凡文博1 逄利2 王立强3 周青阳3 王洪军3 吴扬（通讯作者）2
（1解放军208医院461临床部 吉林 长春 130021）
（2吉林大学第一医院 吉林 长春 130021）
（3沈阳军区联勤部疾病预防控制中心 辽宁 沈阳 110034）
【摘要】 目的：本文实验观察了虫草小分子肽对实验鼠机体生理功能安全的影响，为发挥虫草小分子肽的实用价值奠定科学参考依据。方法：急性毒性试验与蓄积毒性试验：采用LD50实验观察法和定期递增剂量蓄积系数法；致畸实验：采用小鼠髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸型试验。结果：虫草小分子肽经口急性毒性LD50大于10.00g/kg.bw与蓄积系数K>5；小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率与阴性对照组比较（2.40和1.60；P>0.05），小鼠精子畸形发生率与阴性对照组比较（1.66和1.56；P>0.05），均无显著性差异。结论：根据急性毒性分级，虫草小分子肽为无毒物质，试验用样品各剂量组未见对雄性小鼠骨髓嗜多染红细胞微核和小鼠精子畸形产生明显影响。
【关键词】 虫草小分子肽；毒理学；嗜多染红细胞；致畸实验
【中图分类号】R872.7, R828.71 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）32-0352-03
Experimental study on safety of Cordyceps peptide Fan Wenbo 1;Pang Li 2;Wang Liqiang 3;Zhou Qingyang 3;Wang Hongjun 3;Wu Yang 2*;1. No. 461 Clinical Division, 208 Hospital of PLA;Changchun, 130021;2. The First Hospital of Jilin University;Changchun, 130021;3. Centre of Disease Prevent and Control of Shenyang Command, Shenyang, 110034
【Abstract】 Objective The purpose of this experiment was carried out to observe the effect of Cordyceps peptide of the body's physiological function of mice safe, lay a scientific reference for play Cordyceps peptide practical value. Methods Acute toxicity test and accumulative toxicity test: the LD50 method of experimental observation and regularly increasing dose accumulation coefficient method; teratogenicity test: the mouse marrow eosinophil test micronucleus test and mouse sperm malformation. Results Cordyceps peptide oral acute toxicity of LD50 is greater than 10.00g/kg.bw and the accumulative coefficient K>5; mouse bone marrow polychromatic erythrocyte micronucleus rate compared with the negative control group (2.40 and 1.60; P>0.05), mice sperm malformation rate compared with the negative control group (1.66 and 1.56; P >0.05), there were no significant differences between the. Conclusion According to the classification of acute toxicity, Cordyceps peptide is a non-toxic substance, no sample test for each dose group of male mice bone marrow micronucleus of polychromatic erythrocytes of mouse sperm malformation and influence.
