时步卿 (赣榆县人民医院检验科 222100)
【中图分类号】R446 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2013）35-0360-02
目前测定脑脊液、尿液的微量蛋白质（主要是白蛋白的方法甚多），本文应用氨基黑10B结合沉淀法测定微量白蛋白，取得了较为满意的效果，现报告如下：
1、基本原理
蛋白质分子在PH<PI的溶液中显正电性，与呈负电性的氨基黑10B结合，使维持蛋白自身结构及分子与介质的稳定性因素改变而沉淀析出[3]。在一定的范围内溶液的蛋白含量与结合其沉的氨基黑10B量成正比例，经用同样的处理的已知浓度的蛋白标准液比较，求出蛋白的含量。
2、试剂与方法
2.1 氨基黑液：称取氨基黑10B 80mg于1L 容量瓶中，用蒸馏水溶解，加1molHCL溶液约12ml调正PH值至1.95，再加水至刻度，混合后放入冰箱保存。
2.2 硫酸铜溶液（0.004%）：称取纯CuSO4?5H2O 40mg溶于1L生理盐水即成。
2.3 1mol/L NaOH溶液。
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3、测定方法
3.1 总蛋白标准曲线见表
编号 1 2 3 4 5
3%血清用量(?l) 1 2 3 4 5
试剂 ml 3 3 3 3 3
相当蛋白含量 （g/ml） 2 4 6 8 10
3.2 白蛋白曲线：以人血清白蛋白液代替混合血清，操作方法同总蛋白曲线。
3.3 总蛋白的测定：
吸取血清1.5?l于小试管中，加入氨基黑10B试剂3ml，混匀5次，置37℃水溶15分钟4000转10分钟，上清液比色，以试剂光密度减去上清液光密度之差，查标准曲线，即得总蛋白g/dl。亦可在倾倒上清液时，随手将试管倒立于滤纸上，沥去管壁液体后用0.1mol/L NaOH 3ml溶解沉淀，混匀比色，计算OD值直接查标准曲线得总蛋白g/dl（比色条件：0.1 mol/L NaOH调零点，721比色，波长620nm,0.5cm光经比色皿。）
3.4 总蛋白，A/G比值测定
吸取血清4?l于试管内，加0.004%硫酸铜盐水0.4ml，混匀后吸取悬液0.15ml于“T”管，剩余悬液置37℃水溶6分钟，取出离心4000转10分钟，取上清液0.15ml于“A”管，两管各加氨基黑10B3ml，以下操作同总蛋白的测定，比色OD分别查下A曲线，即得总蛋白及白蛋白g/dl。
4、结果
4.1 方法稳定性试验：用同一份血清，一人操作，按方法测总蛋白10次，结果为6.2±0.28（范围为5.92～6.48）CV为3.3%。按方法2测定白蛋白10次，结果为：3.8±0.31，范围为3.49～4.11.CV为3.6%。
4.2 对比试验：本法与常规双缩脲法比较，共测总蛋白20份，白蛋白20份，结果：双缩脲法总蛋白为6.84±1.72，本法：6.72±1.64，两种方法的相关系数为0.97。白蛋白双缩脲法为3.82±1.78，本法为3.78±1.92，两法相关系数为0.98。
5、本法的影响因素
5.1 试剂的PH：
用PH2.6～6.0的强酸缓冲液系统，分别配制成0.008%氨基黑10B试剂，用同一份血清，每管1.5?l吸不同PH的试剂3ml,按总蛋白方法操作，结果在PH4.8时开始出现沉淀，PH继续降低，沉淀增多。在PH2.6时尚不能沉淀完全。改配0.008%氨基黑10B水液，用1mol/l调节至PH2.0时，蛋白含量在10%以内的血清1.5?l可被3ml试剂完全沉淀，继续放置37℃30分钟后离心不出现沉淀。沉淀物用0.01mol/L NaOH溶液20?l使蛋白与染料介离后作脂纤膜电泳，血清蛋白组分可再出现出来。
5.2 氨基黑10B浓度，配制成浓度为0.004%,0.005%,0.006%和0.007%,0.008%5种氨基黑10B试剂，用0.01mol/l HCL调正PH至2.0。每种试剂浓度分别用蛋白含量2，4，6，8，10g/dl按总蛋白测定法进行测定，结果氨基黑10B浓度低于0.005%的试剂，蛋白含量超过8g/dl时，线性较差，经实验研究，浓度在0.007%～0.008%时线性良好，且OD值均为0.40～0.60之间，适合于比色法进行测定。
5.3 试剂的回收：以试剂OD为100%，结合蛋白后的沉淀物“D”和上清液“C”OD之和为回收值。经测定4份蛋白含量不同的血清，每份取10管平均值，结果回收率为99.0%～101.8%。以上结果证明，氨基黑与蛋白结合沉淀并介离后，反应后损失很少，回收率接近100%。
5.4 关于正常值。本法测定结果与双缩脉法基本一致，可参考双缩脉法正常值，应用本法测定10份血清，结果为总蛋白6.7±1.1/dl，白蛋白4.3±1.5/dl。
参考文献
[1] Hiratsuka N. shiba.Nishide K.etal.Analgis of urimary albumin transferrim.N-A-acetybcbeta-D-glucosaminidase and heta2-microglobulim in patients with impaired glucose tolerance.J Clin lab anal.1998,12(6):351
[2] 王宏煜，蒋福才，B2-mRIA对肾&××诊断意义分析。放射免疫学杂志 2001.14(1):38
[3] 生理生化学教研组编写《生理生化学》第一版.1974.湖南人民出版社。P16
[4] 潘家秀主编《蛋白质化学分析技术》第一版。科学技术出版社（上册）。1978.P75
[5] 刘思职《生物化学大纲》第2版。人民卫生出版社。1958.P22
论文作者:时步卿
论文发表刊物:《医药前沿》2013年第35期供稿
论文发表时间:2014-3-6
标签：蛋白论文; 氨基论文; 血清论文; 试剂论文; 白蛋白论文; 比色论文; 溶液论文; 《医药前沿》2013年第35期供稿论文;