1大庆医学高等专科学校 黑龙江大庆 163312；2大庆油田总医院儿科 黑龙江大庆 163111
轮状病毒属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属，其基因组由11节段双股 RNA 组成，共编码 6 种结构蛋白和 6 种非结构蛋白。其中，vp 7为糖蛋白，是RV外壳蛋白的重要成分，可刺激机体产生特异性中和抗体并介导病毒进入细胞。所以，选用vp7作抗原已成为国内外轮状病毒基因工程疫苗研究的主要方向。
乳酸菌是肠道益生菌，本身可刺激机体产生黏膜及全身免疫反应，且实验证明用它表达的外源蛋白无需经过纯化可以直接连同菌体一起服用[1]。
本研究将前期制备的pLA- vp7重组干酪乳杆菌进行动物免疫保护性试验以期证实口服免疫和肌肉注射免疫pLA-vp7/L.casei重组菌均能诱导机体产生IgG抗体，并且经口服免疫后，能有效刺激小鼠体内产生IgA。由此得出，口服该重组菌既可以刺激机体产生体液免疫，也可以刺激机体产生局部免疫，并进一步为筛选制备适用于口服的轮状病毒基因工程乳酸菌疫苗的研究奠定实验基础。
1.材料与试剂
1.1 试验动物
4～6周龄，雌性SPF级C57BL/6小鼠。
1.2 菌株
轮状病毒分离株、轮状病毒强毒株、阳性重组菌株pLA-vp7/L.casei、MA104细胞
1.3 主要试剂
辣根酶标记的羊抗鼠IgG、抗小鼠CD28 单克隆抗体（MAb）、FITC-抗CD107a、PerCP-抗CD4+、PerCP-抗CD8a+、PE-抗IFN-γ（或抗IL-2、抗IL-4、抗TNF-α）MAbs
2.方法
2.1免疫用重组干酪乳杆菌菌悬液的制备。
2.2重组乳酸菌pLA-VP7/L.casei免疫剂量筛选试验。
将4～6周龄SPF级C57BL/6小鼠24只，随机分成4组（6只/组），设为3个口服免疫组、3个肌肉注射免疫组和2个空白对照组。免疫组分别以5×107CFU/mL、5×109CFU/mL、5×1011CFU/mL菌悬液按200μL/只的剂量进行口服接种，空白对照组口服相应剂量的PBS。各组连续免疫7天，并于每次免疫后的一周采集血清样本，分别测定其血凝抑制抗体效价。
2.3试验动物分组及免疫程序制定
免疫组：4～6周龄SPF级C57BL/6小鼠60只，随机分成6组，每组10只
攻毒组：4～6周龄SPF级C57BL/6小鼠60只分成A、B2组，每组30只。
免疫程序：分别以5×109 CFU/mL菌悬液用灌胃针口服免疫小鼠（100 μL/只）及肌肉注射免疫小鼠（100 μL/只），每2周免疫一次，每次连续免疫三天，共免疫三次；同时，给予空菌载体对照组和空白对照组按100 μL/只的剂量分别口服pLA/L.casei乳酸菌和无菌PBS，作为对照。各组免疫后，分别于不同时间处死取样，检测特异性抗体水平。
2.4样本采集。
2.5间接ELISA检测小鼠的免疫原性分析。
2.6免疫保护性试验
根据Gábor Nagy[98]的方法在末次加强免疫后的第3周和第9周，对攻毒组的小鼠进行攻毒试验。每只小鼠的攻毒剂量为3×103LD50轮状病毒强毒株。观察小鼠的发病及死亡情况，并进行记录，用long rank test统计小鼠保护率。
3.结果
3.1重组蛋白的纯化结果
通过Amersham基因定量仪进行定量，测得浓缩纯化后的VP7蛋白浓度为2.35mg/mL，纯化效果理想。
3.2免疫剂量筛选结果
结果表明，口服及肌肉注射5×109CFU/mL的剂量组能诱导较高水平的抗体滴度（图3-1）。
图3-1 重组菌pLA-vp7/L.casei的免疫剂量筛选
3.3血清中VP7特异性IgG的效价
