黑龙江省传染病防治院 150518
【摘 要】目的：研究分析从人血清提取 ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被进行抗原检测，并讨论结核病诊断新方法。方法：利用本室构建并纯化的结核分枝杆菌特异性抗原蛋白 ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68，建立结核分枝杆菌特异性抗体检测的间接 ELISA 检测方法，并与 PPD-ELISA 同时检测 220 例结核病人血清、30 例非结核呼吸疾病病人血清和 50 例健康人群血清，分别对三种方法的敏感性与特异性进行统计学分析。结果：ESAT6-ELISA 的敏感性为 25%，特异性为 95%；CFP10-ESAT6-ELISA 的敏感性为 45%，特异性为 93%；ESAT6-PPE68-ELISA 的敏感性为 48%，特异性为 85%。结论：三种结核分枝杆菌特异性抗体检测方法的敏感性均低于 PPD-ELISA，但三种结核分枝杆菌特异性抗体检测方法的特异性均高于 PPD-ELISA，其中 CFP10-ESAT6-ELISA 检测的效果最佳，PPE68 可作为结核特异性诊断的候选抗原。
【关键词】结核分枝杆菌；ESAT6；CFP10；PPE68；ELISA
结核病作为一种慢性传染性疾病，近年来发病率有上升趋势，临床上认为结核分枝杆菌引发呼吸道慢性传染是结核病发病的根源，由于其较高的感染率与耐药性，因此结核病的快速诊断对于结核防治有着重要的作用，但至今尚没有一种准确、快速、可靠的检测结核分枝杆菌感染的方法。结核菌素纯化蛋白衍生物（PPD）是从结核分枝杆菌培养滤液中获得的复杂蛋白物质，含有多种抗原成分，其最大的弱点是 PPD所包含的抗原为致病性分枝杆菌、非致病性分枝杆菌和卡介苗（bacillus calmette guerin，BCG）所共有[1]，故阳性结果也不能区分是致病性分枝杆菌还是非致病性分枝杆菌感，染抑或是接种 BCG 免疫的结果，大大减低了检测的特异性。因此本实验以 PPD 为参考，在建立 PPD-ELISA 的基础上，以ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68 为抗原，并对三种特异性抗体 ELISA 检测方法在对结核病的诊断效果进行了比较和评估。
1 材料与方法
1.1 抗原与主要试剂
纯化重组蛋白 ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68 由本室前期制备，结核分枝杆菌纯化蛋白衍生物（PPD）由贵阳市疾病预防控制中心提供。
主要试剂：牛血清白蛋白（BSA）由上海生工公司提供；脱脂乳（MILK）为雀巢公司产品；HRP 标记的羊抗人IgG 及 DAB 显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；96 孔酶标板为德国 Greiner 公司产品；ELISA 相关溶液由实验室自己配制。
1.2结核病参考血清和临床待检血清
结核病参考血清和临床待检血清由贵阳疾病预防控制中心提供。临床待检血清中 220 例为痰涂片染色镜检阳性、临床及 X 线诊断为肺结核的结核病人血清，其中男 148 例，女 72 例，年龄 14～78 岁。30 例非结核呼吸疾病病人（肺炎、急慢性支气管炎、肺癌）血清由我院呼吸科提供。
1.3方法
1.3.1 PPD-ELISA 最佳反应条件的确立
抗原 PPD 按 1∶400包被，即 42 μg / ml，放置 4℃过夜，取出洗涤 5 次，每次5 min 后，每孔加入 200 μl 1.0%BSA 封闭液，37℃封闭 1 h。血清样本用 PBST 按 1∶40 稀释，100 μl / 孔，37℃反 应 1 h后，洗涤 5 次。加入 1∶2000 稀释的 HRP 标记的羊抗人IgG100 μl / 孔，37℃反应 30 min，洗涤 5 次，最后拍干，每孔加入 DAB 底物液 100 μl，室温避光反应 10 min，最后加入50 μl 2 mol / L H2SO4终止反应，用酶标仪在 490 nm 波长下测定 吸光度 A 值。PPD-ELISA 阴 阳界 限的确 定：PPD-ELISA 检测 80 份健康人群血清，计算样品 / 阴性（S / N）平均值为 1.55，SD 为 0.32，求得临界 S/N=X+2SD=2.19，临界吸光度 A 值为 N×2.19，当 N<0.05 时以 0.05 计算。
1.3.2 结核分枝杆菌特异性抗体 ELISA 检测方法的建立
分别以结核分枝杆菌特异性蛋白抗原 ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68 作为包被用抗原，参照确立的 PPD-ELISA 方法，方阵滴定确定特异抗原 ESAT6、CFP10-ESAT6和 ESAT6-PPE68 的抗原包被液均按照 1∶200 稀释，浓度分别为 8 μg / ml、9 μg / ml 和 10 μg / ml，血清稀释度为 1∶40。建立三种间接 ELISA 检测方法，检测病人血清中的结核分枝杆菌特异性抗体，分别命名为 ESAT6、CFP10-ESAT6 和 ESAT6-PPE68。参照 PPD-ELISA 临界值的确定方法，计算各 ELISA 的临界值。
