柯珍恋[1]2001年在《钝顶螺旋藻转化与表达系统的建立》文中研究表明蓝藻是原核生物，遗传背景相对简单，是很理想的真核基因表达受体，其遗传转化研究进展很快。应用穿梭质粒载体和基因整合平台系统已经成功地在多种蓝藻中实现了外源基因的表达。螺旋藻是一类丝状蓝藻，含有大量的蛋白质及其它人体所必需的营养物质，是少数已被确证可以安全使用的蓝藻之一，更适用于作为生产有用蛋白质的生物反应器开发，并制造可直接食用的基因工程产品。但是，螺旋藻作为外源基因工程受体的研究由于缺乏行之有效的遗传转化途径而始终进展缓慢。 螺旋藻内高活性的胞内核酸酶是外源基因转化螺旋藻的主要障碍。我们以供体质粒pEUTISI为主要的酶消化底物，通过多种方法处理螺旋藻细胞，然后检测其胞内核酸酶初提液对pEUTISI的降解作用。结果表明，2mmol／L以上的EDTA处理16h或无Mg2+螺旋藻培养基培养72h以上，都可以使处于对数生长期的螺旋藻胞内酶活性显着降低。低于28℃培养也可稳定降低螺旋藻的胞内核酸酶活性。综合以上结论，我们用2mmol／L的EDTA处理24℃培养的螺旋藻16-20h，结合超声波转化供体质粒的方法，建立了稳定的螺旋藻遗传转化途径。 用整合型质粒载体pEUTISI和pEUTR超声波转化螺旋藻，获得了稳定的具有G418抗性的螺旋藻培养系SP-I和SP-R，但藻株在形态上发生了一定的变异。以外源基因的两侧引物对转化藻的染色体进行PCR扩增，得到与阳性对照相同的DNA片段。以Km’基因为探针，对SP-I和SP-R进行Southern-blot鉴定，结果表明，SP-I的G418抗性确实是由于染色体整合了供体质粒Kmr基因所表达的。对SP-I蛋白质的SDS-PAGE凝胶电泳分析发现与预期外源目的基因——融合蛋白Ub-Tα1大小相当的特异蛋白条带。Western-blot结果表明，该特异带能与抗Tα1的抗血清结合，证实目的基因Ub-Tα1基因在转基因螺旋藻SP-I中获得了表达。 此外，我们分别建立了具有潮霉素和氯霉素抗性的两个克隆载体pAH和pKR。用质粒pDR2的潮霉素抗性基因替代质粒pUTK的Kmr片段，得到具有潮霉素和氨卞青霉素抗性的质粒pAH，该质粒含有蓝藻藻蓝蛋白基因的两侧同源片段L和R；以pKF3为出发质粒，插入蓝藻藻蓝蛋白的同源序列R 片段，得到具有氯霉黝性的整缄体邮。这两个含有抗性（潮霉素和氯 霉素）标记基因载体的构建，为螺旋藻更好地进行筛选转化工作打下了基础
姜晓杰, 王文杰, 高金亮, 李炜, 祁美荣[2]2014年在《钝顶螺旋藻sod基因真核表达载体的构建与表达》文中研究说明目的:在毕赤酵母中表达钝顶螺旋藻超氧化物歧化酶SOD。方法:以质粒p ET30-sod为模板,采用PCR扩增sod基因,并将其与表达载体p PIC9K相连,构建重组表达质粒p PIC9K-sod。将重组质粒p PIC9K-sod用限制性内切酶PmeⅠ线性化,并电转化入毕赤酵母GS115。利用单菌落PCR筛选整合有重组质粒的阳性转化子,用甲醇进行诱导表达,并在5L发酵罐内进行发酵表达目的蛋白。用改进的邻苯叁酚自氧化法测定重组SOD的活性。结果:成功构建了钝顶螺旋藻的sod的真核表达载体,并在毕赤酵母中表达了分子量为22k Da的重组蛋白SOD。发酵罐高密度发酵所获目的蛋白的平均浓度为0.36±0.4 mg/m L,比活性为409±17U/mg。结论:在毕赤酵母中表达了分子量为22k Da的钝顶螺旋藻SOD。
