谭先杰[1]2000年在《子宫内膜异位症血管形成调控分子的研究》文中研究说明子宫内膜异位症血管形成调控分子的研究 研究背景 子宫内膜异位症(内异症)是一种常见而棘手的妇科疾病，大约有10％的育龄妇女罹患此病。尽管内异症的发病机理有多种学说，但异位灶的发生发展必须要有新生血管提供血液，故血管形成在内异症的发病中具有重要作用。血管形成是一涉及多种细胞及多种分子的复杂过程，受到多种因素的调控。血管内皮生长因子(VEGF)是一种关键的血管形成刺激因子，而血小板反应素-1(TSP-1)则是一种内源性血管形成抑制因子，这两种分子在肿瘤血管形成和转移中有重要作用。内异症尽管也有明显的血管形成，但其血管形成的分子机制尚不清楚。因此研究调控血管形成的一些重要分子在内异症中的表达及其调节，对认识其发病将有重要意义，并可能从抑制血管形成着手探索新的治疗内异症的方法。 研究目的 1 从蛋白和核酸水平检测VEGF及TSP-1在子宫内膜异位病灶及在位内膜中的表达情况，比较不同类型异位病灶之间及内异症患者的在位内膜与非内异症患者的子宫内膜之间上述分子表达的差异，探讨VEGF及TSP-1在内异症血管形成中的作用；2 子宫内膜基质细胞及腺上皮细胞的分离培养及鉴定，建立内异症的体外模型；3 以体外培养的子宫内膜基质细胞为研究对象，研究雌孕激素及细胞因子对VEGF及TSP-1表达的影响，探讨这些因素在内异症发病机理及血管形成中的作用。 材料、方法及结果 一 VEGF及TSP-1在内异症中的表达 38例RAFS Ⅰ-Ⅳ的内异症患者作为研究组，25例非内异症的妇女作为对照组。共收集了32份卵巢巧克力囊肿、12例腹膜红色病变、8例宫骶韧带结节，同时采取了30
熊文倩[2]2016年在《雌激素介导的Wnt/β-catenin信号通路调控子宫内膜异位症上皮间质转化的作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的：(1)研究子宫内膜异位症中是否存在上皮-间质转化现象；(2)研究雌激素在内异症EMT发生中的作用以及Wnt/β-catenin通路在雌激素促进内异症EMT发生中的作用；(3)探讨雌激素介导Wnt/β-catenin信号通路调控子宫内膜异位症EMT的分子机制。方法：(1)收集明确诊断内异症患者的在位和异位子宫内膜以及单纯因输卵管因素的不孕症患者子宫内膜(对照组),利用免疫组织化学方法检测EMT分子标志物E-cadherin、 N-cadherin和Vimentin以及核转录因子β-catenin、Snail在内异症在位(EU)和异位子宫内膜(EC)以及正常子宫内膜(NOR)中定位表达情况；(2) QRT-PCR和Western blotting检测内异症患者EU和EC以及NOR中EMT分子标志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin以及核转录因子P-catenin和Snail的表达;(3)分离、培养原代人子宫内膜腺上皮细胞(Endometrial epithelial cells, EECs);以不同浓度(10-6、10-8mol/L)17β-雌二醇作用EECs 48h, qRT-PCR和Western blotting检测上皮细胞EMT标记物E-cadherin,间质表型标记物N-cadherin和E-cadherin转录抑制因子Snail的表达以及去磷酸化P-catenin的表达；光镜下观察细胞的形态变化；检测EECs体外粘附、侵袭与迁移能力；(4)分离、培养原代人子宫内膜腺上皮细胞(Endometrial epithelial cells, EECs), 10-6mol/L 17p-雌二醇作用EECs 48h,免疫荧光检测P-catenin的入核情况；Western blotting检测上皮细胞去磷酸化P-catenin的表达；(5)高分化子宫内膜腺癌细胞,即Ishikawa细胞代替EECs。以不同浓度(10-6、10-8mol/L) 17β-雌二醇作用Ishikawa细胞48h, qRT-PCR和Western blotting检测Ishikawa细胞EMT标记物E-cadherin、N-cadherin和E-cadherin转录抑制因子Snail以及去磷酸化P-catenin的表达;(6)利用siRNA靶向沉默Ishikawa细胞的P-catenin基因以阻断Wnt/β-catenin信号通路,以10-6mol/L 17β-雌二醇作用48h, Western blotting检测EMT标记分子物E-cadherin,间质表型标记物N-cadherin以及E-cadherin转录抑制因子Snail的表达；检测Ishikawa细胞体外粘附、侵袭与迁移能力；(7)分别构建Snail启动子荧光素酶报告基因载体,在Ishikawa细胞中应用共转染与双荧光素酶方法(Dual-luciferase Assay)分析β-catenin TCF/LEF对Snail基因靶启动子区域转录活性的影响；染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation)实验研究β-catenin/TCF/LEF对Snail基因启动子区域是否存在直接作用；(8)构建子宫内膜异位症NOD-SCID鼠模型,运用β-catenin siRNA阻断Wnt/p-catenin信号通路,观察雌激素对小鼠模型异位内膜EMT分子标志物E-cadherin、N-cadherin,核转录因子Snail的表达以及基质金属蛋白酶9 (Matrix metalloproteinases 9, MMP9)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)表达的影响。