龙冬梅[1]2001年在《细胞凋亡及凋亡相关基因在大鼠肝癌促癌过程中的作用研究》文中提出化学致癌作用是一个复杂的、多阶段过程，涉及基因表达、细胞生理和生化的多种变化，通常分为启动、促进和进展叁个阶段。化学致癌物一般分为两大类：遗传毒性致癌物和非遗传毒性致癌物。很多非遗传毒性致癌物是肿瘤促进剂（促癌物）。在启动阶段，致癌物通过与DNA和染色体发生作用，造成一系列不可逆的遗传学变化，从而形成潜在的肿瘤细胞（即“启动细胞”）。在促癌阶段，促癌物本身不具有或仅具有弱致癌性，但它们能通过长期反复的累积作用，促进启动细胞表型发生改变（即癌变），最终形成恶性肿瘤。这一阶段促癌物发挥了重要的调节作用。但促癌物的促癌作用机制尚不清楚。 过去认为促癌阶段可能主要是由于某些和增殖相关的癌基因异常表达，引起启动细胞无限制增殖。近年来，一些学者研究发现某些促癌物可抑制细胞凋亡，提出在促癌过程中细胞凋亡的抑制起着重要的作用，可能是促癌作用的重要机制之一。但细胞凋亡在促癌过程中的分子机制国内外还少见报道。为此，本研究采用二乙基亚硝胺（DEN）诱导启动、切肝手术刺激和2-乙酸基氨基芴（2-AAF）选择性抑制的方法复制了实验性大鼠肝癌启动模型，并在此基础上建立了大鼠肝癌长期促进模型，研究促癌物苯巴比妥（PB）在大鼠促癌形成过程中对细胞凋亡的影响及其凋亡相关基因Bcl-2、Bax、p53、Fas、FasL、TGF-β1及相应受体TβRⅠ和TβRⅡ的表达情况。实验分为高剂量促癌物组（简称高剂量组500mgPB/kg diet）、中剂量促癌物组（中剂量组100mg PB/kg diet）、低剂量促癌物组（低剂量组10mg PB/kgdiet）、单纯启动对照组（启动组）、单纯促癌物对照组、和正常对照组（正常组）。 实验结果如下： 一、经皿N启动诱发的大鼠肝癌前病灶其细胞凋亡率显着高于正常组。在高剂量组和中剂量组，加人促癌物PB后，凋亡率明显降低。高剂量组在第20周撤除PB后10周凋亡率明显增高。而低剂量组凋亡率虽呈厂降趋势，但差异不显着。结果提示促癌物的作用存在阈剂量。高剂量和中剂量促癌物具有明显的促进作用，促癌剂量的促癌物能抑制癌前肝细胞的凋亡。这可能是促癌物促癌作用的机制之一。 二、初步揭示了促癌物苯巴比妥对凋亡相关基因 BclZ。Bax和 p53表达的影响及意义。 1．所有经启动处理的实验组（高剂量组、中剂量组、低剂量组和启动组）bC12表达均高于正常对照组。促癌剂量作用下（即高剂量组和中剂量组＼ hcf《 mRNA和蛋臼表达水平均随着促癌物作用时间的延长而呈增高趋势，低剂量组表达呈一定的下降趋势。结果提示促癌物抑制凋亡可能与其对抗凋亡基因BCI．2表达的上调有关。 2．Bax mANA表达水平和蛋白表达水平在促癌作用剂量下随着促癌物PB处理时间的延长而下降，在PB处理20周后，表达很少。在撤除PB后，Bax表达有所回升。低剂量组和启动组表达高于高剂量组。所有经启动处理的实验组（高剂量组、中剂量组、低剂量组和启动组）表达均高于正常对照组。Bax蛋白表达水平与 mRNA表达水平相一致。结果提示 PB对凋亡的抑制可能与促凋亡基因Bax表达下调有关。 3．免疫组化结果显示正常时突变型p53蛋白（mtp53）未见表达。在经启动处理后的各组大鼠肝癌前病变中可见＊中53表达。高剂量组和中剂量组随着PB给予时间的延长，mtp53表达呈增高趋势。低剂量组和启动组随着时相点延长未见表达增高。而原位杂交和 RT，PCR对mRNA检测的结果显示，经致癌剂启动处理后的大鼠肝p53mRNA表达显着高于正常组，给予促癌物后p53mRNA表达降低。这些结果提示p53可能参与大鼠肝的促癌过程，促癌物可能诱导mtp53蛋白的产生而抑制野生型p53…tp53），从而抑制凋亡。 Vll 8 叁、促癌物苯巴比妥对Fas”asL系统在实验性大鼠肝促癌过程中的表达影响及意义。 结果显示所有经启动处理的实验组（高剂量组、中剂量组、低剂量组和启动组）Fas表达均高于正常对照组。高剂量组和中剂量组在促癌过程的 15周后 Fas蛋白在肝细胞表达下降，而 FasL在促癌过程中有表达。Fas mRNA表达在正常时较高，经DEN启动处理后，Fas mRNA表达下降，在促癌过程中随促癌物作用时间延长Fas mRNA表达呈下降趋势。FasL mRNA正常时表达较低DEN启动后表达增高，给予高剂量促癌物处理后 FasL mRNA表达呈上升趋势。而低剂量和启动组随时相点延长，呈现为下降趋势。结果提示Fas／FsaL参与大鼠肝促癌过程，细胞凋亡的抑制可能与Fas表达下调和FasL表达上调相关。其机制还有待于进一步研究。 四、TGFpl及相应受体TpRI和TpRll在大鼠肝促癌过程中的表达 本实验结果显示经启动后的大鼠 TGF 61 mRNA表达高于正常组，但促癌物处理未引起 TGF pl mRNA水平表达的改变，而 TGF pl蛋白表达水平随着促癌物处理的时间延长呈增高趋势，尤其在纤维化结节中呈强阳性表达。而 T P R