【Key words】 Cordyceps peptide; Toxicology; Polychromatic erythrocyte; Teratogenicity test
2009年5月卫生部正式批准北虫草，又名北冬虫夏草Cordyceps militaris (L.) Link、蛹虫草，为新资源食品。与冬虫夏草同属（Cordyceps）虫草真菌[1]，为子囊菌亚门（Ascomycota）、麦角菌科。其主要成分为虫草素、虫草多糖、虫草酸、超氧化物歧化酶（SOD）、氨基酸和微量元素等。具有免疫调节、抗癌、抗菌、补肾、调节肾上腺皮质醇含量、抗心律失常、抗疲劳、镇静催眠等生物功能[2-4]，使人工培植的北虫草功效越来越受到人们的关注。本文主要探讨了北虫草小分子肽的使用安全性，旨在为北虫草蛋白源小分子肽的进一步开发和利用提供科学依据。现将结果报告如下。
1.材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验材料和动物 试验用样品虫草小分子肽为淡黄色液体见图1、2（图2引自搜狐网）、3、4为本研究室自行研制。普通级昆明种小鼠和Wistar大鼠（辽实动质字[2000] 015号），购自中国医科大学实验动物繁殖中心。块状鼠料由沈阳市于洪区动物实验饲料厂提供[辽实动环字1999-024]。本实验室分笼饲养，颗粒饲料，自动进食饮水，适应1周后进行实验，动物实验室为全新风二级过滤，恒温恒湿，温度25±2℃，湿度50% ±10%，工作照度160-280LX，噪音<60dB，动物实验室质量合格证号为[辽实动环字2001] 第08号。
1.1.2试剂与仪器 虫草小分子肽，含量5.78mg/mL、HCI、NaOH等均为分析纯。J2-21低温离心机：（美国Beckman公司）；XMTD-0363型电子恒温水浴锅：（中国天津 泰斯特仪器有限公司）；78-1型磁力加热搅拌器：（中国 杭州仪表电机厂）；TD6001B型电子天平：（中国 余姚市金诺天平仪器有限公司）；WFZ UV-2000型紫外可见分光光度计：（中国 上海尤尼柯公司）；BX41型荧光显微镜：（美国Olympus公司）；AL30107型 分类血液细胞分析仪：（美国Thremo公司）；650-66荧光分光光度计：（日本 日立公司）。
1.2 方法
1.2.1实验动物的处理 采用管饲染毒法，大鼠灌胃量为1.0ml/100g.bw，小鼠灌胃量为0.2ml/10g.bw。
1.2.2 急性毒性试验
1.2.2.1小鼠急性毒性试验 选用健康昆明种小鼠20只，雌雄各10只，进行试验。小鼠体重为18～23g。以10.00g/kg.bw的剂量进行灌胃后，连续观察14天。记录中毒表现及死亡情况。
1.2.2.2大鼠急性毒性试验 选用健康Wistar大鼠20只，雌雄各10只，进行试验。大鼠体重为180～220g。以10.00g/kg.bw的剂量进行灌胃后，连续观察14天。记录中毒表现及死亡情况。
1.2.2.3大鼠蓄积毒性试验 采用定期递增剂量蓄积系数法，取体重为180～220g的Wistar大鼠40只，雌雄各半。每天按动物体重经口灌胃给以一定的试验用样品，第1～4天给0.1LD50剂量，以后剂量按1.5倍每4天递增一次。累计自实验开始到出现50%动物死亡时的累计总计量（∑LD50（n）），在第20天时（总累计剂量达到5.3LD50），雌雄性大鼠均未出现50%死亡时，则终止试验。计算蓄积系数，K=∑LD50（n）/LD50，K<1为极强蓄积；K=1-3为强蓄积；K=3-5为中等蓄积；K>5为弱蓄积。
1.2.4遗传毒性试验
1.2.4.1雄性小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 采用间隔24h两次经口灌胃法进行试验。用体重25～30g雄性小鼠25只，随机分为5组。以40mg/kg.bw剂量的环磷酰胺为阳性对照，蒸馏水为阴性对照，试验用样品设1.25、2.50、5.00g/kg.bw 3个剂量组，用蒸馏水配至所需浓度。末次给试验用样品6h，颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光学显微镜下，每只动物计数1000个嗜多染红细胞（PRC），微核发生率以含微核的PRC千分率计，并进行统计处理。