结果：(1)内异症患者EC中E-cadherin的表达较EU和NOR明显降低,而EU和NOR中E-cadherin的表达无显著差异；EC中N-cadherin、Vimentin的表达较EU和NOR明显增高,而EU和NOR中N-cadherin、Vimentin的表达无显著差异；EC中P-catenin和Snail的表达较在EU和NOR明显增高,而EU和NOR中P-catenin和Snail的表达无显著差异,β-catenin和Snail的表达存在正相关性；(2) QRT-PCR和Western blotting结果显示内异症患者EC中E-cadherin mRNA和蛋白的表达较EU和NOR明显降低,而N-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白的表达较EU和NOR明显增高;EC中β-catenin和Snail mRNA和蛋白的表达较EU和NOR明显增高；(3)以不同浓度17p-雌二醇(17β-E2)作用人子宫内膜腺上皮细胞(EECs) 48h;普通光学显微镜下观察,17β-E2作用后,细胞接近纺锤状,纤维样的形态,细胞间连接由紧密变得分散；免疫细胞化学结果显示17β-E2作用后,EECs中E-cadherin表达下降；qRT-PCR和Western blotting结果显示雌激素体外能明显促进EECs中N-cadherin、 β-catenin和核转录因子Snail的表达,抑制E-cadherin的表达；Transwell表明17β-E2增强EECs的侵袭与迁移能力；(4)雌激素能明显增加EECs中去磷酸化β-catenin的表达；免疫荧光结果表明雌激素能增加β-catenin的入核;(5)高分化子宫内膜腺癌细胞,即Ishikawa细胞代替EECs。以不同浓度(10石、10-8mol/L) 17β-雌二醇作用Ishikawa细胞48h, qRT-PCR和Western blotting结果显示雌激素体外能明显促进Ishikawa细胞N-cadherin、β-catenin和核转录因子Snail的表达,抑制E-cadherin的表达；(6) siRNA靶向沉默Ishikawa细胞β-catenin基因以阻断Wnt/β-catenin信号通路,10-6mol/L 17β-雌二醇作用48h, Western blotting结果显示雌激素不能够诱导EMT的发生,即E-cadherin表达没有下降,N-cadherin和Snail的表达没有上升；Transwell表明Ishikawa细胞的侵袭与迁移能力明显降低；(7)双荧光素酶和染色质免疫共沉淀检测结果显示β-catenin能与TCF3结合,作用于Snail启动子上游,正向调控Snail基因的表达,而雌激素能增强这一作用；(8)术后10天,Scrambled siRNA+E2、β-catenin siRNA+E2和空白组的模型鼠异位病灶发生率分别为：75%、25%和0；术后21天,Scrambled siRNA+E2、β-catenin siRNA+E2和空白组的模型鼠异位病灶发生率分别为：64%、0和0；雌激素能够增加异位病灶的种植率,而抑制β-catenin的表达后,种植的概率明显降低；Western blotting结果显示：术后10天,阴性siRNA组E-cadherin的表达低于siRNA干扰组和种植前组；N-cadherin、β-catenin和核转录因子Snail的表达高于siRNA干扰组和种植前组；术后21天,阴性siRNA组E-cadherin的表达低于种植前组；N-cadherin、β-catenin和核转录因子Snail的表达明显高于种植前组；IHC结果显示：术后10天,VEGF和MMP9表达高于siRNA干扰组和种植前组,而后两者之间无显著差异；术后21天,VEGF和MMP9表达明显高于种植前组。结论：(1)上皮-间质转化(EMT)参与了异位子宫内膜的侵袭和转移,促进了内异症的形成和发展；(2)雌激素在内异症EMT发生中起着关键作用,其机制是通过Wnt/β-catenin信号通路的激活来抑制E-cadherin表达,促进EMT生成。