龙冬梅, 冷言冰, 曹波, 胡冉, 高宁[2]2001年在《细胞凋亡及相关Bcl-2蛋白在大鼠肝促癌中的作用》文中进行了进一步梳理目的:研究大鼠肝癌促癌阶段促癌物苯巴比妥(PB)对细胞凋亡的作用及其相关基因Bcl-2表达情况。方法:复制大鼠肝癌启动/促进模型,采用TUNEL法检测各实验组不同时相点细胞凋亡率,免疫组化SABC法检测Bcl-2基因蛋白表达情况。结果:高、中、低剂量组和启动组随着时相点的延长细胞凋亡率是降低的,且各时相点间凋亡率均值比较差异显着(P<0.05),而正常组和单纯促癌组各时相点凋亡率基本稳定,无显着差异(P>0.05)。撤除组当撤除PB后细胞凋亡率显着升高,与撤除前一时相点比较差异显着(P<0.05)。Bcl-2基因蛋白表达在高、中剂量组随着时相点的延长呈现增加的趋势,且各时相点间均值比较差异显着(P<0.05)。低剂量组和启动组随着时相点的延长Bcl-2基因蛋白表达呈下降趋势,但各时相点间比较差异不显着(P>0.05)。正常组和单纯促癌组各时相点Bcl-2基因蛋白表达基本稳定,无显着差异(P>0.05)。撤除组当撤除PB后Bcl-2基因蛋白表达显着降低,与撤除前一时相点比较差异显着(P<0.05)。结论:在大鼠肝促癌阶段,促癌物PB能抑制大鼠肝癌前病变的细胞凋亡,增加凋亡相关Bcl-2基因蛋白表达,提示凋亡的抑制可能是促癌作用的机制之一,凋亡的抑制与Bcl-2基因蛋白表达的增加有关。
黄峰[3]2013年在《基于“治未病”思想的癌痛消方防治大鼠诱导性肝癌的实验研究》文中认为目的1.以不同浓度的二乙基亚硝胺(DEN)水溶液诱发肝癌大鼠模型,并通过成癌率及生存时间等指标,确定诱发肝癌大鼠模型的最佳浓度及时间。2.检测64ppm DEN诱导的肝癌大鼠模型在不同时间点Bax、Bcl-2、Survivin、Fas、FasL、Caspase-3等基因的表达情况,确定与肝癌形成有关的优势基因。3.通过分析癌痛消方(Aitongxiao major Prescription,ATXP)干预治疗后肝癌大鼠模型在不同时间点肝脏组织病理变化,及Bax、Bcl-2、Survivin、Fas、FasL、Caspase-3等细胞凋亡相关基因和蛋白的表达变化和原位细胞凋亡情况,探讨其防治原发性肝癌的机制。方法1.SPF级雄性Wistar大鼠96只,随机分为4组,每组24只。各组动物分别以含DEN 40ppm、64ppm、80ppm的水溶液和纯净水饲养,自由饮用,连续16周。于实验第16周,各组动物随机取12只处死,取肝脏标本并进行HE染色,在光学显微镜下观察各组动物肝癌病理切片并统计成癌率。各组剩余的12只大鼠用于观察生存时间。2. Wistar雄性大鼠60只,随机分为造模组40只、正常对照组20只。造模组饲以含64ppmDEN的自来水,饲养16周后,改为饮用自来水；对照组自由饮用自来水。分别于4W、8W、12W、16W.18W随机取出造模组动物4只、对照组动物2只,断头处死,取肝组织进行病理及Bcl-2、Bax、Caspase-3、Survivin、 Fas/FasL等基因表达分析。3.雄性Wistar大鼠40只,分为预防组和模型对照组,每组20只；动物以64ppm DEN饮水饲养,连续16周后,改为自来水。同时,自诱癌之日起,预防组予以ATXP灌胃(0.2g/100g),1/日每周连续用药6d,停药1d修整；模型对照组给药周期为18w。分别在4、8、12、16、8w,每组随机取4只大鼠断头处死,取肝组织(阳性部位)进行HE染色,观察癌组织的病理变化,并通过RT-PCR、SABC等方法检测肝组织Bax、Bcl-2、Survivin、Fas、FasL、Caspase-3等基因和蛋白的表达,并采用TUNNEL法检测肝细胞原位凋亡情况。结果1.动物饲养18w后,80ppm组成癌率为91.16%,64ppm组为83.33%,40ppm组为0;80ppm组22w病死率为33.33%,26w病死率为100%,而64ppm组大鼠第22w病死率为0,26w病死率为16.67%,第30w病死率为100%;40ppm组在第30w病死率为16.67%。80ppm组和64ppm组成癌率,无显着性差异(p>0.05)；但在生存期方面,前者明显延长(p<0.05)。2.各时间点病理检测结果显示,大鼠肝组织存在肝损伤和病理损伤,经历肝脏炎症→脂肪病变→肝纤维化→肝硬化→肝癌的病程发展过程,同HBV病毒感染的病理一致。