黄莹[1]2016年在《基于iRGD肽的融合蛋白的构建及其靶向抗肿瘤作用的研究》文中研究指明第一部分KLA-iRGD融合蛋白的构建及穿透性、靶向抗肿瘤作用的研究[目的]研究KLA-iRGD融合蛋白对胃癌细胞凋亡的影响,体内治疗胃癌MKN45皮下瘤模型,观察其抑瘤活性以及对肿瘤组织的靶向穿透作用。[方法]运用MTT和流式细胞仪检测KLA-iRGD融合蛋白对胃癌细胞株凋亡的影响;建立胃癌细胞株mKN45皮下瘤模型,腹腔注射KLA-iRGD融合蛋白治疗;免疫荧光方法检测融合蛋白在肿瘤组织的分布及肿瘤组织细胞凋亡情况;检测其他器官细胞凋亡情况。[结果]KLA-iRGD融合蛋白对胃癌细胞呈现明显的促凋亡作用;在胃癌细胞MKN45皮下瘤模型中,KLA-iRGD融合蛋白经尾静脉注射后呈现明显的靶向性及穿透性,同时表现出明显的抗肿瘤作用,KLA-iRGD融合蛋白治疗组与对照组相比肿瘤直径存在显着性差异。[结论]KLA-iRGD融合蛋白对胃癌MKN45肿瘤细胞具有明显的促凋亡作用,且其在体内也有明显靶向抗肿瘤作用,体内可抑制肿瘤生长,且对其他器官没有明显影响。第二部分sTRAIL-iRGD融合蛋白的表达纯化及靶向抗肿瘤作用的研究[目的]利用原核表达系统表达纯化sTRAIL-iRGD融合蛋白,研究其对胃癌细胞凋亡的影响,体内治疗胃癌MKN45皮下瘤模型,观察其抑瘤活性以及对肿瘤组织的靶向穿透作用。[方法]使用原核表达技术表达纯化蛋白;使用考马斯亮蓝染色以及Western Blot法测定相应蛋白的表达量;使用流式细胞仪以及MTT法测定相应蛋白作用于胃癌细胞株凋亡的影响;建立胃癌细胞株MKN45皮下瘤模型,腹腔注射sTRAIL-iRGD融合蛋白治疗;使用免疫荧光方法测定蛋白在肿瘤组织内的分布情况以及肿瘤组织的凋亡。[结果]sTRAIL-iRGD融合蛋白在细胞内、叁维细胞培养模型及肿瘤组织内呈现明显的抗肿瘤作用;在胃癌细胞MKN45皮下瘤模型中,sTRAIL-iRGD融合蛋白经尾静脉注射后呈现明显的靶向性及穿透性,同时表现出明显的抗肿瘤作用,sTRAIL-iRGD融合蛋白治疗组与对照组相比肿瘤直径存在显着性差异。[结论]融合蛋白sTRAIL-iRGD可以通过原核表达系统来表达纯化,融合蛋白sTRAIL-iRGD可明显促进胃癌细胞的凋亡,并且其在机体内具有明显的靶向作用,其可有效抑制肿瘤细胞的生长,且不作用于其他组织器官。
刘佳[2]2014年在《两种天然产物抗肿瘤作用的分子机制》文中研究指明本文研究了两种天然产物的抗肿瘤作用。首先研究了齐墩果酸的抗肿瘤作用。齐墩果酸具有广泛的生物活性，我们前期的研究表明，齐墩果酸可以通过促进细胞凋亡诱导肿瘤细胞凋亡，但其作用的分子靶点尚不清楚。近几年人们对肿瘤的发生机制有了新的认识，有氧糖酵解是肿瘤细胞的一大特点（又称为Warburg效应），对于肿瘤细胞的快速增殖非常重要。M型丙酮酸激酶的2型剪切体（PKM2）是诱导和维持有氧糖酵解的关键代谢酶，而且越来越多的证据表明PKM2是一个潜在的肿瘤治疗靶点。本研究利用多种肿瘤细胞系，检测齐墩果酸对肿瘤细胞代谢的影响。结果显示齐墩果酸能够抑制肿瘤细胞的有氧糖酵解（葡萄糖吸收率下降29.1%-30%，乳酸产量下降16.2%-28.3%，氧气消耗率上升17.8%-54.5%）。代谢关键酶PKM在齐墩果酸的作用下由2型剪切体向1型转变。进一步的研究又发现，齐墩果酸对肿瘤代谢的影响是通过对mTOR/c-Myc/hnRNPA1/hnPNPA2/PKM通路的作用实现。本文还对海洋天然产物海兔素与TRAIL协同抑制肿瘤生长的分子机制进行了研究。通过多株肿瘤细胞系得到的实验数据表明，海兔素能够通过对p38MAPK/survivin通路的影响提高TRAIL对肿瘤细胞的杀伤能力（提升2.58-6.15倍）。综上所述，本研究证明齐墩果酸可以通过减少PKM2的表达量抑制肿瘤的有氧糖酵解，肯定了PKM2是一个有效的肿瘤治疗靶点；海兔素能够增强肿瘤耐药细胞对TRAIL的敏感性。
刘念礼[3]2015年在《肝癌细胞对TRAIL固有耐药和获得性耐药的分子机制研究》文中研究说明肝癌是世界上最常见并且致死率最高的肿瘤之一。目前针对肝癌的治疗方法有手术切除、放疗和化疗等,但是这些治疗方法疗效有限,因此迫切需要开发新型的抗肝癌药物。TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand,人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)对多种对传统疗法耐受的肿瘤展现出潜在抑制作用,并且副作用小。TRAIL与其特异性受体DR4和DR5结合后诱导受体寡聚化同时促进死亡诱导复合体的形成,进而激活起始半胱天冬酶Caspase-8 。在Ⅰ类细胞中,凋亡受体激活Caspase-8后产生足够强的信号刺激Caspase-3活化进而诱导细胞凋亡。相反,在Ⅱ类细胞中,Caspase-8活化不足以直接激活Caspase-3 。活化的Caspase-8通过切割Bid蛋白进而诱导Bax蛋白活化,增加线粒体膜的通透性。促凋亡蛋白如cytochrome c、 Smac和DIABLO等从线粒体内释放出来后进而激活Caspase-9和Caspase-3 。一些针对TRAIL及其受体的新型药物已经进入了临床试验,但是肿瘤细胞对TRAIL的耐药性阻碍了这些药剂成为真正的抗肿瘤药物。尽管一些肿瘤细胞对TRAIL展现出敏感性,但是在TRAIL长期处理后显示出耐药性(获得性耐药)。因此,研究肿瘤细胞对TRAIL的先天和获得性耐药机制,发现对肿瘤细胞耐药起关键作用的分子并对其进行干预,对提高TRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用具有重要意义。干扰素通过调节下游ISGs (IFN-stimulated genes,干扰素刺激基因)表达来行使其生物学功能,研究表明干扰素通路紊乱会诱导ISGs过表达导致肿瘤发生和肿瘤耐药。干扰素通过刺激细胞产生TRAIL或Fas等凋亡配体,进而激活下游外部或内部线粒体依赖的凋亡通路而诱导细胞凋亡。在干扰素诱导线粒体依赖的细胞凋亡过程中,参与破坏线粒体膜通透性促进细胞色素释放的多种蛋白被仍是未知的。干扰素调控的一些功能尚未完全明确的一些小分子蛋白包括ISG12a (The interferon alpha-inducible protein 27, IFI27)、G1P3、IFITM3、IFITM2 等。