董文韬[3]2008年在《血管生成素-2和内皮抑素在子宫内膜异位症表达的研究》文中指出目的研究血管生成素-2(angiopoietin-2,Ang-2)和内皮抑素(endostatin,ENS)在子宫内膜异位症患者的血清、腹腔液及组织中的表达,探讨其与子宫内膜异位症的发病关系,为内异症的治疗提供理论依据。方法实验一:选择25例EMs病人作为研究组,其中增生期15例,分泌期10例;r-AFS内异症分期中Ⅰ～Ⅱ期13例,Ⅲ～Ⅳ期12例。28例同期非内膜疾病妇女作为对照组,其中增生期15例,分泌期13例。均留取子宫内膜,采用免疫组化染色方法检测Ang-2和ENS在研究组异位、在位内膜及对照组正常内膜中的表达。实验二:选择30例EMs病人作为研究组,其中增生期16例,分泌期14例;r-AFS内异症分期:Ⅰ～Ⅱ期16例,Ⅲ～Ⅳ期14例。30例同期非内膜疾病妇女作为对照组,其中增生期16例,分泌期14例。均留取血清及腹腔液,采用酶联免疫吸附测定法检测两组患者血清及腹腔液中Ang-2和ENS的蛋白含量。结果实验一:1.Ang-2蛋白主要定位于子宫内膜腺上皮细胞的胞浆中,间质细胞及血管内皮细胞中也有不同程度的表达,但表达较弱,不计入评分。Ang-2在研究组在位内膜中的表达高于异位内膜和对照组,差异有统计学意义;异位内膜组高于对照组,差异亦有统计学意义。研究组在位内膜Ang-2的表达:分泌期高于增生期,差异有统计学意义;对照组中正常内膜的Ang-2表达:分泌期亦高于增生期,差异亦有统计学意义。Ang-2表达强度与r-AFS内异症分期无明显相关性。2.ENS蛋白主要定位于子宫内膜腺上皮细胞的胞浆中,间质细胞及血管内皮细胞中也有不同程度的表达,但表达较弱,不计入评分。ENS在研究组异位内膜中的表达高于在位内膜和对照组,差异有统计学意义;在位内膜组高于对照组,差异亦有统计学意义。研究组在位内膜的ENS表达:分泌期与增生期差异无显著性;对照组中正常内膜的ENS表达:分泌期与增生期差异无显著性。r-AFS内异症分期比较,Ⅲ～Ⅳ期患者在位内膜中ENS表达量高于Ⅰ～Ⅱ期患者,差异有统计学意义。实验二:EMs组中血清、腹腔液的Ang-2、ENS含量和Ang-2/ENS比值均显著高于对照组中各自的含量;r-AFS分期中Ⅲ～Ⅳ期患者血清、腹腔液的Ang-2、ENS含量均高于Ⅰ～Ⅱ期患者,Ⅲ～Ⅳ期腹腔液Ang-2/ENS比值低于Ⅰ～Ⅱ期,血清Ang-2/ENS比值Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期无显著性差异;腹腔液Ang-2含量显著高于血清含量,而腹腔液ENS含量却低于血清含量,血清Ang-2和ENS的含量分别与其腹腔液含量呈正相关;研究组和对照组分泌期与增生期上述因子的含量比较无显著性差异。结论1.Ang-2在内异症的在位内膜表达明显高于异位内膜及对照组内膜,说明在位内膜可能具有更强的血管生成活性,符合“在位内膜决定论”学说;ENS在内异症的异位内膜表达明显高于在位内膜及对照组内膜,说明种植成功的内膜中可能具有更强的血管抑制能力以限制异位病灶的扩散。由于Ang-2和ENS均由内皮细胞分泌,两者可能在Hanahan等提出的“血管生成的开关平衡假说”中分别发挥作用。2.Ang-2在内异症及对照组分泌期子宫内膜表达均增强,而ENS在分泌期、增生期表达无显著差异,说明分泌期内膜更容易在异位种植,血管生成的调控可能与激素水平有关。3.内异症患者血清、腹腔液的Ang-2、ENS均呈高表达,腹腔液Ang-2含量显著高于血清含量,但腹腔液ENS含量却低于血清含量,说明二者可能通过全身内分泌途径参与内异症的血管生成过程,而腹腔微环境参与调解异位病灶的生长和进展。亦同时说明盆腹腔的血管生成活性可能强于远处组织和器官,利于逆流入腹腔的子宫内膜碎片的种植。二者在血清的表达增高,推测可作为临床诊断指标,但其特异性、稳定性如何尚需大样本实验证实。4.Ang-2和ENS在内异症中的表达无相关性,说明二者之间无直接相互作用,可能是二者分别通过两种途径对内异症发挥作用,也可能与样本例数偏少有关,尚需大样本实验进一步证实。
艾星子·艾里[4]2006年在《新疆维、汉民族子宫内膜异位症相关差异基因及蛋白的初探和内异症相关因子的研究》文中研究说明研究目的： 1．运用Atlas~(TM)cDNA Expression Arrays(Clontech #7854-1)基因表达谱芯片(含有22000条cDNA)初步研究新疆维吾尔族子宫内膜异位症和汉族子宫内膜异位症患者在位子宫内膜基因表达的差异，从分子水平探讨子宫内膜异位症发病的民族差异性，从而为新疆维吾尔族妇女子宫内膜异位症病因、诊断及治疗的研究提供科学的理论根据。 2．本研究的目的即是结合现代蛋白组学研究方法，通过双向电泳和蛋白质谱技术筛选新疆地区维吾尔族、汉族子宫内膜异位症的相关差异蛋白，分析民族之间的蛋白差异点，进一步指导临床用药。 3．本研究运用ELISA和Northern杂交分析17-β estradiol(E2)和interleukin(IL)-1β对体外培养的子宫内膜间质细胞上血管生成因子VEGF和血管生成抑制因子血小板反应素TSP1 mRNA在刺激组和非刺激对照组表达上的差异，探讨17-β estradiol(E2)和interleukin(IL)-1β在异位内膜血管生成中的调节作用。 研究方法： 1．从液氮中取出组织标本，迅速称重，低温下陶瓷碾体将组织碾碎，按每50～100MG组织加入1MLTRIzol，选择适当匀浆强度，电动匀浆数十秒，匀浆液室温放置5分钟后，按每1 TRIzol加0.2ML氯仿的比例加入氯仿，用力颠倒混匀15秒钟，室温放置5分钟；4℃，