于平[3]2003年在《极大螺旋藻藻蓝蛋白基因的克隆及其表达研究》文中指出藻胆蛋白是蓝藻(cyanophyceae)、红藻(Rhodophyceae)、隐藻(Cryptophyceae)和一些少数甲藻(Pyrrophyceae)中的一种重要的捕光色素蛋白。根据组成和吸收光谱的不同，藻胆蛋白一般分为叁类：藻蓝蛋白(Phycocyanin，简称PC，吸收光谱在610-640nm)、藻红蛋白(Phycoerythrin，简称PE，吸收光谱在500-570nm)和别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，简称APC，吸收光谱在650-671nm)。这些蛋白不仅可以作为工业原料或者食品添加剂，而且还发现它们对一些疾病具有特殊疗效而受到人们的重视，因此藻胆蛋白广泛应用于食品工业、化学工业、医学诊断、临床医学等。此外由于藻胆蛋白种类多、荧光强、量子产量高，易于同生物素、抗体等一些蛋白质结合，因此藻胆蛋白作为荧光探针越来越受到重视。 目前藻胆蛋白主要从螺旋藻中分离纯化制得。但螺旋藻养殖困难，对其室外大规模培养缺乏系统全面地研究，养殖成本高且价格昂贵，因此从螺旋藻中分离纯化藻胆蛋白不仅成本高、工艺复杂、得率低，而且原料浪费严重，借助基因工程方法生产藻胆蛋白已成为当前所需。 本文研究共包括以下几个方面的内容： (1)极大螺旋藻藻蓝蛋白基因的克隆及其进化分析。研究表明：极大螺旋藻藻蓝蛋白基因全长为1119bp，与钝顶螺旋藻藻蓝蛋白基因的同源性为99％。β亚基基因序列位于α亚基基因序列上游，两者之间通过111bp的基因片段连接，β亚基和α亚基的基因序列全长分别为519bp和489bp，分别编码172和162个氨基酸残基，其密码子显示出非对称性。在β亚基基因序列上游8-11bp处存在可能的核糖体结合位点g-a-g-a，该结合位点和原核生物核糖体通常所用的结合位点g-g-a-a相似，但不相同。在极大螺旋藻藻蓝蛋白内也存在叁个生色团结合位点，即α亚基氨基酸Cys84和β亚基氨基酸Cys82和Cys153。第叁个生色团结合位点Cys153位于β亚基的羧基端，已经证明这个结合位点是由于该亚基的12个氨基酸残基(146-157)被引进了古老的藻蓝蛋白基因中而产生的。藻蓝蛋白包含许多疏水性氨基酸残基，这些疏水性氨基酸残基在藻蓝蛋白的聚集过程中起着极为重要的作用。藻蓝蛋白的疏水性表明它可能是类囊体膜上的一种疏水蛋 浙江大学博士学位论文 第VI页 白通过复制而产生的。在氨基酸水平上对极大螺旋藻藻蓝蛋白a和p亚基氨基酸 的同源性（H。一。藻蓝蛋白 a亚基和别藻蓝蛋白 a亚基氨基酸同源性（H。、＊。 藻蓝蛋白 p亚基和别藻蓝蛋白 p亚基氨基酸的同源性（HO．p）以及别藻蓝蛋白 a 和 p亚基氨基酸的同源性（H6．＊进行分析比较表明：它们之间存在着一定程度 的同源性，其同源性由高到底的J’匝序依次为：＊乃＞＊o＞＊小p＞＊阶们藻蓝蛋白和 别藻蓝蛋白的氨基酸序列的差异性说明这些蛋白质在藻胆体的能量转移和蛋白 质的聚合过程中行使不同的功能，但不同来源的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白之间的同 源性也表明在藻类的藻胆蛋白体中，这些蛋白质的能量转移功能必须十分相似。 在极大螺旋藻内部首先产生的是藻蓝蛋白的a亚基，然后才产生p亚基。别藻蓝 蛋白和藻蓝蛋白p亚基之间的相似程度要比藻蓝蛋白a和p亚基以及别藻蓝蛋白 以和p亚基的相似程度要高，这说明导致古老的a型和p型基因产生的基因复制 在该家族蛋白质的进化过程中己经发生很久，p亚基可能是由于a亚基的复制而 产生的。极大螺旋藻藻蓝蛋白内a和卜两个亚基存在一定程度的同源性，但同源 性程度不高也表明它们来源于一个古老基因的复制且分离很久、分别进化。 （）极大螺旋藻藻蓝蛋白基因在巴斯德毕赤酵母菌株 X－33中的表达。