DEN处理的大鼠,各时间点肝组织中Bax、Bcl-2基因持续高表达,Survivin、Fas基因仅在第8w高表达；Fasl基因在第8w、12w、18w匀高表达；Casepase处于低表达或不表达水平。3、RT-PCR结果：ATX干预过程可以全程下调survivin、Bcl-2基因的表达,上调casepase基因的表达,Bax仅在12w表达上调,Fas和Fasl在4w表达上调,其余时间点变化不明显4.免疫组化结果：survivin、casepase-3. Fas/Fasl、Bax、Bcl-2蛋白表达和基因表达一致；对照组survivin在16w、18w表达明显。casepase-3蛋白在整个诱癌过程均表达较少；Bcl-2蛋白在诱癌早期就即有表达,在诱癌过程呈现持续高表达,18w达峰值；而Bax、Fas/Fasl蛋白在第8w表达量最高；预防组抑制凋亡基因survivin和Bcl-2在整个观察时间点表达均较对照组表达降低(p<0.05)；casepase-3和Bax蛋白在整个观察时间点表达均明显升高(p<0.05)；Fas、Fasl蛋白表达量在4w较对照组明显升高(p<0.0)。5.TUNEL结果：阴性对照组各时间点未见凋亡细胞；模型组在4w、8w.12w未见凋亡细胞,16w、18w存在少量凋亡细胞；预防组在4w未观察到凋亡细胞,8w、12w有少量凋亡细胞,而16w到18w凋亡细胞数量显着增多,细胞凋亡指数增高。与模型组相比,有显着性差异(P<0.01)结论1.64ppmDEN是一个诱癌用于药物疗效评价的大鼠肝癌模型较理想的条件。2.DEN诱癌整个过程是以抑凋亡基因表达上调、促凋亡基因表达下调过程,提示肝癌诱导是一个细胞增殖活跃、凋亡相关基因受到抑制的过程。3.ATX防治肝癌是通过下调凋亡抑制因子Bcl-2、survivin,上调凋亡因子casepase-3的表达,促进细胞凋亡,来实现抗癌作用的。
刘向国[4]2008年在《松果菊苷对大鼠肝癌细胞GJIC影响的研究》文中提出一、研究目的及意义:通过检测吴茱萸碱、松果菊苷、淫羊藿苷及葫芦巴碱对大鼠肝癌细胞CBRH7919GJIC功能的影响,以筛选出能促进CBRH7919细胞GJIC功能的中药活性成分;并进一步定量检测筛选出的活性成分对CBRH7919细胞GJIC功能的影响;在此基础上再检测该活性成分对CBRH7919细胞HSV-tk/GCV系统旁观者效应的影响,以了解该活性成分对GJIC功能是否有促进作用;并进一步检测该活性成分对CBRH7919细胞Cx26和Cx32表达的影响,以期探讨该活性成分影响CBRH7919细胞GJIC功能的机制,为临床综合治疗肿瘤和拓展中药的新用途提供实验依据。二、研究方法:1.检测吴茱萸碱、松果菊苷、淫羊藿苷及葫芦巴碱对CBRH7919细胞的作用:分别用终浓度为OμM、0.078125μM、0.15625μM、0.3125μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM的吴茱萸碱和终浓度为0μM、12.5μM、25μM、50gM、100μM、200μM、400μM的松果菊苷及淫羊藿苷以及终浓度为0μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM、800μM葫芦巴碱作用CBRH7919细胞48hrs。倒置显微镜下观察药物作用前后各组细胞的数目和形态;MTT法检测各组细胞存活率。2.检测吴茱萸碱、松果菊苷、淫羊藿苷及葫芦巴碱对CBRH7919细胞GJIC功能的影响:分别用终浓度为0.25gM吴茱萸碱和50gM松果菊苷及淫羊藿苷以及100μM葫芦巴碱作用CBRH7919细胞48hrs,然后采用划痕标记染料示踪技术(scrape-loading dyetransfer assay,SLDT)检测各组细胞GJIC功能。3.检测松果菊苷对CBRH7919细胞GJIC功能的影响:分别用终浓度为25μM、50μM、100μM的松果菊苷作用CBRH7919细胞24hrs和48hrs,然后采用预标记双染料传输技术(preloading and dye transefer)及流式细胞术检测各组细胞GJIC功能。4.检测松果菊苷对CBRH7919细胞HSV-tk/GCV系统旁观者效应的影响:用终浓度为25μM、50μM、100μM的松果菊苷与终浓度为15.7μM的GCV分别和联合作用CBRH7919Rk细胞以及含10%CBRH7919/tk~+细胞的CBRH7919/tk~±混合细胞48hrs。倒置显微镜下观察药物作用前后各组细胞的数目和形态;MTT法检测各组细胞抑制率,两两比较分析各组细胞抑制率的差异和旁观者效应大小,并用金正钧Q值分析松果菊苷与HSV-tk/GCV系统联合的相互作用是否具有协同性。5.