尽管ISG12a的表达调控已有一些研究,但是关于其生物学功能的研究还不多。目前一些研究结果表明ISG12a定位于线粒体上,对药物诱导的细胞凋亡有调控作用,但是其在肝细胞中的表达情况报道较少,且目前尚无关于其调控TRAIL诱导细胞凋亡的相关报道。在本论文中,我们以ISG12a为研究对象,检测其在肝脏组织及多种肝癌细胞系内的表达情况,并探讨其在TRAIL诱导肝癌细胞凋亡过程中的作用。为了研究肝癌细胞对TRAIL的固有耐药机制,我们以TRAIL处理不同的肝癌细胞系后,利用western blot、流式细胞术、DNA琼脂糖电泳等方式检测细胞凋亡,结果显示Huh7和HLCZ01细胞对TRAIL耐药,LH86和HLCZ02细胞对TRAIL敏感。我们的研究结果表明TRAIL通过刺激cytochrome c的释放并激活caspase-9诱导肿瘤细胞凋亡,流式分析结果表明caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK可抑制TRAIL诱导的肝癌细胞凋亡。通过实时定量PCR技术分析,我们发现干扰素刺激基因ISG12a在敏感细胞中表达高于耐药细胞。在耐药细胞中过表达ISG12a可增强TRAIL诱导的细胞凋亡,相反,在敏感细胞中沉默ISG12a则抑制TRAIL诱导的细胞凋亡。为了验证ISG12a在体内介导TRAIL诱导肝癌细胞凋亡的作用,我们将过表达ISG12a的Huh7细胞和沉默ISG12a的LH86细胞注射入免疫缺陷鼠皮下成瘤,然后通过尾静脉给小鼠注射TRAIL,观察肿瘤体积变化。结果表明过表达ISG12a的Huh7细胞TRAIL处理后成瘤体积小于对照细胞,沉默ISG12a的LH86细胞TRAIL处理后肿瘤体积则大于对照细胞。通过Targets can预测分析,ISG12a可能是miR-942的靶基因。通过双荧光素酶报告和western blot实验,我们证实miR-942通过调控ISG12a 3'UTR抑制其蛋白表达。同时,我们发现miR-942与ISG12a在肿瘤细胞系和肿瘤组织中存在负相关性。进一步研究发现Akt通过促进miR-942表达,抑制ISG12a的表达,进而影响肝癌细胞对TRAIL的敏感性。为了研究肝癌细胞对TRAIL的获得性耐药机制,我们利用对TRAIL敏感的LH86细胞进行长期TRAIL处理,筛选得到耐药株细胞,命名为LH86-TR。我们发现Akt活性在耐药株细胞中降低,利用Akt特异性抑制剂无法逆转细胞的耐药性,表明Akt对LH86对TRAIL的获得性耐药没有影响。通过对多种细胞多能性因子的定量PCR检测,我们发现Msil基因在耐药株细胞中表达升高,western结果进一步证实Msil在耐药细胞中表达高于敏感细胞。过表达Msil在体内和体外试验中均抑制肝癌细胞对TRAIL的敏感性。沉默Msil可逆转耐药细胞对TRAIL的敏感性。进一步研究发现Msil可激活ERK,在获得性耐药细胞中抑制ERK活性可以逆转肝癌细胞对TRAIL的耐药性。因此,这些结果表明Msi1可调节肝癌细胞对TRAIL的获得性耐药。
李小安[4]2002年在《TRAIL抗肿瘤作用的研究》文中提出TRAIL是TNF家族的新成员，其基因是Wiley等于1995年发现的。TRAIL能与5种受体结合，即TRAIL-R1／DR4，TRAIL-R2／DR5，TRAIL-R3／DcR1，TRAIL-R4／DcR2和OPG。其与DR4、DR5结合可以诱导细胞凋亡，但与DcR1、DcR2和OPG结合不能诱导细胞凋亡。实验证实TRAIL对来源于几乎所有系统恶性肿瘤的大部分细胞系均有杀伤作用，而对正常细胞并无杀伤作用，这一特性有可能使其成为新型的抗肿瘤药物。但并非所有的肿瘤细胞都对TRAIL都敏感，也存在耐药性问题。因此如何改变TRAIL的耐药现象，探索提高其敏感性的方法已成为当前的重要研究课题。 本课题利用大肠杆菌表达蛋白，在成功地分离纯化和鉴定TRAIL蛋白的基础上，我们研究了TRAIL对结肠癌细胞系SW480和肝癌细胞系SMMC-7721的作用；5-Fu与TRAIL联合应用对结肠癌细胞系SW480的作用；阿司匹林与TRAIL联合应用对肝癌细胞系SMMC-7721的作用，并从阿司匹林影响Bc1-2家族蛋白表达角度阐明二者产生协同作用的机理；肝癌SMMC-7721细胞转入反义DNMT1基因片段后对TRAIL敏感性的改变，并从Bc1-2家族蛋白表达改变的角度阐明其机理。上述研究采用的方法与结果如下： 1)SDS-PAGE结果表明，我们所提的蛋白分子量约20.1KDa，Western blot证实该蛋白为TRAIL。 2)MTT法和TUNEL法表明TRAIL对结肠癌SW480细胞有较好的杀伤作用，呈现典型的量效和时效关系。TRAIL对肝癌SMMC-7721细胞也有类似作用。5-Fu与TRAIL合用对结肠癌SW480细胞有协同作用。HE染色光镜观察和电镜观察发现经TRAIL作用后的细胞具有核 第叁军医大学博士研究生论文TRAIL抗肿瘤作用的研究 浓缩、碎裂、凋亡小体形成等凋亡的形态特征。 3）MTT法和流式细胞仪检测证实TRAIL与阿司匹林合用有协同 作用，Western blot法结果表明阿司匹林可抑制Be12的表达，对Bax 的表达无影响。阿司匹林和 TRAIL产生协同作用与其抑制 BC12的表 达的作用有一致的量效关系。 4）MTT法和TUNEL法测得的结果显示，肝癌SMMC－7721细胞 转入反义DNMTI基因片段后对TRAIL更加敏感。免疫组化染色和流 式细胞仪检测发现反义DNMTI基因片段转入肝癌SMMC－7721细胞后 BclZ家族成员Bax、Bad的表达增强，但BclZ的表达无改变。 由此我们得出以下结论：（1）TRAIL 可通过诱导凋亡的方式有效 地杀死结肠癌8＊480细胞和肝癌SMMC－7刀1细胞。（2）5－FU与TRAIL 联合应用对 SW480细胞有协同抗肿瘤的作用。（）阿司匹林与 TILAIL 联合应用有协同杀死肿瘤细胞的作用，该作用的产生与阿司匹林抑制肿 瘤细胞表达B。12有关。（4）反义DNMTI基因片段转入SMMC－7721 细胞后，细胞对TRAIL的敏感性增强，这种敏感性的改变可能与反义 DNMTI基因片段增强Bax、Bad的表达有关。