首先 根据所克隆的极大螺旋藻藻蓝蛋白基因序列构建了基因克隆载体和表达载体， 然后通过L汇lit将表达载体导入巴斯德毕赤酵母菌株X－33 基因组中，通过 dotblotting，PCR，SDS－PAGE和 western blotting筛选出了能够高效表达外源藻 蓝蛋白基因的巴斯德毕赤酵母工程菌株PC39。 门）对重组巴斯德毕赤酵母工程菌PC39发酵生产藻蓝蛋白的特性进行了 初步研究。研究表明在实验条件下所获得的细胞干重最高为 41．93 g／L，发酵液 中蛋白质的最高含量为 9．5232 g／L，藻蓝蛋白的最高产量为 61．195 mg／L，分泌 到胞外的藻蓝蛋白的最高产量为 24．32 mg／L。
凌娜[4]2006年在《节旋藻/螺旋藻基因组特性初探及硝酸盐转运蛋白基因克隆与序列分析》文中认为节旋藻／螺旋藻(Arthrospria／Spirulina)因其重要的经济价值和特殊的生物学性质而受到广泛关注。虽然其分子遗传学研究开展较早，但与其它已测序模式蓝藻集胞藻(Synechocystis)PCC 6803、聚球藻(synechococcus sp．)WH 8120、鱼腥藻(Anabaena)PCC 7120和念珠藻(Nostoc punctiforme)等相比，其研究进展十分缓慢。目前已克隆并发表的节旋藻基因仅30多个，有关节旋藻基因组学研究尚属空白，对节旋藻基因组特性更加缺乏了解。 本研究针对节旋藻自身结构和成分上的特点，通过优化实验方法构建了极大节旋藻(Arthrospria maxima)FACHB438高分子量、高覆盖率的基因组fosmid文库。该文库含有4300个克隆，重组频率是97.1％，插入片段平均大小为36.1kb，覆盖了节旋藻基因组的27.9倍。高分子量、高覆盖率节旋藻基因组文库的构建为物理图谱的绘制及最终全基因组测序奠定基础，同时也为开展比较基因组学、基因定位克隆等研究奠定基础。 以序列标签位点(STS)为路标构建重迭群图谱是目前最普遍、最经典、分辨率最高的物理作图方法。本研究随机挑选了100个克隆进行双末端测序，并挑选了14对特异性的STS序列设计引物，以1536个克隆为模板，根据STS-PCR反应池方案筛选了127个种子克隆，根据这些克隆之间的重迭位置关系拼接了4个连续的重迭克隆群，为最终节旋藻物理图谱的绘制奠定了基础。 同时，又随机挑选了一些克隆进行末端测序，共得到602个高质量的序列。这些序列总长为307，547bp，覆盖节旋藻基因组5.70％。序列相似性分析筛查到287条序列与已知功能的基因高度匹配，63条为假说蛋白(hypothetical protein)基因，另外发现了252条新基因，比例高达41.8％。密码子和GC含量分析表明：极大节旋藻密码子使用没有明显的偏倚性，密码子第一、二、叁位GC含量分别为46.9％，39.8％和45.5％，基因组GC含量为43.6％；节旋藻基因组和编码区的GC含量与丝状蓝藻鱼腥藻PCC 7120和念珠藻(Nostoc punctiforme)相近，与
郑晓欢[5]2009年在《人表皮生长因子hEGF在螺旋藻中的表达研究》文中进行了进一步梳理表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)是由53个氨基酸组成的多肽。因具有多种生物学活性和广泛的临床应用前景,EGF及其受体家族的研究成为近年来生物学研究的热点之一。螺旋藻是一类特殊的原核生物,它作为一种天然绿色食物,具有高安全性和高营养价值的特点,有着巨大的应用开发潜力。本实验的目的在于实现人表皮生长因子在螺旋藻中的表达,省去下游的分离纯化,以期开发出外敷产品应用于美容和皮肤烧伤、创伤的治疗、直接口服的美容保健品。首先,构建用于转化的供体表达载体。根据螺旋藻密码子的偏嗜性,设计引物,用PCR技术扩增得到人表皮生长因子基因。