潘建青[5]2006年在《雷公藤内酯醇对激活巨噬细胞表达血管活性分子的影响》文中研究表明目的观察雷公藤内酯醇对巨噬细胞表达的血管活性分子：VEGF、TNF-、IL-8的影响，为研究雷公藤内酯醇治疗内异症的作用机理提供实验依据。方法1、分离、纯化小鼠腹腔巨噬细胞（M），以脂多糖(LPS)激活，与不同浓度TP进行不同时间共培养。2、以免疫组化法检测M合成VEGF的水平。3、以间接MTT法检测M培养上清中的TNF-活性。4、以ELISA法检测M培养上清中的IL-8浓度。5、利用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）法检测M表达VEGF mRNA、TNF- mRNA和IL-8 mRNA的水平。结果1.雷公藤内酯醇在1～10ug/ml范围可以抑制LPS诱导的巨噬细胞VEGF、TNF-、IL-8合成。2.雷公藤内酯醇在1～10ug/ml范围可以抑制LPS诱导的巨噬细胞VEGF mRNA、TNF- mRNA和IL-8 mRNA的表达水平。结论雷公藤内酯醇抑制巨噬细胞VEGF、TNF-和IL-8的表达，这种抑制作用可能是其治疗子宫内膜异位症的作用机理之一，为临床治疗子宫内膜异位症提供一定的实验依据。
任旭[6]2007年在《缺氧诱导因子-1α在子宫内膜异位症中的表达及其与血管生成的关系》文中研究说明缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α)是介导细胞对缺氧微环境适应反应的关键性调控因子。研究证实它在多种恶性肿瘤及癌前病变中过度表达，被认为是肿瘤血管生成环节中的核心启动分子，在肿瘤侵袭的新生血管形成过程中有重要作用。VEGF(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种内皮细胞专一性丝裂原和血管新生强烈的刺激因子，是目前知道的最强烈的血管生成促成因子。研究发现，它是诱导肿瘤血管生长的关键因子，可直接而特异地作用于血管内皮细胞，导致新生血管形成。VEGF的表达受多种因素的调控，缺氧是最强的诱导VEGF表达的因素。子宫内膜异位症(endometriosis，EM或内异症)是一种具有肿瘤生物学特性——向远处转移和侵袭的良性疾病。血管生成(Angiogenesis)不仅在正常子宫内膜的生长修复中起作用，而且在内异症的发生发展中占有重要的位置。研究表明，大量新生血管的生成可能是子宫内膜在异位部位种植、生长从而导致内异症发病的关键。目的：本文采用免疫组织化学法，检测内异症异位、在位内膜及正常内膜组织中HIF-1α、VEGF以及CD34标记的微血管密度(microvessel density，MVD)的表达，探讨HIF-1α与内异症血管生成的关系及其在内异症发病机制中的作用。材料与方法：研究组：68例异位内膜组织标本(内异症组)来自南方医科大学珠江医院妇产科2003年5月～2006年5月因内异症而行手术的病人，采用修订后的美国生育协会内异症分期评分法(r-AFS)对患者进行分期，Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期33例，镜下均为低纤维化并可见到腺体及间质，其中增殖期35例，分泌期33例。20份内异症在位内膜取自上述同时行子宫切除的病人，增殖期11例，分泌期9例。对照组：20例为同期非内异症、非子宫内膜疾病(如子宫肌瘤或子宫纵隔)行子宫全切术或诊断性刮宫，病理证实为正常子宫内膜的标本，其中增殖期10例，分泌期10例。所有标本均经苏木素-伊红(HE)染色和病理确诊。月经周期划分根据末次月经及子宫内膜病理检查结果确定。研究组与对照组年龄、体重、内膜分期的差别无统计学意义。两组月经规律，无内科合并症及免疫性疾病，术前6个月均未使用过激素类药物和未放置宫内节育器。应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接法(SP法)，检测HIF-1a蛋白在内异症组及对照组中的表达，同时检测VEGF、MVD在上述组织中的表达。统计学处理采用SPSS13.0软件包行检验分析，所有结果均以P＜0.05为有统计学意义。MVD结果以均数±标准差((?)±s)表示，采用One-way ANOVA、t检验、非参数检验等，相关性分析采用Spearman等级相关分析。结果：1．HIF-1α的表达：HIF-1α阳性表达主要见于异位内膜组织腺上皮细胞胞浆内，个别异位内膜间质亦可有表达，正常子宫内膜、在位子宫内膜、异位子宫内膜中的阳性表达率分别为0％(0／20)，20％(4／20)，91.18％(62／68)，异位、在位与正常子宫内膜中HIF-1α蛋白的表达水平经统计学分析，其差异有统计学意义(x~2=63.843，P=0.000)。内异症患者的异位子宫内膜中，HIF-1α的表达在增生期与分泌期无显著性差异(Z=-0.663，P=0.507)；在位子宫内膜中HIF-1α的表达在增生期与分泌期亦无显著性差异(Z=-0.219，P=0.827)。内异症异位内膜与对照组相比，异位内膜表达强度显著高于正常子宫内膜(Z=-9.637，P=0.000)；内异症异位内膜与在位内膜相比，异位内膜表达强度显著高于在位内膜(Z=-7.592，P=0.000)；内异症在位子宫内膜与对照组相比，在位内膜表达强度显著高于正常内膜(Z=-3.593，P=0.000)。