刘静, 曲秀娟, 刘云鹏, 徐玲, 侯科佐[5]2011年在《抑制JNK通路对TRAIL诱导胃癌细胞凋亡影响的研究》文中指出目的:研究JNK信号传导通路对TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的影响。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞活力;蛋白质印迹法检测细胞内磷酸化JNK及总JNK的表达水平;流式细胞术碘化丙啶(PI)染色检测细胞凋亡及细胞周期分布。为研究JNK通路活性对TRAIL抗肿瘤作用的影响,将实验分为空白对照组、TRAIL单药组(100μg/L)、JNK抑制剂组(SP600125,20μmol/L)和联合用药组(SP600125+TRAIL)。结果:采用25、50、100和200μg/LTRAIL作用于MGC803细胞24 h,细胞活力仅轻度下降。进一步研究发现,TRAIL作用后细胞内磷酸化JNK水平明显升高,提示JNK信号通路被活化。同TRAIL单药组相比,联合用药组的细胞活力明显降低〔(53.5±3.2)%vs(88.3±1.1)%,P<0.05〕,细胞凋亡明显增加〔(21.3±5.1)%vs(5.7±0.1)%,P<0.05〕,G2/M期细胞比例明显升高〔(38.0±6.0)%vs(25.7±2.9)%,P<0.05〕。结论:抑制JNK通路能明显增强TRAIL对MGC803细胞的抗肿瘤作用,其机制可能与诱导细胞凋亡及G2/M期阻滞有关。
梁爽[6]2018年在《NDV-HN、GA磺胺衍生物化合物活化小鼠NK细胞杀伤肝癌细胞的实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景及意义:新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)作为溶瘤病毒,是因为该病毒在抗肿瘤中主要杀伤癌细胞而对正常细胞不杀伤或杀伤作用较轻,且对人基本无致病或致病较轻。研究证实,NDV的抗瘤作用主要与病毒包膜上血凝素神经氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase,HN)糖蛋白有关,HN兼具血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的活性。HA的作用除了凝集红细胞外,还与病毒吸附宿主细胞,引起感染有关,在抗肿瘤上,HA与肿瘤细胞结合,通过溶解细胞而发挥抗肿瘤作用,或者通过HA与免疫细胞结合,激活免疫细胞,发挥抗肿瘤免疫应答;NA的作用底物是宿主细胞上的糖蛋白末端的唾液酸,功能是去除唾液酸,暴露宿主细胞上的肿瘤细胞抗原,同时也可诱导HA附着于宿主细胞,并启动随后的膜融合。没食子酸(Gallic acid,GA)是一种天然植物叁酚结构的物质,因其对正常细胞毒副作用较低,对多种肿瘤有较强的杀伤作用,且可口服,具有作用机制较为明了等特点,使其在抗肿瘤研究中备受关注。随着对GA抗肿瘤作用机制的进一步认识,越来越多的研究依据GA结构特点,对其进行改造,以合成新型化合物,从而提高GA与肿瘤细胞结合的亲和力,增加其抗肿瘤活性,以期设计出新型抗肿瘤药物。本课题组对NDV的抗瘤作用已进行了10多年的系列研究。前期研究证实NDV可通过“依赖IFN-γ途径”活化NK细胞,通过上调细胞表达抗瘤分子TRAIL(TNF-related-apoptosis inducing ligand,TRAIL),从而增强NK细胞的杀瘤效果,但对NK细胞中的其他细胞表型没有进行研究。进一步研究发现,NDV除了经“依赖IFN-γ途径”活化NK细胞外,尚存在NDV经“非依赖IFN-γ途径”活化NK细胞。为此,我们前期对NDV经“非依赖IFN-γ途径”活化NK细胞进行了进一步研究。提出了“NDV-HN与NKp46结合→激活Syk-NF-κB信号途径→上调NK细胞表达TRAIL”这一科学假设。假设中,NDV-HN直接与NK细胞的NKp46(属于细胞上活化受体,是NK细胞特有的表面标志之一)结合,通过激活NK胞浆中的脾脏酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase,Syk)和胞核的NF-κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB),最后引起TRAIL等抗瘤分子的上调表达。NK细胞除表达分泌TRAIL和TNF外,尚能表达分泌颗粒酶B(Granzyme B,GrB)、Fas和FasL。本课题主要研究NDV-HN直接作用于NK细胞,细胞内Syk和NF-κB激活后,细胞GrB、Fas和FasL的上调表达情况,同时检测激活后的效应NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用;此外,我们选择对肝癌细胞有杀伤作用的GA磺胺衍生物化合物EJTC,检测对小鼠NK是否有活化功能,以及其活化后的分子事件。通过本研究,我们将进一步阐明NDV-HN直接活化NK细胞的分子机制,对应用NDV溶瘤病毒合并NK细胞于肿瘤的生物治疗,具有积极的意义,同时以NK细胞杀伤肿瘤细胞为模型,从免疫学角度研究天然药物的抗肿瘤作用,为开发新药物打下试验基础。目的:1.观察NDV-HN的作用能否增强小鼠IFN R~(+/+)NK细胞对小鼠肝癌细胞的杀伤作用,探讨活化小鼠IFN R~(+/+)NK细胞中GrB和Fas/FasL蛋白表达水平的变化。2.观察NDV-HN是否能经“非IFN依赖途径”活化小鼠IFN R~(-/-)NK细胞增强其对小鼠肝癌细胞的杀伤作用,探讨活化小鼠IFN R~(-/-)NK细胞中GrB和Fas/Fas L蛋白表达水平的变化;观察HN抗体、Syk、NF-κB信号抑制剂对NDV-HN经非依赖IFN途径激活IFN R~(-/-)NK对小鼠肝癌细胞的杀伤作用的影响,并探讨GrB和Fas/FasL蛋白表达水平的变化。3.观察叁种不同的GA磺胺衍生物系列化合物(LDQN-C,EJTC,HAMDL)和没食子酸(GA)对小鼠肝癌细胞的杀伤作用。4.观察GA磺胺衍生物化合物EJTC是否能活化小鼠IFN R~(+/+)NK细胞致小鼠肝癌细胞杀伤,探讨活化小鼠IFN R~(+/+)NK细胞中GrB蛋白表达水平的变化。方法:1.体外培养条件下,首先用NDV-HN(空白对照组(PBS),阳性实验对照组(NDV))刺激小鼠IFN R~(+/+)NK细胞,然后采用CFSE/PI染色,通过流式细胞仪检测小鼠IFN R~(+/+)NK细胞对小鼠肝癌细胞株的杀伤作用;用ELISA法检测小鼠IFN R~(+/+)NK细胞培养基上清中GrB和Fas蛋白浓度;用WB法分析小鼠IFN R~(+/+)NK细胞中GrB和Fas/FasL蛋白表达水平。