朱海峰（山东省泰安市第四人民医院检验科 山东泰安 271000）
【摘要】目的 对生物芯片化学发光免疫法在检测人TSH和T4中的价值进行评价分析，为今后的临床研究工作提供可靠的参考依据。方法 建立生物芯片化学发光免疫法，采集15例患者血清展开TSH和T4水平检测，并对测定结果进行统计分析。结果 所建立的生物芯片化学发光免疫法检测TSH的灵敏度为0.096mIU/L，T4的灵敏度为4.5ng/ml，线性关系良好，TSH的回收率在91%-101%之间，T4的回收率在92%-103%之间，检测结果准确。结论 采取生物芯片化学发光免疫法对人体血清中TSH和T4水平进行检测时具有较高的灵敏度、线性关系良好，回收率与准确性高，值得关注并推广。
【关键词】生物芯片化学发光免疫法 人体血清 促甲状腺激素 甲状腺激素
【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）39-0014-02
【Abstract】objective to biochip, chemiluminescence immunoassay in detecting TSH and makes an analysis of the value of T4, provide reliable reference for future clinical research work. Method to establish the biological chip, chemiluminescence immunoassay, collection of 15 patients with serum TSH and T4 level detection, and the measurement results were analyzed. Results of biochip, chemiluminescence immunoassay detection is 0.096 mIU/L of the sensitivity of TSH T4 sensitivity of 4.5 ng/ml, good linear relationship, the recovery rate of TSH between 91% and 101%, the recovery rate of T4 between 92% and 103%, test results are accurate. Conclusion the method of biochip chemiluminescence immune detecting a human serum TSH and T4 levels with high sensitivity, good linearity, high recovery rate and accuracy, worthy of attention and promotion.
【Key words】biochip, chemiluminescence immunoassay human serum thyrotropin thyroid hormone
近几年有学者为了实现快速、灵敏、低成本的检验目的，在生物芯片上展开化学发光免疫分析实验[1]。本次研究中出于对生物芯片化学发光免疫法在检测人促甲状腺激素（TSH）和甲状腺激素（T4）中的价值进行评价分析的目的，对生物芯片化学发光免疫法进行了建立，并对15例患者的血清TSH、T4水平进行了检测，现汇报结果如下。
1 仪器与试剂
1.1 实验仪器
BPCL微弱发光测量仪、自制圆环通道生物芯片、0.5-10ul可调定量加样器、85-1磁力搅拌器、HWY-501循环恒温水浴、85-2型恒温磁力搅拌器、电子节能控温仪、真空干燥箱、KQ3200超声波清洗器。
1.2 实验试剂
TSH标准浓度血清，异硫氰酸荧光素(FITC)标记TSH单克隆抗体、牛肠碱性磷酸酶(ALP)标记的TSH抗体、偶联FITC抗体的磁性分离剂，牛血清白蛋白、氯化镁为分析纯、二乙醇胺为化学纯、磁粉。
1.3 溶液的配制
DEA洗涤液的配制：取10.51gDEA，将其溶解在800ml的纯化水中，而后加入1ml1MMgCl2溶液和0.2g的氯化钠，几个氢氧化钠调节pH值在9.8-10之间，经0.2um的过滤器对配制溶液进行过滤。
充填缓冲液的配制：0.1molL/Tris-HCl-0.05%,pH7.4。
封闭液的配制：含0.1%小牛血清白蛋白的充填缓冲液。
底物稀释液的配制：pH值为9.18的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液。
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2 方法与结果
2.1 TSH检测体系实验条件的确定
2.1.1 碱性磷酸酶与底物量的适宜比例