Ⅰ～Ⅱ期内异症患者与Ⅲ～Ⅳ期患者表达强度比较，其差异无统计学意义(Z=-0.570，P=0.569)。2．VEGF的表达：VEGF主要定位于腺上皮细胞的胞质中，VEGF阳性表达率在内异症异位、在位、正常子宫内膜分别为64.7％(44／68)、15％(3／20)、5％(1／20)。异位、在位与正常子宫内膜中VEGF蛋白的表达水平经统计学分析，其差异有统计学意义(x~2=27.318，P=0.000)。内异症异位子宫内膜中VEGF的表达在增生期与分泌期无显著性差异(Z=-0.748，P=0.455)；内异症在位子宫内膜中VEGF的表达在增生期与分泌期无显著性差异(Z=-0.283，P=0.777)；正常子宫内膜中VEGF的表达在增生期与分泌期无显著性差异(Z=-1.000，P=0.317)。内异症异位子宫内膜与对照组相比，异位内膜表达强度显著高于正常子宫内膜(Z=-4.660，P=0.000)；内异症异位内膜与在位内膜相比，异位内膜表达强度显著高于在位内膜(Z=-3.077，P=0.002)；内异症在位子宫内膜与对照组相比，在位内膜表达强度高于正常内膜(Z=-2.088，P=0.037)。Ⅰ～Ⅱ期内异症患者与Ⅲ～Ⅳ期患者比较，VEGF表达强度比较无显著性差异(Z=-0.077，P=0.939)。3．MVD的表达：不同子宫内膜中MVD表达的差异有统计学意义(F=1786.330，P=0.000)。增生期与分泌期的MVD相比，差异无统计学意义(F=0.065，P=0.800)。内异症异位子宫内膜中MVD的表达在增生期与分泌期无显著性差异(t=-1.784，P=0.079)；内异症在位子宫内膜中MVD的表达在增生期与分泌期无显著性差异(t=0.378，P=0.703)；正常子宫内膜中MVD的表达在增生期与分泌期无显著性差异(t=0.135，P=0.894)。增生期时各组子宫内膜中的MVD差异显著(F=1022.06，P=0.000)；分泌期时各组子宫内膜中的MVD差异亦显著(F=789.045，P=0.000)。内异症异位内膜的MVD显著高于正常内膜(t=51.020，P=0.000)；内异症异位内膜的MVD显著高于在位内膜(t=42.568，P=0.000)；内异症在位子宫内膜的MVD高于正常内膜(t=6.190，P=0.000)。Ⅰ～Ⅱ期内异症患者与Ⅲ～Ⅳ期患者相比，MVD表达水平无显著性差异(t=0.496，P=0.593)。4．HIF-1α的表达与VEGF、MVD之间的相关性：MVD与HIF-1α的表达水平呈显著正相关(r=0.777，P=0.000)；MVD与VEGF的表达水平亦呈显著正相关(r=0.639，P=0.000)；VEGF与HIF-1α的表达水平呈显著正相关(r=0.906，P=0.000)。结论：1．HIF-1α蛋白在内异症组织中异常高表达证明其与内异症密切相关。2．HIF-1α蛋白的表达与VEGF、MVD在内异症组织中的表达呈显著正相关。3．HIF-1α与VEGF可能共同促进了内异症的血管生成。
黄金燕[7]2012年在《人子宫内膜异位症血瘀证在位内膜差异蛋白质组学及免疫组化研究》文中研究指明研究背景：子宫内膜异位症(Endometriosis, EM)是育龄妇女的多发病,所引起的盆腔包块、痛经和为孕严重影响女性生殖健康和生活质量。证候是疾病一定阶段病因、病位、病性、病势的综合表现,是中医药理论研究的核心内容,开展中医“证”本质研究,揭示证候的科学内涵是中医基础理论现代化的关键环节,而证候生物学基础研究的突破则是证候科学内涵得以阐明的保障。血瘀证是中医临床各科的基本证型,也可见于多种妇科疾病中,同时也是子宫内膜异位症的常见证型。导师所带领的课题组已在前期研究中,提出了EM血瘀证以“湿瘀互结”为病机关键,并发现该证型的异位和在位内膜在组织形态学和细胞凋亡相关因子的表达存在差异,为从蛋白组学水平探索EM的不同证候的特异性标志物的研究工作奠定了基础。对子宫内膜异位症血瘀证进行深入、系统的现代研究,有助于对本病的准确诊断和有效治疗。蛋白质组学方法能够整体性、高通量地反映组织或细胞内蛋白质水平的变化,已成为目前研究疾病发病机制、筛选肿瘤标记物、寻找药物作用和基因干预靶点等的有力手段。目的：①通过蛋白组学技术分离并鉴定EM血瘀证、气滞血瘀证、肾虚血瘀证患者在位内膜的差异蛋白质,寻找EM证候特异性蛋白质；②应用免疫组化方法对EM血瘀证、气滞血瘀证、肾虚血瘀证患者在位内膜的血管生成相关因子(VEGF、Ang-2、Tie-2)、细胞凋亡相关因子(survivin、PCNA、Livin)、细胞周期调节因子(细胞周期蛋白D1、P16)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、T细胞调节因子(转录因子Foxp3)的表达进行检测,寻找其表达差异；③从蛋白质水平探讨EM血瘀证、气滞血瘀证、肾虚血瘀证的实质,揭示EM血瘀证辨证的分子生物学基础,建立EM的蛋白质分子微观辨证和诊断体系,探讨EM证候的演变规律、证候的辨治靶点,寻找有意义的分子标记物及基因干预的靶点；④为EM中医证候相关蛋白质库的建立奠定基础,为中医辨证的客观化和标准化提供实验依据,以规范中医辨证,提高中医辨证治疗的准确性和临床疗效,通过“治病求本”,实现“源头治疗”和“靶向治疗”。