检测松果菊苷对CBRH7919细胞Cx26和Cx32表达的影响:分别用终浓度为25μM、50μM、100μM的松果菊苷作用CBRH7919细胞24hrs和48hrs,然后采用FITC间接免疫荧光染色,倒置显微镜观察和流式细胞仪检测各组细胞表达Cx26和Cx32的阳性细胞数及荧光强度;采用Western-blot技术检测各组细胞Cx26和Cx32的表达量。叁、研究结果:1.吴茱萸碱、松果菊苷、淫羊藿苷及葫芦巴碱对CBRH7919细胞的作用:镜下观察可见,空白对照组细胞生长状况良好,贴壁很稳,密度高,细胞呈梭状、菱形、叁角形或多边形;与对照组细胞相比,吴吴茱萸碱0.625μM及以上浓度组、松果菊苷200μM及以上浓度组、淫羊藿苷200μM及以上浓度组、葫芦巴碱400μM及以上浓度组均出现细胞数目减少、贴壁的细胞非常少、细胞碎片很多、细胞大部分死亡(细胞变圆、脱落),吴茱萸碱各浓度组细胞存活率分别为:107.81±0.01%、111.25±0.01%、103.26±0.01%、87.00±0.02%、71.91±0.01%、64.81±0.02%;松果菊苷各浓度组细胞存活率分别为:104.90±0.03%、112.26±0.02%、112.79±0.01%、112.31±0.01%、91.44±0.02%、60.79±0.01%;淫羊藿苷各浓度组细胞存活率分别为:102.89±0.01%、106.49±0.01%、113.64±0.03%、115.12±0.02%、109.19±0.01%、99.97±0.02%;葫芦巴碱各浓度组细胞存活率分别为:99.84±0.02%、98.76±0.02%、97.06±0.02%、87.27±0.00.02%、85.31±0.04%、84.72±0.04%。2.吴茱萸碱、松果菊苷、淫羊藿苷及葫芦巴碱对CBRH7919细胞GJIC功能的影响:空白对照组细胞的荧光染料主要出现在划痕旁1列细胞中,半定量为(±),荧光亮度低,细胞间染料传输功能差;与空白对照组细胞相比,细胞经0.25μM吴茱萸碱作用48hrs后的CBRH7919细胞中,荧光染料出现在划痕附近至划痕旁的2～3列细胞内,半定量为(++),荧光亮度增加,细胞间染料传输功能增强;细胞经50μM松果菊苷作用48hrs后的CBRH7919细胞中,荧光染料出现在划痕的附近细胞内至划痕以外的5～6列甚至7～8列细胞内,半定量为(++++),形成连片状的荧光染色,荧光亮度明显增加,细胞间染料传输功能显着增强;细胞经50μM淫羊藿苷及100μM葫芦巴碱作用48hrs后的CBRH7919细胞中,荧光染料出现在划痕附近至划痕旁的1～2列细胞内,半定量为(+),荧光亮度稍增加,细胞间染料传输轻微增强。3.松果菊苷对CBRH7919细胞GJIC功能的影响:流式细胞仪测定结果显示,与空白对照组相比,经松果菊苷作用24hrs后,松果菊苷25μM组、50μM组、100μM组的红色和绿色荧光皆阳性的细胞数占总细胞数的比例增加,并且随着松果菊苷浓度的增加,红色和绿色荧光皆阳性的细胞数占总细胞数的比例逐渐增加,但增加的幅度不大;经松果菊苷作用48hrs后,松果菊苷25μM组、50μM组、100μM组的红色和绿色荧光皆阳性的细胞数占总细胞数的比例进一步增加,与空白对照组相比,增加的幅度明显增大。但松果菊苷终浓度100μM组与终浓度50μM组相比,红色和绿色荧光皆阳性的细胞数占总细胞数的比例不再上升,比终浓度50μM组略低。4.松果菊苷对CBRH7919细胞HSV-tk/GCV系统旁观者效应的影响:镜下观察发现,空白对照组和松果菊苷组细胞生长状况良好,细胞贴壁很稳,细胞密度高,细胞呈梭状、菱形、叁角形或多边形;GCV组细胞数目减少,细胞密度减低,小部分细胞死亡(细胞变圆、脱落);松果菊苷联合GCV组均出现细胞数目减少、细胞密度减低、贴壁的细胞减少、细胞死亡(细胞变圆、脱落)数增加;用25μM、50μM、100μM浓度的松果菊苷联合10%tk~+/GCV组的细胞抑制率(%)分别为16.74±0.05、17.16±0.06、18.88±0.07,与单纯10%tk~+/GCV组(7.31±0.08)和相应的各浓度单纯松果菊苷组(2.31±0.07、3.11±0.05、4.62±0.04)的抑制率相比明显要高。各组细胞实际抑制率和理论抑制率的两两比较及金正钧Q值计算结果显示,25μM、50μM、100μM浓度下的松果菊苷联合10%tk~+/GCV组的实际抑制率(分别为16.74、17.16、18.88)显着高于理论抑制率(分别为9.45、10.19、11.59),金正钧Q值分别为1.77、1.68、1.62,均大于1.15,说明其增效作用为协同作用。5.