王勇德[1]2004年在《抗人大肠杆菌免疫鸡蛋黄抗体的研究》文中认为高免蛋黄抗体具有生产过程简单、效率高等特点，已越来越多地应用于人类许多疾病的预防和治疗以及生物学的高度特异性检测等领域中，并取得显着成效。本文主要研究了以人致病性大肠杆菌为抗原，免疫母鸡，研究获得含有高效价蛋黄抗体的鸡蛋的最佳条件；建立快速、准确、定量的酶联免疫吸附试验(ELISA)测定蛋黄抗体(IgY)效价的技术；研究抗人大肠杆菌IgY分离纯化条件及其理化、生化特性；研究食品加工过程中的各种因素对大肠杆菌特异IgY生物活性的影响；探讨抗人大肠杆菌免疫鸡蛋抗体的功能及其机理；评估蛋黄抗体的安全性。主要获得如下结果： (1) 对获得含有高效价蛋黄抗体的鸡蛋的最佳条件研究发现： (a) 以大肠杆菌悬浮液对20周龄京白蛋鸡免疫时，若固定免疫抗原剂量为0.5ml，则当菌液浓度低于1×10~9 cfu／ml，免疫应答强度随免疫剂量的降低而降低，当菌液浓度高于1×10~9 cfu／ml时，免疫应答强度不会随免疫剂量的增加而得到明显加强。因此，确定最佳免疫剂量为每次0.5ml菌液浓度为1×10~9 cfu／ml的大肠杆菌悬浮液。 (b) 在大肠杆菌悬液中添加等量的福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂和白油佐剂能明显加强免疫应答强度，其中福氏完全佐剂对免疫应答加强的程度最高。 (c) 胸部皮下注射、翅下皮下注射、大腿皮下注射、颈背皮下注射、胸部肌肉注射、翅下肌肉注射、大腿肌肉注射和颈背肌肉注射8种不同免疫途径对免疫应答反应强度没有明显影响。 (d) 强化免疫程序能大大加强产蛋母鸡的免疫应答强度，其中初免后，每隔1周强化免疫一次，连续4次，此后每1月仅用佐剂抗原强化免疫1次的强化免疫程序既经济又有效。 (2) 采取热酚法提取E.coli LPS作为抗原，以酶标记的兔抗鸡IgY抗抗体(IgG)为二抗建立起来的间接ELISA技术检测特异蛋黄抗体IgY的抗体效价，以酶标二抗工作浓度为1：2000，LPS抗原包被浓度为1：20(10ug／ml)，可以检测到鸡特异IgY抗体效价为1：10240。用猪源EHEC和人源沙门氏菌的LPS抗原进行了交叉检测，表现出高度的特异性。 (3) 通过对蛋黄抗体(IgY)的分离纯化条件研究发现，乙醇沉淀抗体的最佳条件是粗提液：乙醇(V／V)为1：0.35；经DEAE-Sephrose fast-flow离子交换层析和Sephacryl S-200凝胶排阻层析连续纯化后可得到电泳纯的抗人大肠杆菌IgY，其MW为186400Da(电泳法)或186500Da(凝胶过滤法)，该抗体由两个亚基构成，分子质量分别为65900Da和24600Da，其等电点为5.5。 (4) 通过稳定性研究发现： (a) 抗人大肠杆菌IgY抗体在高温下(≥75℃)容易发生热变性，其热变性的反应级数为1.5，其热变性温度点为75.0℃。西南农业大学博l:学位论文 (b)抗人大肠杆菌抗体在酸性环境容易发生变性，而在中性和弱碱性环境中能较好的保持稳定，其主要变性发生在pH2.5一3.0。 (c)胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对抗人大肠杆菌抗体的活性保持均有不利的作用，但发现，经上述3种消化道蛋白质水解酶部分作用后形成的抗体水解物仍具有一定的抗体活性。进一步研究确定，在灌胃后lh内，小肠内抗体活性基本保持在最高水平，而在Zh之后，抗体活性大幅度下降，在灌胃后16h已经下降到了非常低的水平。 (d)将抗人大肠杆菌抗体贮存在O℃和4℃是比较合适的，若贮存在25℃以上的温度下，抗体活性损失随贮存期的延长而不断下降。 (e)加热处理、蛋白酶处理以及冷冻干燥处理对抗体的活性都有不利的影响，但一定浓度的乳糖、环糊精和糊精能加强抗体对热处理和蛋白酶处理的稳定性，而环糊精、乳糖、糊精、果糖、葡萄糖、甘氨酸和甘油都能不同程度的加强抗体在冷冻干燥过程中的稳定性。 (5)通过对抗人大肠杆菌免疫蛋黄抗体的功能及其机理探讨发现，抗人人肠杆菌卵黄抗体浓度大于sm留ml，可对大肠杆菌有明显的体外抑菌作用;抗人大肠杆菌IgY对大肠杆菌诱导的乳鼠肠道感染具有显着的预防和治疗作用;抗人大肠杆菌卵黄抗体可抑制大肠杆菌对肠上皮细胞粘附作用，随着大肠杆菌浓度的不断升高，粘附率不断增加，上皮细胞浓度的增加能提高ETEC对其的粘附率。 (6)研究发现，4.0 kGy的“。c。丫射线可使蛋中可能污染的微生物全部灭活，而不影响抗体活性;鸡抗人大肠杆菌抗体对临床检查、血液学、生化学、器官重量、系数及组织病理学等指标无明显影响，证明鸡蛋黄抗体IgY无急、‘漫性毒副作用:通过骨髓嗜染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验及Ames试验，结果证明鸡抗人大肠杆菌抗体无细胞毒，无致突变作用。关键词:蛋黄抗体制备分离提纯稳定性功能食品
刘海生[2]2009年在《抗仔猪大肠杆菌病高免卵黄抗体粉的研制》文中指出仔猪大肠杆菌病是目前危害我国养猪业的主要传染病之一,它是由产肠毒素大肠杆菌(ETEC)引起的一种急性传染病,以急性腹泻和败血症为特征,在临床上可表现为白痢、黄痢和猪水肿病。本试验采取陕西西安、咸阳、渭南、宝鸡、榆林、汉中等地区规模化养猪厂中发生大肠杆菌病仔猪的新鲜粪便、小肠内容物、肠道等病料,通过分离纯化和生化鉴定为大肠杆菌,再进行O抗原的鉴定。试验共分离菌株294株,定型257株,血清型共计35种,其中O8、O9、O20、O45、O101、O138、O139、O141、O147、O149等10种血清型共有185株,占分离株的72%,为分离猪场中的主要流行血清型。选取试验中分离得到大肠杆菌,增菌培养,制成大肠杆菌油佐剂灭活疫苗免疫非免大肠杆菌疫苗的健康蛋鸡,用微量凝集试验检测蛋鸡血清和鸡蛋中K88、K99、987P、F41抗体水平,检测抗体变化规律并检测血清抗体和卵黄抗体二者之间的关系与变化趋势。当血清抗体水平达8log2以上时收取鸡蛋,分离卵黄,用喷雾干燥机在140℃进气72℃出气,喷雾干燥成粉。然后检测加工前后卵黄抗体水平的变化,将制备的卵黄抗体粉分低温(4℃)和室温(25℃)保存,检测保存条件对卵黄抗体效价的影响。试验结果表明:K88、K99、987P、F41蛋鸡血清和鸡蛋中卵黄抗体均在免疫之后7d开始出现,并在35d到达高峰,血清抗体和卵黄抗体二者之间的变化规律和变化趋势基本相同。卵黄抗体加工前后效价变化不大,卵黄抗体粉在4℃和25℃条件下密封保存6个月,卵黄抗体效价无明显变化,均适合卵黄抗体粉的保存。选择未经过大肠杆菌疫苗免疫母猪的新生健康仔猪50头分5组,其中四组按1g/头、2g/头、3g/头、4g/头每天饲喂,一组为对照组,进行预防试验。选择未经过大肠杆菌疫苗免疫母猪的新生健康仔猪10头分两组,利用高免卵黄抗体粉进行攻毒治疗试验。试验结果表明,2g/头以上剂量饲喂制备的高免卵黄抗体粉能有效预防仔猪大肠杆菌病,高免卵黄抗体粉对人工感染病例治愈率为90%。
王勇德, 李航, 赵国华, 陈宗道[3]2005年在《抗人大肠杆菌蛋黄抗体的分离纯化及理化性质研究》文中研究指明以人源大肠杆菌(ATCC23985)免疫产蛋母鸡所产免疫蛋为原料，通过蛋黄水提物制备、乙醇分级沉淀、离子交换色谱和凝胶排阻色谱对其中的免疫蛋黄抗体进行了分离纯化，并对其基本理化性质进行了分析。结果表明：蒸馏水-氯仿法是制备蛋黄水提物的最优方法，而35％的乙醇添加量能够很好地将水提物中的抗体沉淀出来。经DEAE-Sepharose柱和SephacrylS-200柱连续纯化的抗体在电泳检测时只有1个区带。研究获得的抗人大肠杆菌卵黄抗体的等电点为5.5，包含分子质量分别为65900u和24600u的2类亚基。该抗体的氨基酸组成与普通蛋黄抗体的氨基酸组成差异不大。
参考文献：
[1]. 抗人大肠杆菌免疫鸡蛋黄抗体的研究[D]. 王勇德. 西南农业大学. 2004
[2]. 抗仔猪大肠杆菌病高免卵黄抗体粉的研制[D]. 刘海生. 西北农林科技大学. 2009
[3]. 抗人大肠杆菌蛋黄抗体的分离纯化及理化性质研究[J]. 王勇德, 李航, 赵国华, 陈宗道. 食品与发酵工业. 2005