2.体外培养条件下,首先用NDV-HN(空白对照组(PBS),阳性实验对照组(NDV))激活小鼠IFN R~(-/-)NK细胞,接着用HN抗体、Syk激酶抑制剂和NF-κB抑制剂阻断小鼠IFN R~(-/-)NK细胞中的信号通路,再用CFSE/PI染色,通过流式细胞仪检测小鼠IFN R~(-/-)NK细胞对小鼠肝癌细胞株杀伤作用的变化;ELISA法检测小鼠IFN R~(-/-)NK细胞培养基上清中GrB和Fas蛋白浓度;WB法分析小鼠IFN R~(-/-)NK细胞中GrB和Fas/FasL蛋白表达水平。3.不同浓度的GA磺胺衍生物化合物(LDQN-C,EJTC,HADML),与小鼠肝癌细胞作用不同时间后,采用CCK-8法检测小鼠肝癌细胞活性变化。分别用相同浓度的GA磺胺衍生物化合物(LDQN-C,EJTC,HADML)和GA,与小鼠肝癌细胞作用48h后,比较其杀伤效果。4.GA磺胺衍生物化合物之一的EJTC刺激小鼠IFN R~(+/+)NK细胞株,采用CFSE/PI染色,通过流式细胞仪检测小鼠IFN R~(+/+)NK细胞对小鼠肝癌细胞株的杀伤作用;ELISA法检测小鼠IFN R~(+/+)NK细胞培养基上清中GrB蛋白浓度;WB法分析小鼠IFN R~(+/+)NK细胞中GrB蛋白表达水平。5.采用FlowJo分析软件进行流式结果分析。各组样本结果用表示。实验组与空白对照组,采用SPSS13.0软件方差分析LSD(ANOVA)法进行比较,若方差齐性,采用t检验方法进行两样本比较,采用χ~2检验进行两样本率的比较。若方差不齐,采用Tamhane’s T2法分析。P<0.05认为该差别有统计学意义,P<0.01认为差异有显着统计学意义。结果:1.NDV-HN能够增强小鼠IFN R~(+/+)NK细胞株体外条件下对肝癌细胞株的杀伤活性,各效靶比与空白对照组相对比,差异都有统计学意义(P<0.05),其中效靶比1:5和1:10组差异有显着统计学意义(P<0.01),而与NDV阳性实验对照组相比,NDV-HN组差异无统计学意义(P>0.05)。NDV-HN可以显着提高小鼠IFN R~(+/+)NK细胞上清中的GrB,Fas浓度,与空白对照组相比P<0.01,差异有显着统计学意义,与NDV阳性实验对照相比差异无统计学意义(P>0.05)。并可以明显的提高IFN R~(+/+)NK细胞内GrB,Fas和FasL蛋白的表达,空白对照组相比P<0.05,差异有统计学意义,与NDV阳性实验对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。2.(1)NDV-HN的刺激能激活小鼠IFN R~(-/-)NK细胞,使其体外杀伤小鼠肝癌细胞的能力得到增强,各效靶比与空白对照组相对比,差异都有统计学意义(P<0.05),其中效靶比1:5和1:10组差异有显着统计学意义(P<0.01)。NDV-HN能显着提高小鼠IFN R~(-/-)NK细胞上清中的GrB,Fas浓度,提高IFN R~(-/-)NK细胞内GrB,Fas和FasL蛋白的表达,与空白对照组相比P<0.05,差异有统计学意义,与NDV阳性对照组相比,差异无有统计学意义(P>0.05)。(2)加入HN抗体,Syk抑制剂和NF-κB抑制剂后,能够逆转NDV-HN激活小鼠IFN R~(-/-)NK细胞对肝癌细胞株的杀伤作用,当效靶比为1:5和1:10时,各抑制组与NDV-HN组相对比,都表现出逆转作用,差异有统计学意义(P<0.05)。并抑制小鼠IFN R~(-/-)NK细胞GrB和Fas的产生,下调小鼠IFN R~(-/-)NK细胞GrB和FasL表达水平。各抑制剂组与NDV-HN组相比,GrB,Fas和FasL的蛋白含量都有差异(P<0.05)。3.GA磺胺衍生物系列化合物之一的EJTC对小鼠肝癌细胞的杀伤活性最强,EJTC IC_(50)=0.032μM,HAMDL次之,IC_(50)=0.064μM,LDQN-C活性较差,IC_(50)=0.14μM。各化合物的最佳刺激时间都为48小时。当浓度分别为20μg/ml和40μg/ml叁种没食子酸磺胺衍生物化合物(LDQN-C,EJTC和HAMDL)与同浓度的GA相比,对小鼠肝癌细胞的杀伤作用均有明显提高(P<0.05)。4.GA磺胺衍生物系列化合物之一的EJTC激活小鼠NK细胞的实验,各效靶比与空白对照组相对比,差异都有统计学意义(P<0.05),其中效靶比1:5和1:10组差异有显着统计学意义(P<0.01),而与NDV阳性实验对照组相比,NDV-HN组差异无统计学意义(P>0.05)。NDV-HN可以显着提高小鼠IFN R~(+/+)NK细胞上清中的GrB浓度,与空白对照组相比P<0.01,差异有显着统计学意义,与NDV阳性实验对照相比,差异无统计学意义(P>0.05)。并可以明显的提高IFN R~(+/+)NK细胞内GrB蛋白的表达,空白对照组相比P<0.05,差异有统计学意义,与NDV阳性实验对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.NDV-HN能够通过增加小鼠IFN R~(+/+)NK细胞释放GrB和Fas及上调小鼠IFN R~(+/+)NK细胞中GrB和Fas/FasL蛋白表达,从而增强小鼠IFN R~(+/+)NK细胞的体外抗肿瘤活性。2.NDV-HN还能够通过“非IFN依赖途径”,活化小鼠IFN R~(-/-)NK细胞所致的小鼠肝癌细胞杀伤作用,其机制是通过调节NK细胞GrB和Fas/FasL的释放和表达,而Syk和NF-κB是小鼠IFN R~(-/-)NK细胞激活的重要信号分子。3.GA磺胺衍生物系列化合物因其结构不同对小鼠肝癌细胞的杀伤作用有差异,但与已知药物活性的GA相比,各化合物的活性均有所提高,说明在GA中引入磺胺衍生物所合成的新化合物是有结构改造意义的。4.GA磺胺衍生物系列化合物之一的EJTC可以增强小鼠IFN R~(+/+)NK细胞体外条件下对小鼠肝癌细胞株的杀伤能力,增加小鼠IFN R~(+/+)NK细胞释放GrB及上调小鼠IFN R~(+/+)NK细胞中GrB蛋白表达,说明其可通过免疫调节机制产生抗肿瘤作用。