利用NspI和SphI这两种同尾酶,经过多步链接、测序,构建成含有四个串联目的基因的重组载体。然后将此串联片段插入到含有蓝藻源的热休克groESL启动子、rbcS polyA终止区、同源重组片段recA基因和nptⅡ基因的质粒中,构建成供体表达质粒pKREGF4。其次,将构建好的供体表达质粒转化螺旋藻。我们将供体质粒用超声转化的方法转化钝顶螺旋藻,通过G418筛选,得到叁株具有G418抗性且生长良好的转化藻株,分别命名为EGFA,EGFB,EGFC。以外源片段两侧引物对转化藻株的基因组DNA进行PCR扩增,证明目的片段已经整合到宿主的基因组DNA中。转化藻通过41℃热诱导后,进行SDS-PAGE,通过Western-blot,发现EGFB,EGFC藻株存在与预期外源目的基因表达产物大小相当的8.87kD左右的特异杂交带,证实特异蛋白的存在。而EGFA可能由于外源目的基因表达量过低或者基因未表达,没有检测到杂交信号。我们选取生长状态较好的转化藻EGFC进行大量培养,为后期验证转基因藻功能的动物实验做准备。最后,我们通过乙酸诱导大鼠急性胃溃疡的实验,初步证明转基因螺旋藻在治疗大鼠急性胃溃疡方面有一定的功效,转基因藻的治疗效果好于野生藻,体现了转基因螺旋藻藻的优越性。本研究通过超声转化的方法将目的基因人表皮生长因子hEGF片段整合到螺旋藻Spirulina platensis染色体上,并且从DNA和蛋白质水平检测了目的基因的表达情况,首次尝试了以螺旋藻作为转基因受体表达人表皮生长因子,为进一步研究开发具有人表皮生长因子功能的转基因螺旋藻产品奠定了基础。
王芬[6]2008年在《钝顶螺旋藻表达载体的构建及转化研究》文中研究说明本文研究螺旋藻对刀豆氨酸(CS)和不同抗生素的耐受性和敏感性;提取螺旋藻抗CS突变株A9c的基因组DNA转化野生藻株A9,获得同源转化螺旋藻的参数组合;构建含有螺旋藻A9启动子的外源质粒载体p215t-spp,并将其转入螺旋藻A9,实现绿色荧光蛋白GFP在螺旋藻细胞内的稳定表达。本研究初步建立了一套螺旋藻遗传转化操作系统,可为螺旋藻转基因操作提供重要技术参考。Chl、Str对螺旋藻均有很强的抑制作用,在液体培养条件下,1.0μg·ml~(-1)的Chl、3μg·ml~(-1)的Str对螺旋藻有完全的致死作用;固体培养条件下,1.2μg·ml~(-1)的Chl、4μg·ml~(-1)的Str可完全抑制螺旋藻在固体平板上的生长。Amp对螺旋藻有较强抑制作用,液体培养时Amp对螺旋藻的MIC为100μg·ml~(-1);固体培养时Amp对螺旋藻的MIC约为200μg·ml~(-1)。螺旋藻对Km很不敏感,在600μg·ml~(-1)Km的液体培养基中,螺旋藻的生长完全不受抑制。Chl、Str和Amp均适合作为螺旋藻的抗性筛选标记,筛选浓度分别为:1.2μg·ml~(-1)、4μg·ml~(-1)、200μg·ml~(-1)。将螺旋藻抗CS突变株A9c的基因组DNA作为材料转化野生藻株A9,以30μg·ml~(-1)的CS作为筛选压力,获得了转化藻株,得到了一些同源转化的参数:在低于最适生长温度的条件下(24℃)培养螺旋藻;转化前用2mmol·L~(-1)的EDTA预处理24h;利用超声波对螺旋藻进行处理,功率为300w,处理时间为70s;采用自然转化方法,冰浴处理,避光条件下液体培养后涂平板,筛选转化子。本实验以构建的携带grp基因的质粒p215t-spp和出发质粒p215t作为载体,分别采用冰浴法和PEG融合法转化螺旋藻A9藻株,成功实现了gfp基因在螺旋藻株中的表达。