松果菊苷对CBRH7919细胞Cx26和Cx32表达的影响:用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪分析结果显示,与空白对照组相比,经松果菊苷作用后,CBRH7919细胞表达Cx26和Cx32的阳性细胞数增多、荧光强度增强。Western-blot测定结果显示,与空白对照组相比,经松果菊苷作用后,CBRH7919细胞Cx26和Cx32的表达量增加,并呈一定的剂量效应依赖关系。四、结论:1.吴茱萸碱对细胞对大鼠肝癌细胞CBRH7919有较强的细胞毒性;松果菊苷、淫羊藿苷及葫芦巴碱对CBRH7919细胞的细胞毒性较弱。2.在筛选的四种中药活性成分中,松果菊苷能显着促进和恢复CBRH7919细胞GJIC的功能,故选取松果菊苷作为进一步观察影响CBRH7919细胞GJIC功能的药物。今后在研究药物影响细胞GJIC的实验中,划痕标记染料示踪实验可以作为初步筛选待选药物的指标。3.松果菊苷具有上调大鼠肝癌细胞CBRH7919 GJIC功能的作用,并呈一定的剂量效应效应依赖关系。4.松果菊苷联合HSV-tk/GCV系统能显着地提高tk~+、tk~-混合细胞对GCV的敏感性,具有明显增强HSV-tk/GCV系统的杀伤效应的作用,而且松果菊苷对HSV-tk/GCV系统杀伤肿瘤细胞的增效作用是一种协同性相互作用。松果菊苷可能通过提高HSV-tk/GCV系统旁观者效应来实现这种协同性增效作用,其机制可能主要是松果菊苷促进和恢复了CBRH7919细胞GJIC的功能。5.松果菊苷对大鼠肝癌细胞CBRH7919 Cx26和Cx32的表达有促进作用,并呈一定的剂量效应依赖关系,而且可能促进Cx26和Cx32的靶向输送,使表达的Cx26和Cx32主要分布在细胞膜上,有利于细胞间通讯。6.松果菊苷可能通过促进大鼠肝癌细胞CBRH7919 Cx表达、成熟与定位分布,在一定程度上恢复了Cx介导的GJIC功能,重新建立细胞间连接,进而提高HSV-tk/GCV系统旁观者效应来实现与HSV-tk/GCV系统协同性增效作用。
龙冬梅, 刘友生, 吴德生, 高宁[5]2004年在《p53基因在苯巴比妥促大鼠肝癌过程中的表达》文中指出目的研究p53基因mRNA及蛋白在大鼠肝促癌过程中的表达及作用。方法雄性Wistar大鼠随机分为6组:高、中、低剂量组,启动对照组、促癌对照组、正常对照组。高、中、低剂量组、启动对照组建立大鼠肝癌二阶段启动鄄促进模型。高、中、低剂量组分别给予含500、100、50mg/kg苯巴比妥的饲料;启动对照组只给予基础饲料;促癌对照组不启动,只给予含500mg/kg苯巴比妥的饲料;正常对照组不给予任何处理因素。各组给予苯巴比妥后的第1、5、10、15、20、30周,以免疫组化亲和链霉素鄄生物素鄄过氧化酶法检测促肝癌过程中p53基因蛋白表达,原位杂交检测p53mRNA表达。结果经启动处理的各组大鼠肝癌前病变可见突变型p53(mtp53)蛋白表达。当给予高剂量和中剂量促癌物处理后,p53蛋白表达增高。低剂量组和启动对照组p53蛋白表达高于正常,但随着促癌物给予时间的延长未见明显改变。正常对照组和促癌对照组野生型p53mRNA(wtp53)表达水平很低。经启动处理的高、中、低剂量组和启动对照组wtp53mRNA高于正常组。高、中剂量组随着促癌物给予时间的延长,wtp53mRNA表达降低,低剂量组和启动对照组随着时相点延长wtp53mRNA略呈增高趋势。结论p53参与大鼠肝癌促癌过程,可能由促癌物引起p53的下调和突变,导致不利于修复和凋亡的环境,有利于癌
韩国庆[6]2005年在《熊去氧胆酸对肝癌预防作用的实验研究》文中研究表明目的 探讨熊去氧胆酸(UDCA)预防肝癌发生的作用及作用机制。 方法 1、培养肝肿瘤细胞株HepG_2、BEL-7402和正常人肝细胞株L-02。用四氮唑蓝(MTT)法检测UDCA对HepG2,BEL7402及L-02细胞的增殖抑制作用;以流式细胞术、TUNEL和DNA凝胶电泳法测定UDCA诱导HepG2、BEL7402及L-02细胞凋亡的作用和其对细胞株增殖周期的影响;通过HE染色和电镜观察经UDCA处理后细胞形态的改变;应用RT-PCR、western blot和免疫细胞化学方法检测UDCA对上述叁种细胞株的bax、bcl-2、c-myc、N-ras、P~(21)和P~(53)基因表达的影响。 2、以二乙基亚硝胺(DEN)建立大鼠的肝癌实验动物模型。解剖实验动物,观察UDCA对实验大鼠肝癌结节数量的影响;用免疫组织化学方法,检查UDCA对大鼠肝组织GST-P和PCNA细胞阳性率的影响;以TUNEL方法,检测UDCA对大鼠肝组织细胞凋亡的作用;用流式细胞术分析UDCA对大鼠肝组织细胞增殖周期的影响;采集大鼠血液标本,检测血清甲胎蛋白、谷丙转氨酶、γ-谷氨酰转移酶及碱性磷酸酶。 3、以RT-PCR方法检测人及实验大鼠肝组织及血液GGTmRNA亚型的表达。 结果:
齐亚鹏[7]2017年在《塞来昔布对二乙基亚硝胺诱导的SD大鼠肝癌预防作用研究》文中研究指明目的:观察环氧化酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布(Celecoxib)对二乙基亚硝胺(DEN)诱导的Sprague Dawley(S D)大鼠肝细胞癌发生的抑制作用,同时检测COX-2、PTEN、PDCD4在肝组织及癌组织中的表达,探讨Celecoxib抑制肝细胞癌形成的机制。方法:将90只雄性SD大鼠随机分为3组,实验组(35只):每周称量大鼠体重并按50mg/kg的剂量腹腔内注射DEN溶液(浓度为5mg/ml)一次,同时按大鼠体重每天给予大鼠灌胃50mg/kg的实验剂量的塞来昔布;建模组(35只):除了和实验组一样腹腔内注射DEN溶液外,同时按大鼠体重每天给予大鼠灌胃2ml/kg的实验剂量的生理盐水;正常组(20只):按大鼠体重每天给予大鼠灌胃2ml/kg的剂量的生理盐水外并按10ml/kg的剂量每周腹腔注射一次生理盐水。20周后全部处死大鼠,成瘤的大鼠取肿瘤组织,未成瘤的大鼠取肝组织,每只大鼠组织分为两份,一份大鼠肝脏用中性福尔马林固定24h后,包埋做成蜡块,并进行HE染色;另一份新鲜组织冻存于液氮,并用RT-PCR和WB方法检测大鼠肝组织中COX-2、P TEN、PDCD4的m RNA和蛋白表达情况。结果:1.大鼠成瘤率比较:实验过程中,分别于第8和第16周每组随机处死大鼠5只,第8周解剖后发现,正常组大鼠和实验组大鼠肝脏无异常,建模组有2只大鼠肝脏上发现硬化结节;第16周解剖后发现,正常组大鼠肝脏仍无异常;实验组2只大鼠肝脏形成肿物;建模组5只大鼠肝脏上均形成肿物。以上大鼠只是为了追踪实验过程,不用于成瘤实验后的实验研究。实验过程中,正常组大鼠无死亡,建模组有6只大鼠异常死亡,解剖发现死亡原因为腹腔内大量腹水,考虑为肝衰竭引起的死亡;实验组有2只异常死亡,怀疑死于肠坏死。20周后处死所有剩余大鼠,解剖后发现正常组大鼠肝组织无异常;建模组剩余19只大鼠,14只形成肿物,HE染色后证实为肝癌,2只解剖后HE染色后证实为肝硬化;实验组23只存活大鼠中13只大鼠肝部有肿物形成,HE染色后证实为肝癌,10只肝部无肿物形成,其中3只病理证实为肝硬化,7只无明显异常。实验组诱导生成肝癌的大鼠成瘤率低于建模组,差异具有统计学意义(43.48%VS73.68%,P<0.05)。2.RT-PCR检测叁组肝组织中COX-2、PTEN和PDCD4 m RNA表达量:建模组的肝组织COX-2m RNA表达量高于正常组和实验组的肝组织COX-2m RNA表达量,差异有统计学意义(P<0.05),空白组和实验组的肝组织CO X-2m RNA表达量无差异;建模组的肝组织的PTENm RNA和PDCD4m RNA表达量低于空白组和实验组的肝组织PTENm RNA表达量,差异有统计学意义(P<0.05),正常组和实验组的肝组织PTENm RNA和PDCD4m RNA表达量无差异。3.WB检测叁组肝组织中COX-2、PTEN和PDCD4蛋白表达量:建模组的肝脏组织COX-2蛋白表达量高于正常组和实验组的肝脏组织中的COX-2蛋白表量,差异分别具有统计学意义(P<0.05),正常组和实验组的肝脏组织的COX-2蛋白表达量无差异;建模组的肝组织的PTEN和PDCD4蛋白表达量低于正常组和实验组,差异有统计学意义(P<0.05),而正常组和实验组的肝组织PTEN和PDCD4蛋白表达量无差异。结论:1.COX-2抑制剂Celecoxib可预防DEN诱导的SD大鼠肝癌的发生2.COX-2抑制剂Celecoxib预防肝癌的发生可能是通过上调PTEN和PDCD4的表达发生作用。
赵刚[8]2008年在《益气活血化瘀法对大鼠肝癌前病变Fas/Fasl的影响》文中提出目的:研究益气活血化瘀法对肝癌前病变Fas Fasl蛋白及肝脏病理组织学的影响,探索肝癌的中医药防治方法。方法:体重80g～100g雄性Wistar大鼠160只,分为正常组、模型组、中药组,中药组又分YHH(Yiqi Huoxue Huayu)Ⅰ组和YHHⅡ,每组各40只。模型组、YHHⅠ组和YHHⅡ组用化学试剂DEN(diethylnitrosamine)进行诱癌,造模进行16周。YHHⅠ组YHHⅡ组同时灌服中药16周。分别于喂养的4、8、12、16周时相点,每组各取9只大鼠处死,剖腹取肝:①光镜下观察细胞形态学改变②通过酶联免疫法检测Fas/Fasl。结果:与正常组相比,每个时象点模型组大鼠肝脏组织Fas/Fasl表达明显高于正常组(P＜0.01),肝脏组织病变明显。与正常组相比,每个时象点不同治疗组的肝脏Fas/Fasl表达总体升高;与模型组对比,不同治疗组的肝脏Fas/Fasl表达变化趋势总体一致,第4、8周差异性不明显,第12、16周Fas下降趋势减缓,Fasl升高趋势减缓,肝脏病理组织学改变明显,YHHⅠ、YHHⅡ组与模型组比较差异显着(p＜0.01);YHHⅠ组与YHHⅡ组比较有差异(p＜0.05)。结论:Fas/Fasl与肝癌的发生密切相关,益气活血化瘀法通过促进肝脏组织Fas的表达和抑制Fasl的表达,从而减缓肝癌的形成,这可能是益气活血化瘀法有效防治肝癌作用机制之一。