梁莹[7]2018年在《NDV-HN经NKp46途径上调小鼠NK细胞TRAIL表达的研究》文中提出研究背景及意义:新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)因具有良好的抗瘤效果和几乎无毒的优势,而成为肿瘤生物治疗的候选病毒株。NDV的抗瘤效果不仅与直接诱导肿瘤细胞的凋亡和自噬有关,还与NDV激活机体抗瘤免疫应答有关。自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)是固有免疫系统的重要组成部分,它构成机体抗肿瘤免疫应答的第一道防线,同时,NK细胞还可间接调控获得性免疫应答来清除肿瘤细胞。研究表明,NDV能增强NK细胞抗瘤效应,它可能的重要机制之一是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)的上调表达。TRAIL是新近发现诱导靶细胞凋亡的配体分子,目前发现它的活性死亡受体存在于多种肿瘤细胞表面,因此TRAIL的杀伤功能具有肿瘤特异性。因而TRAIL的活化机制研究具有较重要的意义。肿瘤微环境中NDV促NK细胞TRAIL的活化机制并不清楚,我们课题组前期研究证实NDV可通过诱导NK细胞分泌g型干扰素(interferon-g,IFN-g)促进TRAIL上调表达来实现抗瘤效应的增强,然而IFN-γ抗体仅能部分抑制该效应,这提示可能存在不依赖IFN-γ的其它活化机制调控TRAIL,目前尚未见报道。我们推测NDV促NK细胞TRAIL的直接活化途径可能是不依赖IFN-γ的活化机制之一。因为NK细胞杀伤功能的调控有赖于表面的活化性受体与肿瘤细胞和病毒感染细胞表面配体的识别,其中,NKp46是NK细胞重要的活化性受体分子。目前体外研究发现,表达在感染细胞表面的NDV血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN),可与NKp46结合,促进肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)分泌。那么HN-NKp46途径是否是NDV促NK细胞TRAIL的直接活化途径成为本课题研究的研究内容。我们将以非依赖IFN-γ途径为切入点,以IFN-γ受体基因敲除的B6.129S7小鼠(以下简称IFN R~(-/-)小鼠)的脾脏NK细胞及IFN R~(-/-)NK细胞系为研究对象,展开NDV促NK细胞TRAIL的直接活化机制的研究,并初步探讨HN-NKp46途径活化TRAIL上调的NK细胞信号通路。这些研究将有助于拓展对NDV抗瘤的免疫活化机制的认识,为基于NDV-NK输注的抗肿瘤研究和临床治疗提供理论依据。目的:1.探讨NDV是否经非依赖IFN-γ途径活化小鼠NK细胞上调TRAIL表达。2.探讨HN-NKp46途径是NDV不依赖IFN-γ促NK细胞TRAIL上调的活化途径之一。3.初步探讨HN-NKp46途径活化TRAIL上调的NK细胞信号通路。方法:1.选用IFN-γ受体敲除的IFN R~(-/-)小鼠进行实验,利用免疫磁珠阴选法制备脾源性NK细胞;NDV和鼠源IFN-γ经体外刺激纯化的NK细胞或经腹腔注射体内刺激小鼠,经Western blot、ELISA及流式细胞术方法分别检测细胞膜型、分泌型TRAIL的量及TRAIL~+NK细胞占NK细胞总群比值,观察NDV体内、外作用对NK细胞TRAIL表达的影响。然后采用ELISA方法检测NDV处理的体内和体外实验IFN-γ的量,观察NDV对NK细胞IFN-γ表达的影响。2.利用NDV及NDV的HN和F蛋白体外作用纯化的NK细胞,经Western blot、ELISA及流式细胞术方法检测TRAIL;利用基于ELISA法的体外结合实验检测NDV结合NK细胞的情况;进一步利用竞争结合实验和竞争结合干扰实验检测NDV、HN及F与纯化的NK细胞共培养对随后NKp46抗体结合的影响;随后利用唾液酸酶和HN抗体,观察HN-NKp46结合的干扰对HN活化NK细胞的影响,经Western blot、ELISA方法检测TRAIL;此外,利用ELISA法检测HN-NKp46结合的干扰对HN活化NK细胞IFN-γ的影响。3.HN与IFN R~(-/-)NK细胞体外共培养,利用Western blot法检测Syk、IκBα磷酸化以及HN-NKp46的阻断对Syk、IκBα分子磷酸化的影响;进一步利用Syk、NF-κB信号抑制剂干扰和siRNA干扰,经Western blot、ELISA方法检测TRAIL;利用Syk信号抑制剂和siRNA的干扰实验观察Syk是否影响下游NF-κB信号通路的活化,经Western blot方法检测IκBα分子磷酸化。结果:1.流式细胞术测定经免疫磁珠阴选法制备的脾源性NK细胞纯度>92%;IFN-γ受体正常时,NDV、IFN-γ均可体外促进细胞膜型和分泌型TRAIL的表达及TRAIL~+NK细胞百分比的升高;IFN-γ受体缺失时,NDV仍可上调TRAIL及TRAIL~+NK细胞比值,而IFN-γ不具有该效应;同时利用腹腔注射NDV的体内实验验证上述工作,结果发现NDV可促进IFN-γ受体缺失小鼠的脾源性NK细胞膜型TRAIL的表达和外周血TRAIL的量;IFN-γ受体的缺失,不影响NDV上调NK细胞IFN-γ的量。2.HN可体外促进IFN R~(-/-)NK细胞膜型和分泌型TRAIL的表达及TRAIL~+NK细胞%的升高,而F蛋白不具有该效应;NDV或HN可结合到NK细胞,NKp46抗体或唾液酸酶的处理均可不同程度减少结合到NK细胞的NDV的量;NDV、HN可显着减少NKp46抗体与NK细胞的结合,F蛋白则不能,HN-NKp46的结合在识别早期存在HN剂量依赖性,且HN抗体可部分干扰NDV的竞争结合效应;唾液酸酶、HN抗体可明显减少NDV、HN体外促进IFN R~(-/-)NK细胞膜型和分泌型TRAIL的表达;HN-NKp46结合的受阻均可不同程度地减少NK细胞IFN-γ的量。3.HN可促进NK细胞Syk、IκBα的磷酸化活化,唾液酸酶、HN抗体可不同程度减少NDV、HN触发的NK细胞Syk、IκBα磷酸化激活作用;Syk信号抑制剂herbinmycin A、NF-κB信号抑制剂PDTC均可不同程度减弱NDV或HN促NK细胞的TRAIL上调;IFN R~(-/-)NK细胞分别干扰Syk、P65基因表达36H后,NDV或HN活化的NK细胞TRAIL上调可出现不同程度减少;无论是Syk信号抑制剂还是siRNA均可不同程度削弱HN触发的IκBα磷酸化激活作用。结论:本研究以IFN-γ受体敲除小鼠的NK细胞和IFN R~(-/-)细胞株为研究对象,围绕着NDV活化NK细胞上调TRAIL的非依赖IFN-γ途径开展研究。我们初步获得如下发现:1.NDV存在IFN-γ非依赖途径上调NK细胞TRAIL的表达。2.HN-NKp46途径是NDV不依赖IFN-γ促NK细胞TRAIL上调的活化途径之一。3.Syk、NF-κB信号通路在HN经IFN-γ非依赖途径上调TRAIL的表达中起重要作用。综上所述,在NDV抗肿瘤的NK细胞免疫激活机制研究中,NDV还可能循HN—NKp46—Syk—NF-κB途径激活NK细胞TRAIL表达,这些结果的发现提示利用NDV-NK联合治疗的潜在价值。