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1.3.3结核分枝杆菌特异性抗体 ELISA 检测方法的统计学分析
用 PPD-ELISA 和建立的检测特异性抗体的间接ELISA 检测方法分别检测 220 例确诊的结核病人血清、30 例非结核呼吸疾病病人血清和 50 例健康人群血清，统计各种方法的灵敏度与特异性，对几种检测方法进行分析和评价。
2 结果
2.1 结核分枝杆菌特异性抗体 ELISA 检测方法的评价
2.1.1 结核分枝杆菌特异性抗体 ELISA 检测方法的敏感性与特异性比较
分别采用PPD、ESAT6、CFP10-ESAT6 以 及 ESAT6-PPE68 检测220例确诊的结核病人血清、30 例非结核呼吸疾病病人血清和 50 例健康人群血清，统计四种方法的敏感性与特异性，。以上结果表明，三种结核分枝杆菌特异性抗体的敏感性较低，但特异性均高于 PPD-ELISA 法。经统计，CFP10-ESAT6 的敏感性高于ESAT6 但 CFP10-ESAT6 与 ESAT6-PPE68比较两种方法的敏感性差异无统计学意义。CFP10-ESAT6的特异性高于 ESAT6-PPE68。
2.1.1 结核分枝杆菌特异性抗体 ELISA 检测与 PPD-ELISA 检测的比较
结果三种特异性抗体 ELISA 检测方法与 PPD-ELISA 的符合率分别为 62%、80%和 80%，相对敏感性分别为 38%、72%和 75%。PPD-ELISA检测的 95 名阴性病人中结核特异抗体 ELISA 检测方法分别检出 7 名、9 名和 12 名阳性病人。经统计，三种结核特异性抗体 ELISA 检测方法的敏感性均不如 PPD-ELISA 检测方法，但特异性均高于 PPD-ELISA 检测方法。
3 讨论
本实验以结核菌素纯化蛋白衍生物（PPD）为包被抗原，通过对血清稀释度、封闭液、底物作用时间及阴阳判定方法等方面的摸索，建立了优化后的 PPD-ELISA 程序，参考此方法，分别建立了以结核分枝杆菌特异性蛋白 ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68 为包被抗原检测结核病人血清中特异性抗体的间接 ELISA 检测方法[2]。通过与 PPD-ELISA 进行比较发现，三种特异性抗体 ELISA 检测方法对结核病的诊断显示出了更高的特异性，将特异性抗体 ELISA 检测方法用于复检 PPD-ELISA 阳性的病人，将有利于提高结核病诊断的准确性。通过比较三种特异性抗体 ELISA 检测方法的特异性与灵敏度，发现两融合蛋白-ELISA 的敏感性高于单一蛋白 ESAT6-ELISA，两融合蛋白-ELISA 之间的敏感性无差异，但 CFP10-ESAT-ELISA的特异性高于 ESAT6-PPE68-ELISA，三种特异性抗体ELISA 检测方法中 CFP10-ESAT6-ELISA 的效果最好，PPE68 也是很有研究价值的结核特异性诊断抗原。
PPE68是由位于结核分枝杆菌基因组 RD1 区 的Rv3873 所编码的蛋白，属于一组富含甘氨酸的独特的蛋白质家族-PPE 蛋白家族[3]。对 PPE68 的免疫原性研究表明，PPE68 蛋白可以产生迟发性超敏反应，能够激出强烈的细胞免疫，刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，诱导大量 IFN-γ 的产生[4，5]。Demangel 等[8]的研究表明，该蛋白主要存在于结核分枝杆菌菌壁中，具有很高的特异性。本实验建立的结核特 异 性 抗 体 ESAT6-PPE68-ELISA 检 测 方 法 的 敏 感 性 比CFP10-ESAT6-ELISA 略高，但差异不具有统计学意义，其特 异 性 低 于 ESAT6-ELISA、CFP10-ESAT6-ELISA，但 高 于PPD-ELISA 的特异性，差异具有统计学意义，认为 PPE68 蛋白可以作为一种较好的结核病特异性诊断用候选抗原。
虽然 PPD-ELISA 的敏感性高于三种结核特异性抗体ELISA 方法，但存在特异性较低的弱点，实验发现结核特异性抗体 ELISA 检测方法能从 PPD-ELISA 检测阴性的病人中检出阳性。由于 PPD 在特异性上存在的问题以及单一特异抗原蛋白用于检测的敏感性低，将多种特异性高的抗原蛋白联合应用于检测结核病患者血清中的特异性抗体是结核病血清学诊断试剂的研究方向，积极寻找特异性高的结核诊断候选抗原将有助于结核病的防治[6]。
参考文献：
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论文作者:吴向华
论文发表刊物:《航空军医》2015年16期
论文发表时间:2016/3/15
标签：特异性论文; 结核论文; 分枝论文; 血清论文; 杆菌论文; 抗原论文; 抗体论文; 《航空军医》2015年16期论文;