比较了用不同质粒在相同条件下转化A9藻株的转化率,数据显示p215t-spp可以比p215t极显着提高转化率(α=0.01),初步证明采用螺旋藻的启动子构建质粒可以提高转化效果;比较了相同质粒用不同方法转化A9藻株的转化率,数据显示采用适当浓度的PEG可以有效的提高转化率。经过反复实验证明,采用1%的PEG浓度作用30min可以获得较高转化率(10.5‰)。对转化藻株进行荧光检测,藻丝段在390nm蓝光激发下发出绿色荧光,证实gfp基因在转化藻株中得到有效表达。连续观察转化藻株荧光发光情况发现,转化藻株转接3次后均可观察到绿色荧光,证明了gfp基因成功实现了在螺旋藻细胞内的稳定表达。
文磊[7]2007年在《无抗性标记转基因蓝藻的研究》文中研究表明蓝藻是一类具有广泛适应性的光能自养型的原核生物,其所含营养丰富,是人类未来理想的食品;同时,蓝藻作为基因工程受体具有许多优点;但转基因产品中的标记基因的存在是多余的,甚至是有害的,因此要培育具有安全标记基因或者去除选择标记基因的转基因产物;而增强型绿色荧光蛋白(EGFP)被证明是一种安全标记基因,因此本研究以安全标记基因EGFP为标记基因,去除抗生素标记基因,并与流式细胞技术(FACS)相结合,开发无抗性标记的转基因蓝藻。本次研究的第一部分,设计引物用PCR技术扩增得到钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)cpcB基因的上游启动片段P_(cpcB),将此片段插入载体pEGFP中的5'MCS中,成功构建pCEGFP质粒,经过多步亚克隆成功地1.2kb大小的P_(cpcB)和EGFP片段,插入含有蓝藻内源小质粒pPbS的穿梭质粒pPKE2中,并去除了质粒上的抗性片段,利用多色分析和高速分选流式细胞仪(FACS Vantage SE)分选得到无抗性荧光菌,成功获得无抗性穿梭质粒pCGP,利用自然转化法将该质粒转化集胞藻Synechocystis sp.PCC6803,FACS Vantage SE分选转化成功的EGFP标记的集胞藻6803,通过荧光显微镜观察,成功获得EGFP标记的无抗性标记集胞藻Synechocystis sp.PCC6803。由于穿梭质粒在没有抗性压力下很容易丢失,因此在第二部分采用基因整合系统,选用更有经济价值且已规模化养殖的螺旋藻作为转化受体,进行无抗性转基因螺旋藻的研究。本研究的第二部分,将1.2kb大小的P_(cpcB)和EGFP片段插入钝顶螺旋藻同源重组质粒pKRET4的EcoR I位点,成功构建EGFP标记的同源重组质粒pCGKT,将4.2kb大小的无抗性同源重组片段切下回收,该片段含有钝顶螺旋藻的同源片段R(recA基因)、P_(cpcB)启动子、EGFP基因以及人源胸腺素Tα1表达盒,利用超声转化法尝试将该片段转入钝顶螺旋藻中,荧光显微镜观察,由于各种因素的影响,未能在显微镜下观测到转化成功的钝顶螺旋藻。本研究首次将EGFP基因和FACS技术相结合,构建无抗性穿梭质粒载体和同源重组质粒,分别以集胞藻6803和钝顶螺旋藻为转基因受体细胞,并首次在无抗生素选择压力下将EGFP基因转入集胞藻6803中,筛选以EGFP为标记的无抗性标记的转基因藻株,对无抗性转基因蓝藻的转化及筛选方法进行了初步探索,为进一步开发无抗性转基因蓝藻打下了一定的基础。