范丽[8]2012年在《复方TRAIL/DOX脂质体用于脑胶质瘤的治疗研究》文中研究表明据统计,脑胶质瘤约占脑部肿瘤的30～40%,而传统的手术治疗、放疗或化疗并不能取得理想的治疗效果,因此,探寻新的治疗方法成为脑胶质瘤的研究重点。细胞凋亡在胚胎发育与组织分化中起着关键作用,细胞凋亡失调对肿瘤的发生、发展甚为重要,其存在细胞内与细胞外两条途径。化疗药物盐酸阿霉素(Doxorubicin, DOX)通过细胞内途径促进肿瘤细胞凋亡；而肿瘤坏死因子家族成员TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand)主要通过细胞外途径促进肿瘤细胞凋亡。本课题以DOX与TRAIL为治疗药物,采用长循环脂质体作为药物载体,制备复方脂质体(TRAIL-LP/DOX-LP),以期同时通过细胞内途径与细胞外途径,发挥两种药物的协同抗肿瘤作用,延长药物的体内滞留时间,并利用肿瘤的EPR效应增加药物在肿瘤部位的蓄积,促进肿瘤细胞的凋亡,增强抗肿瘤效果。本文第一章为复方TRAIL/DOX溶液剂的协同抗肿瘤作用研究。以对TRAIL不敏感的人脑胶质瘤细胞U87为研究对象,考察了TRAIL与DOX合用的协同增效作用,并对其体内抗U87脑胶质瘤的药效学进行了初步探索。结果表明,DOX与TRAIL溶液剂在体外具有良好的协同增效作用,而在体内并不能显着改善荷脑胶质瘤动物模型的存活时间,提示TRAIL与DOX若要在体内发挥协同作用,可能需要纳米给药系统的辅助。另外,为了验证TRAIL与DOX协同增效作用的普适意义,对其协同抗非小细胞肺癌的作用也进行了体内外评价。第二章为TRAIL-LP/DOX-LP的制备与表征,并对其被动靶向脑胶质瘤的特性进行了考察。以硫酸铵水化法制备阿霉素脂质体(DOX-LP)。DOX-LP的平均粒径为101.0±45.3nm,包封率为97.4%,Zeta电位为-5.74mV。在课题组前期考察了超声、冻融以及温度对于TRAIL活性影响的基础上,以薄膜水化法制备TRAIL脂质体(TRAIL-LP), TRAIL-LP的平均粒径为107.6±47.8nm,包封率为12.5%,Zeta电位为-2.09mV。采用小动物活体成像技术考察了脂质体在荷瘤鼠体内的分布,结果表明,包载近红外探针DiR的脂质体(DiR-LP)能够入脑并在肿瘤部位浓集,具有一定的脑肿瘤靶向特性。第叁章考察了TRAIL-LP/DOX-LP对脑胶质瘤的体内外药效学,并对其体内外安全性进行了初步评估。以人脑胶质瘤U87细胞为模型,初步考察了复方脂质体的体外抗肿瘤活性,结果表明,TRAIL-LP/DOX-LP对U87细胞的杀伤作用显着增强,提示复方脂质体在体外具有较好的协同促脑胶质瘤细胞凋亡作用；通过测量给药后荷瘤鼠肿瘤体积大小,体内胶质瘤细胞的凋亡率,以及荷瘤鼠的生存曲线和中位生存期,评价了复方脂质体对脑胶质瘤的体内药效。结果表明,TRAIL-LP/DOX-LP组治疗后,瘤体积为6.73±1.79mm3,和生理盐水组瘤体积64.82±4.26mm3,TRAIL-LP组瘤体积61.53±12.26mm3以及DOX-LP组瘤体积25.59±6.31mm3相比,均有显着性减小(p<0.01)；流式细胞仪检测TRAIL-LP/DOX-LP组脑胶质瘤区的细胞凋亡率为19.92±2.49%,也显着高于生理盐水组(5.40±1.38%)、TRAIL-LP组(7.80±0.30%)以及DOX-LP组(9.32±1.23%)(p<0.02)；与生理盐水组相比较,TRAIL-LP/DOX-LP组的中位生存期延长了50%,而TRAIL-LP组无延长,DOX-LP组仅延长了21.9%。以正常细胞大鼠脑毛细血管内皮细胞(BCEC)为模型考察复方脂质体的体外毒性,结果表明,TRAIL-LP/DOX-LP对BCEC几乎没有抑制增强作用；而采用H&E染色各组织切片的方法考察TRAIL/DOX-LP的体内毒性,结果显示TRAIL-LP/DOX-LP在体内也具有较好的安全性。第四章对TRAIL-LP/DOX-LP的协同抗脑胶质瘤的机理进行了体内外研究。体外研究考察了DOX-LP对U87细胞DR4(death receptor4)与DR5(death receptor5)表达总量及其细胞表面表达量的影响；另外,也考察了TRAIL-LP/DOX-LP对U87细胞中caspase家族蛋白以及Bcl家族蛋白表达的影响。研究结果表明,DOX能够增加U87细胞表面DR4与DR5受体的表达量,提示其可以为TRAIL创造更多的与DR4、DR5结合的机会,从而增强TRAIL促肿瘤细胞凋亡的作用；在细胞内途径中起重要作用的caspase-9前体以及在细胞外途径中起重要作用的caspase-8前体的表达的降低,以及在细胞内途径与细胞外途径中共同起作用的关键调节蛋白caspase-3的活性体表达的增加,提示caspase-9前体与caspase-8前体可能降解为发挥细胞凋亡作用的活性体,表明复方脂质体的协同抗肿瘤作用是细胞内途径与细胞外途径共同增强的结果。体内研究对给药后的荷瘤鼠脑胶质瘤部位的冰冻切片进行免疫荧光染色,考察DR4以及DR5的表达。结果表明,复方脂质体能够增加DR5的表达,而对DR4表达无显着影响,进一步说明DOX能够通过增加肿瘤细胞表面DR5受体的表达,增强TRAIL与其结合的能力,并最终增加促肿瘤细胞凋亡的关键分子caspase-3的表达而促进肿瘤细胞的凋亡。