赵金明[9]2003年在《藻毒素与自来水有机提取物致癌作用实验研究》文中指出研究背景：常规饮水氯化消毒技术并不能完全有效的消除水体中的藻毒素，而氯化消毒过程中还会产生具有致突变活性的氯化消毒副产物，使氯化消毒副产物与藻毒素在饮水中共存并产生潜在联合作用。目的：研究藻毒素与自来水有机提取物在肿瘤发生过程中的联合作用，并探讨其可能的作用机制。方法：从水体中收集藻毒素和有机提取物样品，在对样品进行化学成份分析的基础上，研究藻毒素在体外条件下对V79(HPRT+/HPRT-)细胞间代谢协同作用和SHE细胞周期及相关基因表达的影响，并运用Ames实验、微核实验、程序外DNA合成试验和V79细胞HPRT基因正向突变实验等配套的致突变筛选实验，对自来水有机提取物进行致突变性检测。在运用SHE细胞体外转化实验研究藻毒素和自来水有机提取物对细胞转化作用的同时，以自来水有机提取物为启动剂，藻毒素为促进剂，构建大鼠肝肿瘤促进模型。收集肝脏标本，进行常规病理形态学检查和分析，同时运用核酸原位杂交、RT-PCR、免疫组化和Western-blot等方法检测肿瘤发生发展过程中肝细胞p-ELK-1、c-fos、 c-jun和GSTPi等基因表达活性的改变，用凝胶移动试验检测肝细胞核蛋白/GEPI、AP-1/DNA结合能力，并对其相互关系进行比较和分析。结果：藻毒素具有极强的急性毒性作用，LD50为106.7mg/kg（89.1~127.6 mg/kg,干藻细胞/体重），肝脏是其主要的靶器官。在体外培养条件下，藻毒素能够抑制V79(HPRT+/HPRT-)细胞间代谢协同作用，并能诱导SHE细胞c-fos和c-jun表达升高，促进细胞增殖。自来水有机提取物具有一定的致突变性，能诱导SHE细胞恶性转化。藻毒素单独作用不能诱导SHE细胞转化，但能促进自来水有机提取物诱导的细胞转化。在实验性大鼠肝癌促进模型研究中，藻毒素和自来水有机提取物共同作用可以诱导动物产生肝细胞增生灶和增生结节。藻毒素单独作用即可以诱导pELK-1、c-fos和c-jun表达升高，使肝细胞核蛋白/GEPI、AP-1/DNA结合能力增强，而相同剂量的藻毒素作用于经自来水有机提取物启动的动物后，其肝细胞p-ELK-1、c-fos和c-jun的表达以及肝细胞核蛋白/GEPI、AP-1/DNA结合能力均较非启动组明显增加（p<0.05）。同时，一次<WP=6>启动剂量的自来水有机提取物单独作用即能显着诱导肝细胞GSTPi基因表达，藻毒素单独作用不能诱导GSTPi基因表达，但能够促进自来水有机提取物诱导产生的GSTPi基因表达，使其较自来水有机提取物单独作用组显着增加（p<0.05）。结论：1. 藻毒素能通过抑制细胞间隙通讯功能和影响MAPK信号通路而促进细胞增殖；2. 藻毒素具有促进实验性大鼠肝癌发生的作用；3. 自来水有机提取物具有致癌启动活性，能诱导实验性大鼠肝癌的发生；4. 藻毒素和自来水有机提取物在实验性大鼠肝癌诱导过程中具有联合作用；5. 藻毒素和自来水有机提取物可能的联合作用机制是：自来水有机提取物作用于细胞后，使细胞实现启动作用而呈自主生长倾向，而藻毒素可通过影响细胞MAPK 信号旁路而促进癌变启动细胞持续分裂，并因此而不断积累恶性转化所需的各个水平的遗传改变，最后恶性转化成癌。
胡志坚[10]2009年在《微囊藻毒素毒性及其致癌机制》文中指出目的:探讨微囊藻毒素与人体健康的关系,深入研究微囊藻毒素毒作用的机制,检测微囊藻毒素的抗TMV活性。方法:(1)在福清市和永泰县部分乡镇进行2002～2005年回顾性以恶性肿瘤为主的死因调查,对其水体微囊藻毒素污染和其它污染物含量进行检测,分析恶性肿瘤死亡率和水体微囊藻毒素污染间关系。同时采用病例对照研究,收集福州市各大医院肝癌确诊的新发病例,并选择与病例在性别、年龄、民族和居住地相匹配的同期入院的非肿瘤患者为对照。采用统一编制的调查表进行问卷调查。采用PCR-RFLP法对调查对象的血标本进行XRCC3、ERCC1基因多态检测。采用广义线性模型分析饮水类型与其它环境因素、与基因多态性在肝癌发生中的交互作用。