葛保胜[8]2005年在《抗肿瘤新药重组别藻蓝蛋白（雷普克）的药学研究及抗肿瘤机理探索》文中认为基因重组别藻蓝蛋白(雷普克)为本实验室利用基因工程技术构建的海洋活性蛋白。经过前期的开发证明,雷普克为一高效低毒的抑瘤因子,具有较大的开发潜力。本研究对雷普克的药学资料进行了研究,并初步探讨了其作用机制。1.根据基因工程药物研发要求,利用卡那抗性基因替换了原生产菌株的氨苄青霉素抗性基因,并采用平板划线法将雷普克生产菌株传代至100代,其生长速度、抗生素抗性、限制性内切酶酶切图谱、雷普克表达水平等均无明显差异,显示出较好的遗传稳定性。经测定叁批雷普克的N端15个氨基酸序列均一致。2.在原来小试发酵和纯化生产工艺的基础上,进行了放大生产,并进一步优化补料速率和纯化工艺。放大后的生产工艺基本稳定,雷普克表达量占菌体可溶性蛋白的41.3%,OD600达到78,纯化后雷普克纯度达到98%以上,生产规模达到克级水平。进一步的药效学试验表明,雷普克对人肝癌SMMC-7721裸鼠模型具有显着的抑制作用。3.采用SRB法建立了雷普克体外活性检测方法,利用HPLC等技术对雷普克的肽指纹图谱进行了分析,保证了样品批次之间的一致性,并对雷普克中的内毒素、残余宿主蛋白等微量杂质进行了测定,进一步完善了雷普克质量检定体系。4.抗肿瘤机理探索:初步的药理试验结果表明,雷普克无明显的体外细胞毒作用; 经体内给药可以促进T细胞的增殖,促进细胞因子IL-2和γ-IFN产生。采用脱氧核糖法测定显示,雷普克具有较强的羟自由基清除能力。提示免疫促进和羟自由基清除能力有可能是雷普克抗肿瘤作用机制之一。5.抗肿瘤活性验证:分别构建表达了6种重组别藻蓝蛋白亚基组分,进行了体内活性筛选。结果显示,His-βAPC对S180实体瘤、小鼠H22肝癌和人肝癌细胞株SMMC-7721裸鼠模型均显示出了较好的抑瘤效果,有望开发为新一代抗肝癌创新药物。本研究完善了雷普克药学资料,并初步探讨了其作用机理,为其作为抗肿瘤一类新药的开发进一步奠定了基础。
刘志伟[9]2001年在《转基因鱼腥藻7120生长与外源基因表达的优化控制》文中提出α型肿瘤坏死因子(TNF—α)具有多种生物学活性，随着研究的深入，其低毒高效的的抗肿瘤作用已成为可能，在临床上具有广阔的应用前景，目前重组TNF及其衍生物的研究发展迅速。前人已成功将hTNF—α基因转入鱼腥藻7120并得到表达，为了提高细胞培养密度和外源基因表达水平，本文研究了基因工程藻的质粒稳定性及其混合营养型培养，并在反应器中研究了转基因鱼腥藻7120培养和产物TNF—α的表达，为产业化打下基础。 首先研究转基因鱼腥藻生物量与吸光度的关系，得到分光光度法测定生物量的波长、测定范围和标准曲线。 转基因鱼腥藻7120与野生藻生长速率很接近。影印法证实转基因鱼腥藻7120能保持质粒分配稳定性。比较无选择压力下连续传代的转基因鱼腥藻7120在不同培养基中的生长和外源基因表达，证实没有发生质粒部分缺失，但转基因鱼腥藻在无选择压力下会降低重组质粒拷贝数。在培养过程中，种子培养基含有的新霉素可以保持生产过程质粒稳定，这可以大大减少新霉素用量。 转基因鱼腥藻7120能以混合营养方式生长，并能有效提高生长速率和外源基因表达水平，培养条件对转基因鱼腥藻7120的生长和外源基因表达有很大影响。研究发现采用含蔗糖9g／L和NaNO_32.25g／L的BG-11培养基，接种量大于5％，光强1000Lux，光暗周期为12hr／12hr，温度25～30℃，100mL摇瓶装液量30mL，最适于转基因藻7120的生长和外源基因表达，而培养基初始pH值影响不大。在最适培养条件下，转基因鱼腥藻15天生物量可达到3g／L以上，可溶性蛋白含量接近0.3g／g藻干重，TNF—α表达水平大于22％，与自养时相比，生物量增加82.06％，表达水平提高38.79％。培养过程碳氮源利用率低，转基因鱼腥藻在最初6天外源基因表达水平稍低，然后在9～15天生长正常时基本保持稳定。 流加培养对转基因鱼腥藻的生长有利。间歇流加稀盐酸控制过程pH值为8.5能促进生长而不影响外源基因表达。流加碳氮源培养证明单独流加碳源对转基因鱼腥藻7120生长与外源表达影响很小，单独流加氮源和同时流加碳氮源可明显促进生长，而且能轻微促进藻细胞的TNF表达。 藻类生长除了需要合适的营养源外，许多生长因子对生长具有较大影响。