李俊龙[9]2018年在《河蚌可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（sTRAIL）诱导前列腺癌细胞凋亡作用的研究》文中认为前列腺癌是威胁人类健康的主要癌症之一,在欧洲和美国,前列腺癌的发病率多年来一直位居男性恶性肿瘤的首位,死亡率居第二位。虽然中国前列腺癌发病率低于欧美等国家,但近年来,随着人口老龄化、饮食结构改变、医疗诊断技术水平的提高和医疗体检的普及,我国前列腺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。据估计,2015年我国前列腺癌新发病例约60300例,死亡病例约26600例。前列腺癌的传统的治疗为雄激素剥夺疗法,利用药物或手术方法降低病人的体内雄激素水平,从而达到治疗前列腺癌的目的。遗憾的是,在经过12-18个月的中位治疗时间后,大多数病人最终转归为去势/激素抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)。一旦出现激素抵抗,就目前的治疗水平来说,激素抵抗性前列腺癌对化学治疗和放射治疗皆不敏感,从而导致CRPC患者面临内分泌治疗无效后生活质量降低、生存期缩短等一系列影响。因此,研发新的有效的前列腺癌治疗药物和治疗手段成为CRPC前列腺癌治疗中亟待解决的关键问题。近年来,基于促进肿瘤细胞凋亡、改变细胞内信号传导途径等机制的分子靶向治疗、基因治疗方法受到人们的重视,如国内外学者杨高毅等研究发现下调bcl-2蛋白可以诱导前列腺癌细胞凋亡,并且发现bcl-2反义寡核苷酸oblimersensodium联合多烯紫杉醇治疗激素难治性前列腺癌的Ⅰ/Ⅱ期临床研究也显示出良好的治疗效果。另外,携带可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)基因的腺病毒可引起人体内肿瘤细胞发生明显的凋亡。其中,TRAIL引起了人们的关注。国内外对TRAIL及其介导的细胞凋亡途径的研究表明,TRAIL或其胞外域降解形成可溶性的细胞因子sTRAIL(Soluble TRAIL)可作用于靶细胞表面的死亡受体DR4和DR5而形成死亡诱导信号复合体,并激活caspase8及其下游的caspase级联反应,然后启动死亡受体途径和线粒体依赖的凋亡途径。其中死亡受体途径最终通过激活caspase3等效应酶,作用于蛋白激酶C(PKC)等底物而导致细胞凋亡。而线粒体依赖途径是通过形成有活性的tBid(truncated BID),使线粒体释放cytC等凋亡相关因子,再通过caspase3,7诱导肿瘤细胞凋亡。bcl2是该途径的抑制因子之一。另外,一些肿瘤细胞高表达诱骗受体DcR1、DcR2,它们可与DR4/DR5竞争同TRAIL的结合,抑制TRAIL介导的细胞凋亡,使肿瘤细胞表现出对TRAIL的耐受。然而,近年来,尽管人类等脊椎动物TRAIL蛋白的抗癌作用已有较多研究报道,但对前列腺癌PC3细胞的促凋亡作用则罕见报道,对其作用的详细的分子机制则未见报道,而对贝类等无脊椎动物的TRAIL基因及其重组蛋白的抗肿瘤功能国际上则更没有报道。在先前利用RT-PCR技术克隆池蝶蚌的免疫相关基因的过程中,我们获得了双壳贝类池蝶蚌的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(sTRAIL)基因的部分序列,并发现该TRAIL有一定的抗肿瘤特性。为深入探讨贝类sTRAIL基因的抗肿瘤作用及其可能的作用机制,我们拟通过本项目的研究进一步确定池蝶蚌的sTRAIL在抗肿瘤,即促进前列腺癌细胞PC3细胞凋亡方面的功能作用,并揭示其作用的死亡受体信号传导途径等可能的作用机制,从而将该蛋白作为新型抗癌药物,以及将TRAIL和相关信号分子作为靶向治疗的有效靶点运用于前列腺癌等癌症的治疗实践方法:1.利用RT-PCR和western-blot技术克隆池蝶蚌sTRAIL基因序列,并对sTRAIL基因进行原核表达、纯化获得多克隆抗体。2.利用不同浓度的(10ng-10 u g)河蚌sTRAIL重组蛋白对该细胞进行诱导刺激,利用流式细胞仪检测和DNAladder等检测法对sTRAIL诱导刺激0-96h后PC3的细胞凋亡现象进行了分析。3利用Real-time实时定量PCR和Western blotting技术检测sTRAIL重组蛋白诱导/未诱导的肿瘤细胞(PC-3)的DR4、DR5、DcR1、DcR2在mRNA和蛋白质水平上的表达变化。4 分别用 caspase8 抑制剂 Z-AEVD-FMK 和 caspase3 抑制剂 Ac-DEVD-CHO 处理经sTRAIL诱导的PC-3细胞,利用上述方法检测细胞凋亡情况,并检测抑制剂处理前后caspase8、caspase3、PKC等分子在mRNA和蛋白水平表达的变化。5在上述对死亡受体、caspase信号途径研究的基础上,用PKC抑制剂,Staurosporine处理经sTRAIL诱导的PC-3细胞,利用Real-time实时定量PCR和Western blotting技术检测细胞凋亡和抑制剂处理前后PKC等基因表达的变化。6.检测sTRAIL诱导后,PC-3细胞中抗凋亡因子bcl-2基因表达水平的变化。用bcl-2抑制剂(ABT-737,5nM)处理后,再次检测凋亡率。结果:1克隆了池蝶蚌sTRAIL蛋白序列,并证实了 sTRAIL蛋白对PC3细胞的毒性作用。2河蚌sTRAIL对PC3细胞具有较强的细胞毒性作用,可诱导PC3细胞发生显着的细胞凋亡,随着sTRAIL浓度和诱导时间的增加,PC3细胞的凋亡率逐渐增加,呈现明显的剂量与时间效应,其中100ngsTRAIL诱导组中,24h细胞凋亡率可达23.7%以上,并可检测到DNA ladder的形成。3对sTRAIL诱导后,PC3细胞中死亡受体DR4和DR5均有表达,但DR4较高;而诱骗受体DcR1和DcR2不表达.4 sTRAIL诱导可引起caspase8、caspase3基因表达水平的显着上调,同时伴随凋亡率的增加;用caspase8抑制剂Z-IETD-FMK或caspase 3抑制剂Ac-DEVD-CHO分别处理,均能显着下调凋亡率。5sTRAIL诱导可引起PKC基因表达水平的上调,但不显着;PKC抑制剂(Saurosporine)处理后,凋亡率明显下降,但仍显着高于对照组。6sTRAIL诱导后24h内可引起bcl-2表达上调,但不显着;用bcl-2抑制剂(ABT-737)处理后,凋亡率明显增加。结论:确定了池蝶蚌sTRAIL对前列腺癌细胞株(PC3)的促凋亡作用,并分析了sTRAIL诱导前列腺癌细胞株(PC3)发生细胞凋亡的死亡受体途径中相关的死亡受体、caspases、PKC、Bcl-2等分子的作用,确定了 TRAIL、DR4和bcl-2可作为PC3细胞靶向治疗的新靶点。