方法：分别取6例子宫内膜异位症血瘀证、气滞血瘀证、肾虚血瘀证患者增生期在位内膜组织和6例增生期正常子宫内膜组织标本,配对分为6组。提取组织总蛋白,通过双向电泳技术分离总蛋白,并得到6组双向电泳凝胶图谱。通过PDQuest7.1.1软件对图像进行裁剪、斑点检测和匹配分析,评价图像的匹配率,并检测出表达差异点。将差异点切下后进行胶上原位酶解,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)及蛋白质数据库检索进行蛋白质鉴定,在鉴定出的差异点中选择表达恒定,差异明显且稳定,质谱结果理想可靠的蛋白作为子宫内膜异位症血瘀证相关蛋白候选分子。采用免疫组织化学方法对VEGF、Ang-2、Tie-2、MIF、survivin、 PCNA、Livin、Cyclin D1、P16、Foxp3在子宫内膜异位症患者在位内膜与正常子宫内膜组织间的表达差异进行了研究,检测以上指标在18例子宫内膜异位症血瘀证在位内膜和6例增生期正常子宫内膜组织石蜡标本中的表达,对结果用Image pro-Plus5.0软件测定IOD值,应用统计学方法对其在子宫内膜异位症血瘀证、气滞血瘀证、肾虚血瘀证患者的在位内膜与正常组织间的表达差异性进行分析。结果：①得到6组分辨率高、重复性好的人子宫内膜异位症血瘀证、气滞血瘀证、肾虚血瘀证在位内膜与正常子宫内膜的双向电泳图谱,检测的平均斑点数为182±28,各组内两张胶的匹配率(%)平均为85.625±4.2。共筛选出66个差异点,胶上差异明显,重复次数在3次以上。经质谱分析和数据库检索成功鉴定出22个蛋白,质谱结果理想。对鉴定出的差异蛋白进行了功能和细胞定位的分析归类,这些差异蛋白的主要功能涉及细胞骨架、呼吸和脂肪代谢、细胞凋亡和增殖等方面。②免疫组化研究提示,Ang-2等10个指标在3种证型患者之间、患者与健康妇女之间表达情况的6组比较中,Ang-2、MIF、Foxp3有4组结果有显著性差异；VEGF、P16有3组结果有显著性差异；Livin、PCNA有2组结果有显著性差异；Cyclin D1、Tie-2有1组结果差异有显著性差异；survivin在各组均无显著性差异。结论：①根据蛋白质的不同等电点和分子量,通过双向凝胶电泳和质谱分析技术可以分离人EM患者及健康妇女在位内膜,利用分析软件,可发现EM血瘀证患者与健康妇女在位内膜之间有差异蛋白表达,这些差异蛋白可能成为EM发病的候选生物标志物。EM血瘀证、气滞血瘀证、肾虚血瘀证患者在位内膜之间蛋白质组成分存在差异,这些差异可能是证候实质的内在根源。②Ang-2、Foxp3、MIF可能是潜在的EM血瘀证及其主要相关复合证肾虚血瘀证、气滞血瘀证的辨证相关分子标志物；Survivin在各组的表达特异性较差,不适于作为指导诊断和辨证的备选分子。
刘木彪[8]2004年在《子宫内膜异位症患者血管内皮生长因子和内抑素表达的研究》文中提出研究背景 子宫内膜异位症(内异症)是育龄妇女的一种多发病。近年来发病率逐年提高，已达10％以上。主要引起不孕、痛经、性交痛及慢性盆腔痛等。目前诊断主要以微创的腹腔镜检查为金标准，缺乏有效的特异性生化指标；治疗方法主要有外科手术和甾体激素抑制等，但效果有限，副作用明显，且易复发，无法根治，故内异症虽属良性疾病，却影响了妇女的身体健康、生活质量和家庭稳定。制约内异症临床与基础研究的发展以及治疗效果差的主要原因在于发病机制仍不清楚。因此，内异症的发病机制已成为妇产科和基础学科的研究重点。近年来研究认为新生血管形成可能是内异症发生发展的基本条件。血管内皮生长因子(VEGF)和内皮抑素(ENS)分别作为其中最为重要的刺激因子和抑制因子，近年来对其在血管生成机制中的作用的研究已日益重视。已证实上述因子是调控恶性肿瘤的血管生成的关键性因子，但其是否同时参与内异症的血管生成调控过程尚不清楚。 目的 本研究旨在研究VEGF和ENS这两种重要的血管生成调控因子与内异症发病的关系，为下一步内异症抗血管生成治疗研究提供理论基础；并评价二者作为诊断性血清标记物的可能性，以寻找合适的内异症诊断和复发监测血清学指标。 方法与结果 1．采用半定量逆转录PCR技术检测VEGF和ENS在内异症异位、在位子宫内膜及非内异症妇女子宫内膜组织中的表达水平。结果发现内异症患者异位内膜病灶和在位子宫内膜组织中的VEGF mRNA、ENSmRNA的相对表达强度均显著高于非内异症子宫内膜；不同类型异位病灶组织中VEGF mRNA的表达量比较，腹膜红色病变＞卵巢子宫内膜异位囊肿＞宫骶韧带结节，但三者间的ENS mRNA表达量则无显著差异；内异症组分泌期在位内膜的VEGF mRNA相对表达量显著高于增殖期在位内膜，对照组中分泌期子宫内膜和增殖期子宫内膜则无显著差异。不同的RAFS临床分期比较，m一W期患者在位子宫内膜组织中ENS相对表达量明显高于I一11期患者，VEGF相对表达量则无显著差异。 2.采用EUSA测定内异症患者血清和腹腔液中VEGF和ENS的含量。