(2)按照两阶段致癌理论建立微囊藻毒素促癌实验动物模型,利用HE染色、γ-GT染色来判断动物模型建立情况,并应用免疫组化、RT-PCR、PCR-SSCP、分子克隆、基因测序等技术来研究微囊藻毒素促癌过程中对癌基因和抑癌基因表达与调控影响。(3)采用叶碟法对微囊藻纯毒素(MC-LR)抑制TMV复制活性进行测定。结果:(1)福清与永泰水体中微囊藻毒素阳性检出率为28.4%。沟塘水微囊藻毒素阳性率最高为41.7%,不同水体类型的阳性率从高到低的顺序为:沟塘水>河水>自来水>井水,且差别有统计学意义(P<0.05);福清微囊藻毒素检测阳性率为46.5%,显着高于永泰的阳性率11.1%;福清恶性肿瘤的标化死亡率是永泰的2倍,其中肝癌、胃癌、食管癌、肠癌、肺癌、膀胱癌标化死亡率福清均高于永泰。(2)饮沟塘水、肝炎病毒感染、食用霉变食物是福州地区肝癌发生的危险因素。饮沟塘水与其他因素间存在交互作用。饮沟塘水与肝炎病毒感染之间交互作用为超相加模型,与食用霉变食物之间交互作用为超相乘模型,叁个环境因素交互作用为超相加模型。ERCC1基因8092位点突变能增加患肝癌的危险度,与饮沟塘水的交互作用为次相乘模型,说明遗传因素与环境因素间存在交互作用,基因突变会增加个体对环境暴露的易感性。(3)微囊藻毒素LR(MCLR)在促大鼠肝癌过程中能增加γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)阳性率,二乙基亚硝胺(DEN)+微囊藻纯毒素(MC)组γ-GT染色的阳性率为100%,而DEN对照组的阳性率22.22%,两者差别有统计学意义(P<0.05)。MCLR可提高反映染色体损伤畸变情况的指标-微核率。DEN+MC组微核率为13‰,显着高于其他各组(P<0.05)。(4)MCLR在促大鼠肝癌过程中能增加大鼠肝脏BCL-2、PCNA基因蛋白表达强度,同时降低大鼠肝脏Bax、p21WAF1基因蛋白表达强度。Bcl-2与PCNA蛋白表达强度在DEN+MC组分别为0.0377和0.0088,显着高于表达强度分别为0.0205和0.0033的DEN对照组(P<0.05);Bax与p21WAF1蛋白表达强度在DEN+MC组分别为0.0073和0.0058,显着低于表达强度为0.0244和0.034的DEN对照组(P<0.05)。(5)MCLR在促大鼠肝癌过程中能显着增加大鼠肝脏Bcl-2和p53mRNA表达强度。这两种基因在DEN+MC组表达强度分别为2.244和2.5719,显着高于其他各组(P<0.05)。而Bax、p21WAF1、p16的mRNA表达强度各组间差别无统计学意义(P>0.05)。(6)微囊藻毒素可引起p53基因突变,本次实验在DEN+MC组筛查出4例突变阳性者,该组突变率为26.6%(4/15)。测序结果显示:突变分别位于密码子268(TTT→CTT)3例,编码的氨基酸由苯丙氨酸(Phe)→亮氨酸(Leu);位于密码子283(GAG→GAA)1例,但编码的氨基酸没有改变。Bax基因未筛查到突变。(7)微囊藻毒素对TMV抑制作用不强,最大抑制率只为46.03%,且抑制作用不随浓度增加而加强。结论:(1)水体富营养化引起水体藻类毒素污染可能与福清高恶性肿瘤死亡率有关。(2)饮沟塘水是福州地区肝癌发生的危险因素。饮沟塘水与其他因素间存在交互作用。(3)微囊藻毒素对肝癌的发生具有强的促进作用。微囊藻毒素可在基因水平、转录水平、翻译水平以及翻译后水平影响癌基因与抑癌基因的表达,而且在促癌过程中微囊藻毒素对不同的基因调控机制影响有所不同,最终达到蛋白表达的影响,促进肝癌的发生。所以调节与细胞增殖和凋亡相关的癌基因和抑癌基因表达是MCLR促癌过程的重要机制。(4)微囊藻毒素TMV抑制作用不强。
参考文献：
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[4]. 松果菊苷对大鼠肝癌细胞GJIC影响的研究[D]. 刘向国. 广州中医药大学. 2008
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[7]. 塞来昔布对二乙基亚硝胺诱导的SD大鼠肝癌预防作用研究[D]. 齐亚鹏. 广西医科大学. 2017
[8]. 益气活血化瘀法对大鼠肝癌前病变Fas/Fasl的影响[D]. 赵刚. 黑龙江中医药大学. 2008
[9]. 藻毒素与自来水有机提取物致癌作用实验研究[D]. 赵金明. 复旦大学. 2003
[10]. 微囊藻毒素毒性及其致癌机制[D]. 胡志坚. 福建农林大学. 2009
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