPLC方法能同时测定黄连上清片中药根碱、巴马汀和小檗碱的含量，方法简便，结果准确，同时采用“一测多评”的方法，以小檗碱为内标参照，不需使用其他两者生物碱对照品，通过校正因子计算出含量，与外标实测值结果一致，本方法可用于黄连上清片的质量控制，真实评价药品的内在质量。
参考文献：
[1]卫生部药品标准中药成方制剂第六册[S]．1992：160.
[2]ChP（中国药典）．2005．Vol I（一部）：214.
[3]ChP（中国药典）．2005．Vol I（一部）：214.
[4]田军，蒋珠芬，杨士友，孙备.黄连上清胶囊的临床研究.中药药药理与临床，1999，15（3）：41～42.
论文作者:吴育（通讯作者）
论文发表刊物:《健康世界》2016年第3期
论文发表时间:2016/6/2
标签：巴马论文; 溶液论文; 精密论文; 盐酸论文; 小檗论文; 甲醇论文; 黄连论文; 《健康世界》2016年第3期论文;