结果发现内异症患者血清、腹腔液中VEG「、ENS表达量均显著高于对照组中各自的含量;不同的RAFS分期内异症中，晚期患者VEGF、ENS的含量和VIE比值均高于早期患者:腹腔液VEGF含量显著高于血清含量，而腹腔液ENS含量却低于血清，血清VEGF和ENS含量分别与其腹腔液含量呈l卜相关:研究对象和对照组的增殖期时上述因子的含量与分泌期含量比较无显著性差异:当以血清VEGF作为内异症诊断指标时，其ROC曲线下面积为0.867，选择1 75 pglml这一最佳l陆界点时，其灵敏度、特异度、丫ouden指数、阳性预测值和阴性预测值分别为0.92、0.84、0.75、0.82、0.90;当以血清ENS作为内异症诊断指标时，其ROC曲线下面积为0.801，选择90 nglm!这一最佳临界点时，其灵敏度、特异度、丫ouden指数、阳性预测值和阴性预测值分别为0 .91、0.82、0.75、0.87、0.93。结论 1.内异症患者血清、腹腔液和组织中均见VEGF和ENS的高表达，提示二者可能同时参与了内异症的血管生成过程，而两者表达水平的失衡可能才‘是新生血管形成的关键。 2.分泌期子宫内膜的血管生成活性增强可能是内异症发病的重要原因之一。 3.检测血清VEGF和ENS含量，对诊断内异症有很好的价值，建议将其作为临床诊断内异症的血清学诊断指标之一。
蒋红清[9]2007年在《抗血管生成治疗子宫内膜异位症的实验研究》文中提出目的：研究不同类型血管生成抑制剂对子宫内膜异位症(EMs)病灶生长行为及其血管生成的影响，探讨抗血管生成途径治疗EMs策略的可行性。方法：1．将EMs患者在位子宫内膜组织接种于8d胚龄的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上，建立EMs的CAM模型，分设接种组、接种治疗组和空白组。接种治疗组分别施予不同种类的血管生成抑制剂：重组人内皮抑素YH-16(5ug/20ul/d)、沙利度胺(thalidomide，10ug/20ul/d)、整合素avβ3单克隆抗体LM609(10ug/20ul/d)和血管内皮生长因子单克隆抗体(anti-VEGF，10ug/20ul/d)；接种组则施予相同剂量的PBS作为对照。接种后72h，通过显微血管计数、原位铺片及组织学观察等方法检测各组中接种的子宫内膜组织对CAM血管生成和四种抑制剂对异位内膜病灶生长行为的影响。2．将EMs患者在位子宫内膜组织种植于重度复合性免疫缺陷病(SCID)小鼠腹壁皮下，建立EMs鼠模型，分设治疗组和对照组。接种后第3周治疗组分别给予腹腔注射血管生成抑制剂YH-16(YH-16组，2mg/kg/d)、thalidomide(thalidomide组，50mg/kg/d)、LM609(LM609组，250ug/每周2次)和anti-VEGF(anti-VEGF组，3mg/kg/d)；对照组(PBS组)腹腔注射等体积的PBS，连用14d。每隔3d测量异位病灶体积一次；治疗结束后病灶组织称重，并采用免疫组化法测定微血管密度(MVD)和VEGF的表达。结果：1．在CAM模型实验中，接种组CAM血管生成反应明显增强，血管数目高于空白组(P＜0.01)；四个接种治疗组血管数目低于接种组(P＜0.01)；与接种组比较，接种治疗组病灶在光镜下可见腺体结构不完整，甚至腺体消失，间质伴有不同程度的坏死。2．在SCID鼠模型实验中，SCID小鼠皮下种植EMs模型内膜存活率高且观察方便；各治疗组病灶体积增长缓慢，并且YH-16组用药后期病灶体积有缩小趋势；YH-16组、LM609组和anti-VEGF组病灶重量及体积低于PBS组(P＜0.05)；光镜下可见各治疗组腺体萎缩，结构不完整，间质伴有不同程度的坏死；各治疗组MVD均显著低于对照组(P＜0.05)；YH-16组和anti-VEGF组的VEGF表达较对PBS对照组明显减少(P＜0.05)。结论：1．EMs患者在位子宫内膜具有促血管生成的潜能，这为子宫内膜能够在异位种植和存活提供了一个依据，其本身及周围组织新血供的建立和维持是子宫内膜异位种植存活和EMs发生的基本条件。2．血管生成抑制剂对EMs异位病灶的生长和血管生成有明显抑制作用，证实抗血管生成治疗EMs的策略具有可行性，将成为治疗EMs的有效手段之一。
范素鸿[10]2016年在《粘附分子VCAM-1和ICAM-1在子宫内膜异位症中的表达及意义》文中认为研究背景:子宫内膜异位症(简称内异症,endometriosis,EMs)在育龄期妇女中发病率高达10%～15%,近年来发病率有上升趋势。它是指具有生长能力的子宫内膜异位至子宫腔被覆内膜及宫体肌层以外的组织,常常伴有慢性盆腔痛、痛经、不孕等,目前发病机制仍未完全明确。子宫内膜异位症是一种良性疾病,却在侵袭、新生血管生成、增殖、凋亡等诸多方面与恶性肿瘤有极大相似性。现有的研究已经发现了 EMs患者腹腔内环境中的免疫细胞、细胞因子的变化,认为免疫机制异常在EMs的发生、发展过程中起着重要作用。子宫内膜腺上皮及基底膜均有多种细胞粘附分子(cell adhesion molecules,CAMs)的表达,越来越多的研究已证实某些CAMs的异常表达可能参与了 EMs的侵袭、粘附及种植过程。血管细胞粘附分子(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)和细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)是免疫球蛋白超家族家族中的两个重要成员,均为跨膜糖蛋白粘附分子,前者主要分布在激活的内皮细胞、树突状细胞上,只有在体内炎症的病理条件下,才表达于活化的血管内皮上;而后者除了表达在白细胞表面,还可以表达在子宫内膜上皮、间质细胞、血管内皮细胞。