詹金彪[10]2008年在《天花粉蛋白抗肿瘤作用的分子机理研究》文中研究表明天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)是从葫芦科植物栝楼(Trichosanthes kirilowiiMaxim)的块根中提取的一种蛋白质,为我国传统中药“天花粉”的有效成分,它具有引产、抗肿瘤和抗HIV病毒等多种生物学功能。TCS属于单链核糖体失活蛋白(ribosome inactivatingprotein,RIP),以往的研究主要集中在结构和药理作用方面,对其引起细胞凋亡和信号转导的分子机制研究得较少。为了更好地进行临床应用,有必要对天花粉蛋白的抗肿瘤作用机理进行深入研究。研究目的通过现代细胞和分子生物学的方法,深入研究TCS引起的肿瘤细胞凋亡和信号转导过程的规律,揭示其抗肿瘤作用的分子机理。研究方法第一部分:天花粉蛋白对肿瘤细胞凋亡和周期阻滞的影响首先采用流式细胞术,以体外培养的鼠成纤维肉瘤细胞L929为对象,研究TCS对肿瘤细胞周期抑制作用;采用MTT法,在体外测定了TCS对Hela、Hep-G2、HCT116、Colo205等肿瘤细胞的细胞毒性。为了证实TCS引起细胞凋亡,利用Western blot方法检测了细胞凋亡过程中Caspase 3和其它信号分子如PARP和JNK的激活情况,以本实验室表达的TCS的类似蛋白PAP作为对照。第二部分:天花粉蛋白诱导细胞ER STRESS作用研究为了研究TCS引起的内质网应激(ER Stress)现象,首先采用Western blot方法检测了TCS引起的内质网应激标志蛋白CHOP和BIP的表达,以及CHOP诱导TRAIL受体蛋白DR5的上调情况;为了证明CHOP蛋白在TCS引起的细胞凋亡中的重要性,我们采用RNA干涉技术,将CHOP siRNA转染进入L929细胞中以将CHOP基因knock-down,观察转染前后细胞对TCS和TRAIL的敏感性的差异,用流式细胞术和MTT法测定TCS和TRAIL对上述两种细胞的协同杀伤作用。第叁部分:AUTOPHAGY参与天花粉蛋白诱导的凋亡过程研究首先用Western blot方法,检测了TCS诱导细胞自噬的标志蛋白LC3的转化现象,再用双荧光蛋白标记的-LC3质粒转化进入细胞,并用激光共聚焦显微镜观测了TCS处理下自噬体的形成现象,以本实验室表达的PAP作为对照;为了进一步研究自噬在TCS诱导凋亡过程中的重要性,我们采用RNA干涉技术,通过siRNA转染来分别knock-down与细胞自噬相关的基因Atg 5、Atg 7和Beclin,用Westernblot方法证实其表达水平;最后,用流式细胞术测定Atg 5、Atg 7和Beclin基因knock-down细胞对用TCS和TRAIL处理的敏感性,来确定自噬过程对TCS引起的细胞凋亡的重要性。研究结果:第一部分:天花粉蛋白对肿瘤细胞凋亡和周期阻滞的影响L929细胞经不同剂量TCS处理24 h后,有明显的G0/G1期阻滞,并呈时间和剂量的依赖性,而当处理时间增加到48 h后,高剂量组呈明显的S期细胞周期阻滞。MTT试验证实,TCS对各种肿瘤细胞呈现细胞毒性作用,各种肿瘤细胞对TCS处理的敏感性不同。用Hoechst 33342和Sytox Green染色经TCS处理的细胞可以在形态学上观察到细胞凋亡。TCS可以激活Caspase-3进而引起凋亡,PARP是Caspase-3的作用底物,因此能观察到PARP的的裂解,并呈时间和剂量依赖关系,对照蛋白PAP也有类似的作用。当培养基中加入泛Caspase抑制剂zVAD,可以完全阻断高剂量TCS处理Hela细胞引起的PARP的裂解,除见到PARP的裂解外,还可以见到Caspase-3酶原的激活和总JNK激酶的磷酸化激活。第二部分:天花粉蛋白诱导细胞ER STRESS作用研究TCS可以引起L929细胞的内质网应激,首先伴随着分子伴侣BIP的逐渐升高,在24 h小时后有内质网应激标志蛋白CHOP的明显表达,并观察到TRAIL受体DR5表达水平升高,Caspase 12酶原也是随着时间逐渐地被激活。因为TCS可以上调DR5的表达,所以在TCS和TRAIL联合应用时,呈现协同效应。用siRNA转染L929细胞后,CHOP基因knock-down细胞表现为对TRAIL和TCS联合处理的敏感性降低。第叁部分:AUTOPHAGY参与天花粉蛋白诱导的凋亡过程研究微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3),是在真核细胞发现的自噬标志蛋白,Hela和L929细胞经TCS处理3-6 h,用Western blot可以见到LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化;采用荧光双标记的LC3质粒可以检测到TCS或PAP处理后Hela、HepG2和L929细胞有明显的自噬体的形成现象。这些结果说明TCS引起的细胞凋亡过程伴随自噬的产生,PAP也有类似的作用。用MTT试验表明:溶酶体蛋白酶抑制剂氯喹可以协同TCS的细胞毒性,而自噬激活剂雷帕霉素可以拮抗TCS的细胞毒性。用siRNA干扰自噬基因Atg 5、Atg 7和Beclin。结果表明Atg 5和Beclin基因Knock-down细胞对TCS的敏感性显着增高,细胞毒性分别升高4.16和1.87倍,说明自噬在TCS引起的凋亡过程中起到保护细胞的作用。结论(1)发现天花粉蛋白可以抑制多种肿瘤细胞的生长,其抗肿瘤作用是通过双重机制即细胞周期阻滞和诱导凋亡来实现的;(2)天花粉蛋白可以引起明显的内质网应激,可以诱导CHOP蛋白和BIP蛋白的表达;(3)天花粉蛋白可以通过内质网应激,促进TRAIL受体DR5的上调,增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性;(4)天花粉蛋白可以引起细胞的自噬现象,蛋白酶抑制剂氯喹可以增加TCS的细胞毒性,自噬在天花粉蛋白诱导的凋亡过程中对细胞具有保护作用。(5)氯喹、TRAIL与TCS联合应用,可以增加TCS的抗肿瘤作用,具有潜在的临床应用价值。上述研究成果,为研究天花粉蛋白以及类似单链RIPs的抗肿瘤作用的分子机理提供了新的思路,具有理论意义和潜在的临床应用价值。
参考文献：
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