1.2.4.2小鼠精子畸型试验 用体重30～35g的性成熟雄性小鼠25只，随机分为5组。以40mg/kg.bw剂量的环磷酰胺为阳性对照，蒸馏水为阴性对照，试验用样品设1.25、2.50、5.00g/kg.bw 3个剂量组，用蒸馏水配至所需浓度。每日灌胃一次，连续5天，末次灌胃后30天处死动物，取附睾制片，伊红染色，每组计数5只动物，每只动物计数1000个结构完整的精子，计算畸变精子发生率（以百分率计），并进行统计处理。
1.2.5统计学处理方法：根据实验设计和获得数据类型，采用X2检验、秩和检验等方法进行数据统计分析，显著性以P＜0.05表示。
2.结果
2.1 急性毒性试验
2.2.1小鼠经口急性毒性试验 表1可见，试验用样品以10.00g/kg.bw的剂量灌胃两种性别的小鼠，观察14天后，未见明显中毒症状，也无死亡，尸检未见各脏器有明显病理改变。试验用样品对两种性别小鼠的经口急性毒性LD50均大于10.00g/kg.bw。根据急性毒性分级，试验用样品属实际无毒物质。
表1. 小鼠急性毒性试验结果（n=10；单位：g/kg.bw）
2.1.2大鼠经口急性毒性试验 表2可见，试验用样品以10.00g/kg.bw的剂量灌胃两种性别的大鼠，观察14天后，未见明显中毒症状，也无死亡，尸检未见各脏器有明显病理改变。试验用样品对两种性别大鼠的经口急性毒性LD50均大于10.00g/kg.bw。根据急性毒性分级，试验用样品属实际无毒物质。
表2. 大鼠急性毒性试验结果（n=10；单位：g/kg.bw）
2.2 大鼠蓄积毒性试验 在第20天时，总累计剂量已达到5.3LD50，雌雄性大鼠均未出现50%死亡，蓄积系数K>5，为弱蓄积。
2.3 遗传毒性试验
2.3.1雄性小鼠髓嗜多染红细胞微核试验 表6可见，试验用样品各剂量组雄性小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率与阴性对照组比较，均无显著性差异（P>0.05）；而环磷酰胺组与阴性对照组比较，均有显著性差异（P<0.05）。未见试验用样品对雄性小鼠骨髓嗜多染红细胞微核产生明显影响。
表6. 雄性小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果
2.3.2小鼠精子畸形试验 表7可见，试验用样品各剂量组小鼠精子畸形发生率与阴性对照组比较，无显著性差异（P>0.05）；而环磷酰胺组小鼠精子畸形发生率与阴性对照组比较，有显著性差异（P<0.05）。未见试验用样品对小鼠精子畸形产生明显影响。
表7. 小鼠精子畸形试验结果
3.讨论
本文急性毒性试验与遗传毒性试验结果表明，北虫草小分子肽作为新资源食品—北虫草的深加工产品属于无毒物质，在遗传学方面未见产生致畸效应。鉴于北虫草小分子肽的生物活性[5]和本实验结果，在天然北虫草资源已几近枯竭，人工栽培规模化生产的成功，将继承沿袭野生冬虫夏草的功能，为提高人类健康生活质量发挥积极的作用。在医药、食品、保健品和化妆品等领域也可以安全地利用北虫草小分子肽。
【参考文献】
[1] 邢来君 李明春.普通真菌学[M].北京 高等教育出版社 1999.
[2] 王洪军，李艳芳，孙克妍，等.北虫草提取物影响去势大鼠附性腺与血清睾酮的实验研究.解放军药学学报，2009，25（4）：323-325.
[3] 王洪军，吕真麟，张博平，等.北虫草提取物增强小鼠生理体能的研究.解放军预防医学，2009，27（3）：165-167.
[4] 杨国平，王洪军，张锐，等.北虫草提取物影响冷应激大鼠脑组织cAMP水平与AC活性的实验研究.解放军药学学报，2009，25（2）：110-113.
[5] 金田，石俊英. 近五年北虫草药理作用研究进展. 食品与药品，2011，13（9）：358-361.
1、国家高技术研究发展计划“863”项目（No.2002AA2Z3208）
2、吉林省科技发展计划重点科技攻关项目（No.20140204054YY）
3、辽宁省教育厅自然科学研究项目（No.L2013527）
论文作者:凡文博, 逄利,王立强, 周青阳,王洪军,吴扬
论文发表刊物:《医药前沿》2015年11月第32期
论文发表时间:2016/5/6
标签：小鼠论文; 虫草论文; 毒性论文; 剂量论文; 样品论文; 精子论文; 大鼠论文; 《医药前沿》2015年11月第32期论文;