经统计学分析结果表明：经口服和肌肉注射两种免疫途径免疫小鼠，血清中产生的IgG抗体效价肌肉注射免疫组略高于口服免疫组，但两者无显著性差异，P>0.05；两组免疫组与其对照组均有显著性差异，P<0.05，说明将口服免疫和肌肉注射免疫pLA-vp7/L.casei重组菌均能诱导机体产生IgG抗体。
3.4洗液及粪便中vp7特异性sIgA测定
统计学分析结果表明：口服免疫组与对照组小鼠肠道黏膜sIgA存在显著差异，P<0.05，肌肉注射免疫组与对照组则无显著差异，P>0.05，口服免疫组与肌肉注射免疫组存在显著差，P<0.05。上述分析结果说明：经口服免疫后，能有效刺激小鼠体内产生sIgA；而经肌肉注射免疫后，则不能有效刺激小鼠体内产生sIgA。
统计学分析结果表明：口服免疫试验组小鼠体内的特异性IgA水平明显高于对照组，两者存在显著差异（P<0.05）；肌肉注射免疫组小鼠体内的特异性IgA水平与对照组无显著差异（p>0.05）；口服免疫组与肌肉注射免疫组小鼠体内产生的特异性IgA水平存在显著差（P>0.05）。
3.5免疫保护性试验结果
于末免后的3周（51d）和9周（93d）后，对攻毒组小鼠进行攻毒保护性实验，攻毒的剂量7.2×108 CFU（3×103LD50），观察小鼠发病情况，连续观察20天。对照组小鼠在攻毒后出现精神萎靡，皮毛蓬松皱褶、活动呆滞、摄食减少、精神萎靡嗜睡最终死亡。对照组的死亡率为100%，74d时小鼠免疫组的保护率均高于75%以上，而对照组的死亡率为100%。116 d时再次以同样的方式对小鼠攻毒，结果显示小鼠免疫组的保护率菌高60%以上，与对照组差异显著（p<0.001）。
4.讨论
轮状病毒是世界范围内 2 岁以下婴幼儿严重腹泻疾病的最主要病原［2］。在发展中国家，轮状病毒通常是婴幼儿致命性腹泻的首要病因。轮状病毒感染与免疫反应引起的炎症介质、肠道激素、细胞因子变化有关。嗜酸乳杆菌为乳杆菌属，革兰阳性，不产芽孢，不运动，可发酵糖产生乳酸、乙醇、过氧化氢等的厌氧或兼性厌氧的微生物［11］，是人和动物肠道内的主要微生物之一。嗜酸乳杆菌能通过免疫保护作用，阻断许多微生物的入侵和黏附［3］。口服嗜酸乳杆菌能刺激人体产生非特异性免疫。本研究实验结果标明，以将轮状病毒VP7基因高效稳定地展示表达在干酪乳杆菌细胞表面，构建得到重组质粒pLA- VP7，后将其电转化到干酪乳杆菌Lactobacillus casei中，制备的pLA- VP7的重组干酪乳杆菌，可诱导小鼠产生黏膜免疫应答和系统免疫应答，能有效地预防轮状病毒的感染，为RV重组乳酸菌多价口服疫苗的研制提供了重要的实验基础。
参考文献：
[1] 陈思维，钟瑾，还连栋.微生物学报，2007，47（6）：987~991.
[2]Parashar U D，Burton A，Lanata C，et al． Global mortality associated with rotavirus disease among children in 2004 ［J］． J Infect Dis，2009，200（Suppl 1）：S9－S15．
[3]Dimitonova S P，Danova S T，Serkedjieva J P，et al． Antimicrobial activity and protective properties of vaginal lactobacilli from healthy Bulgarian women ［J］． Anaerobe，2007，13（5－6）：178－184
论文作者:文程1,程玉宏1,王薇2,贾佳1,冷淑萍1,何旭辉
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年第27期
论文发表时间:2018/11/19
标签：免疫论文; 小鼠论文; 对照组论文; 杆菌论文; 病毒论文; 特异性论文; 剂量论文; 《中国误诊学杂志》2018年第27期论文;