经pH为9.15的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液将碱性磷酸酶稀释成不同浓度的溶液，使用底物PPD工作浓度200ul在试管内，加入10ul的固定酶，混匀后在BPLC微弱化学发光监测以上对发光值进行观察，记录发光值平衡时的数据[2]。结果表明，在碱性磷酸酶浓度在6,4×10-10M与6.4×10-llM范围之间时,酶与底物的比例最为适宜。
2.1.2 芯片式检测法的实验操作方法
实验中经适合与免疫反应的微流控生物芯片，在圆环型的反应池中，线经浓度为1%的BSA溶液进行封闭，在37℃条件下孵育20分钟，而后加入2ul抗原、4ul的抗体以及0.5Ul磁粉，在外加旋转磁场的作用下磁粉旋转会使抗原-抗体的混合加速，在24℃条件下反应7分钟而后加入2ul的磁珠分离液，在外加旋转磁场的左右下常温混合5分钟。在外加磁场的作用下，经滤纸将反应池中的液体吸出，而后经DEA洗涤液进行反复洗涤。在反应池中加入底物AMPPD溶液后，在外加磁场的作用下常温反应5分钟，而后经BPCL微弱发光测量仪对化学发光信号进行测量，记录数据[3]。
2.1.3 灵敏度实验
采取最低检测限的方法对灵敏度进行计算，经计算TSH 0mIU/L的标准差为0.03212,3倍标准差作为灵敏度，结果为0.096mIU/L。
2.1.4 标准曲线的制备
经芯片法对TSH的线性范围进行检测，测定结果表明TSH浓度在0.094-500.094mIU/L之间存在良好的线性关系，变异系数在2.4%-10.2%之间。
2.1.5 回收实验
对回收率进行检测，发现TSH回收率在91%-101%之间，平均回收率为98.2%。
2.1.6 样品测定
采集以上统计的15名临床患者血清标本，以上述建立方法展开TSH水平检测，具体步骤为：①芯片的前处理。②经浓度为1%的BSA溶液对反应池进行封闭。③洗涤。洗涤结束后取10ul底物加入到试管中，经磁力搅拌器搅拌5分钟，最后经BPCL微弱发光测量仪对化学发光信号进行测定[4]。结果发现，本次实验方法与磁性分离酶联免疫法联合化学发光法的试管检测之间存在良好的线性关系，YTSH=1.034XTSH-0.889，r=0.9892。YTSH为磁性分离酶联免疫法联合化学发光法检测TSH，XTSH为本次实验方法检测TSH。
2.2 T4检测体系实验条件的确定
2.2.1 芯片式检测法的实验操作方法
实验中经适合与免疫反应的微流控生物芯片，在圆环型的反应池中，线经浓度为1%的BSA溶液进行封闭，37℃条件下孵育20分钟，而后加入1ul抗原、4ulT4衍生物和4ul抗体，最后加入0.5ul的磁粉，在外加磁场的作用下磁粉旋转使抗原-抗体的结合更加迅速，而后加入2ul的磁珠分离液，常温下旋转作用5分钟，经滤纸将反应池中的液体吸干，经DEA洗涤液进行反复冲洗。在反应池中加入10ul底物，外加磁场作用下常温反应5分钟，经BPCL微弱发光测量仪对化学发光信号进行测量分析。
2.2.2 灵敏度测定
采取最低检测限法对T4检测灵敏度进行检测，结果得低浓度T4的0ng/ml血清标准差为2.7ng/ml，灵敏度为4.5ng/ml。
2.2.3 标准曲线的制备
在最佳状态下，经芯片法对T4线性范围进行测定，结果发现，T4浓度在20-150ng/ml之间存在良好的线性关系，变异系数为4.85%。
2.2.4 回收实验
对回收率进行检测，结果发现T4的回收率在92%-103%之间，平均回收率为99.4%
2.2.5 样品测定
对上述统计的15例患者血清展开T4水平测定，结果发现，本次实验方法与磁性分离酶联免疫法联合化学发光法的试管检测之间存在良好的线性关系，YT4=0.99X T4-2.25，r=0.9981. Y T4为磁性分离酶联免疫法联合化学发光法检测T4，X T4为本次实验方法检测T4。
3 讨论
生物芯片化学发光免疫检测方法具有直接、间接检测的可能性，值得对其给予关注，展开进一步的研究进行探索。
研究中在化学发光与免疫检测基础上同微流控芯片技术进行有机结合，从而构筑了理想的生物芯片化学发光免疫检测法，并成功对TSH和T4水平进行了检测，该方法在检测过程中使用磁粉，能够加快检测速度，缩短反应时间，且该实验方法的检测结果与磁性分离酶联免疫法联合化学发光法的试管检测之间存在良好的线性关系，具有较高的可靠性[5]。
参考文献
[1] 马连学.游离前列腺特异抗原免疫放射分析方法的建立[J].同位素,2009,23(01):445-446.
[2] 王颖.生物芯片技术及其应用研究[J].科学教育,2010,17(01):221-223.
[3] 惠国华,赵子恺.液相芯片技术在生物医学工程领域的研究进展[J].生物医学工程学杂志,2010,17(06):982-983.
[4] 颜多清.化学发光与酶联免疫检测血清甲胎蛋白的比较[J].中国社区医师(医学专业半月刊),2009,24(17):187-188.
[5] 施丽娟,张建明.化学发光免疫分析技术及在临床检验中的应用[J].检验医学与临床,2012,17(04):452-454.
论文作者:朱海峰
论文发表刊物:《中外健康文摘》2013年第39期供稿
论文发表时间:2014-4-8
标签：免疫论文; 化学论文; 血清论文; 溶液论文; 灵敏度论文; 回收率论文; 线性论文; 《中外健康文摘》2013年第39期供稿论文;