因此,我们推测VCAM-1和ICAM-1可能参与了子宫内膜异位症的发生发展过程,对异位内膜的种植、粘附、增殖发挥着重要作用。研究目的:通过检测VCAM-1和ICAM-1在子官内膜异位症(EMs)患者异位内膜、在位内膜、非EMs患者子宫内膜组织和血清中的表达,探讨VCAM-1和ICAM-1在子宫内膜异位发病过程中的作用及临床意义。材料与方法:收集我院盆腔子宫内膜异位症Ⅲ、Ⅳ期(根据r-AFs分期)患者的卵巢异位囊肿壁上的异位子宫内膜作为异位内膜组,其中行宫腔镜检查的子宫内膜作为对应的在位内膜组,选择同期因原发不孕、继发不孕症(输卵管因素,排除内异症)行宫-腹腔镜检查的患者,取其子宫内膜作为对照正常子宫内膜组。此外,选择腹腔镜手术并确诊的盆腔子宫内膜异位症患者术前血清作为血清病例组,选择同期因不孕症(输卵管因素,排除内异症)患者行腹腔镜手术的术前血清作为血清对照组。通过Real-time PCR检测VCAM-1mRNA及ICAM-1 mRNA在不同子宫内膜的表达;通过Western blot方法检测对VCAM-1及ICAM-1蛋白在不同子宫内膜中的表达并进行半定量分析;通过ELISA技术检测内异症患者及对照组血清中sVCAM-1及sICAM-1吸光度(OD值)并进行浓度计算。结果:1.Real-time PCR结果:VCAM-1mRNA在异位子宫内膜组与在位内膜组、对照组之间比较均有显著性差异,具有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。而在位内膜组与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。ICAM-1mRNA在异位子宫内膜组分别与在位内膜组、对照组比较有显著性差异,具有统计学意义(P<0.01,P<0.01),而在位子宫内膜组与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。2.Western blot结果:VCAM-1在异位子宫内膜组、在位内膜组及对照组之间两两比较均有显著性差异,具有统计学意义(P<0.01),表达的强弱顺序为:异位内膜组>在位内膜组>对照组。ICAM-1在异位子宫内膜组分别与在位内膜组、对照组比较有显著性差异,具有统计学意义(P<0.01,P<0.01),而在位子宫内膜组与对照组比较ICAM-1的相对表达量无统计学意义(P>0.05)。3.ELISA结果:根据OD值和标准曲线计算EMs患者血清中的sVCAM-1及sICAM-1平均浓度与对照组比较均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。sICAM-1浓度在Ⅲ、Ⅳ期组比Ⅰ、Ⅱ期组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。sVCAM-1在早期Ⅰ、Ⅱ期患者的血清浓度高于对照组(P<0.01),差异具有统计学意义。采用ROC曲线分析,血清中sICAM-1和sVCAM-1在诊断子宫内膜异位症患者中具有一定的准确性。其中,sICAM-1具有较高的特异性,敏感性偏低。结论:1.VCAM-1和ICAM-1通过在子宫内膜异位症患者中的mRNA水平、组织蛋白水平及血清中的高表达可能参与了子宫内膜异位症的发生、发展,在发病机制中具有重要作用。2.VCAM-1和ICAM-1在子宫内膜异位症患者的异位内膜和在位内膜组织蛋白中的表达无明显相关性,提示两者在子宫内膜异位症的致病机制可能是不同的。3.外周血sICAM-1和sVCAM-1在诊断子宫内膜异位症患者中具有一定的准确性。检测血清sICMA-1的浓度可以了解内异症的进展状况,可能成为诊断内异症的新方法。
参考文献：
[1]. 子宫内膜异位症血管形成调控分子的研究[D]. 谭先杰. 中国协和医科大学. 2000
[2]. 雌激素介导的Wnt/β-catenin信号通路调控子宫内膜异位症上皮间质转化的作用机制研究[D]. 熊文倩. 华中科技大学. 2016
[3]. 血管生成素-2和内皮抑素在子宫内膜异位症表达的研究[D]. 董文韬. 佳木斯大学. 2008
[4]. 新疆维、汉民族子宫内膜异位症相关差异基因及蛋白的初探和内异症相关因子的研究[D]. 艾星子·艾里. 新疆医科大学. 2006
[5]. 雷公藤内酯醇对激活巨噬细胞表达血管活性分子的影响[D]. 潘建青. 华中科技大学. 2006
[6]. 缺氧诱导因子-1α在子宫内膜异位症中的表达及其与血管生成的关系[D]. 任旭. 南方医科大学. 2007
[7]. 人子宫内膜异位症血瘀证在位内膜差异蛋白质组学及免疫组化研究[D]. 黄金燕. 成都中医药大学. 2012
[8]. 子宫内膜异位症患者血管内皮生长因子和内抑素表达的研究[D]. 刘木彪. 第一军医大学. 2004
[9]. 抗血管生成治疗子宫内膜异位症的实验研究[D]. 蒋红清. 中国人民解放军军医进修学院. 2007
[10]. 粘附分子VCAM-1和ICAM-1在子宫内膜异位症中的表达及意义[D]. 范素鸿. 浙江大学. 2016