关翔宇[10]2008年在《藻蓝蛋白组合生物合成及蓝藻连接多肽生物进化研究》文中提出蓝藻又称蓝细菌(Cyanobacteria),是藻类植物中最原始的一个门类,是无细胞核,具有植物型放氧光合作用的原核生物。藻胆体作为蓝藻捕光的一种超分子蛋白复合体,由不同种类的藻胆蛋白和连接多肽构成,在光合作用能量吸收和传递方面发挥重要的作用。钝顶螺旋藻(Spirulina platensis,Sp)是一种具有很高营养价值的经济型藻类,其中含有的藻蓝蛋白以其特有的营养和保健价值受到广泛的重视。由于藻蓝蛋白所特有的荧光活性且无毒,可用于荧光标记物以及光动力治疗等领域。本论文借助基因工程技术,实现了具有光学活性藻蓝蛋白的组合生物合成。1.首次实现了在大肠杆菌中利用一个载体完成多个基因的组合生物合成,提供了一种方便高效表达和纯化光学活性藻胆蛋白的新策略。从集胞藻PCC6803 (Synechocystis sp. PCC6803,S6)中克隆了五个基因cpcA(S6)、cpcE、cpcF、ho1及pcyA,构建了载体pCDF-cpcA(S6)-cpcE-cpcF, ho1-pcyA (V1),最终获得了具有光学活性的集胞藻PCC6803藻蓝蛋白α亚基holo-α-PC(S6)。2.基于以上策略的成功,进一步组合生物合成具有光学活性和生物学活性的钝顶螺旋藻C-藻蓝蛋白α亚基(rHHPC)。从Sp基因组DNA中克隆基因cpcA(Sp),构建了载体pCDF-cpcA(Sp)-cpcE-cpcF, ho1-pcyA (V2),以重组菌BL21 (DE3)作为研究对象,对rHHPC进行了5L规模的发酵,菌体密度OD600值达到27。初步摸索了发酵条件,优化了发酵工艺,探索了如何减少发酵过程中包涵体的生成,并对重组产物rHHPC的抗氧化活性进行了研究。结果表明rHHPC具有清除羟自由基和过氧化氢自由基的作用,使其成为一种具有开发潜力的抗氧化剂。3.实现具有光学活性钝顶螺旋藻C-藻蓝蛋白β亚基在大肠杆菌中的组合生物合成。将已知的CpcT及CpeS在S6基因组中进行BLASTP,得到具有高度同源性的基因Slr1649及Slr2049。从Sp基因组DNA中克隆C-藻蓝蛋白β亚基并对其结合色基的82位和153位半胱氨酸进行突变,进而构建了两组质粒分别为: pCDF-cpcB(C153A)-slr2049, ho1-pcyA (V3)和pCDF-cpcB(C82I)-slr2049, ho1-pcyA (V5); pCDF-cpcB(C82I)-slr1649, ho1-pcyA (V4)和pCDF-cpcB(C153I)- slr1649, ho1-pcyA (V6)。结果表明转化了V3和V4质粒的大肠杆菌,经诱导表达后分别产生了具有光学活性cpcB (C153A)-PCB和cpcB(C82I)-PCB,证实了Slr2049和Slr1649分别是催化藻蓝蛋白β亚基82位和153位与色基连接的特异性色基裂合酶。此外,分析和比较了几种本实验室构建的重组藻胆蛋白及天然藻胆蛋白的光谱学性质及差异。以上获得的重组蛋白均采用金属螯合亲和层析的方法,建立起快速高效的纯化工艺,对产物分别进行了SDS-PAGE、色素蛋白锌电泳、吸收和荧光光谱扫描等检测。4.首次对蓝藻连接多肽进行比较基因组学和系统进化分析。在25种蓝藻基因组(20种测序已完成,5种正在进行)中,得到了共192条连接多肽基因序列,包括167条与藻胆蛋白相关的连接多肽(Linker polypeptides)基因序列及25条铁氧化还原-NADP+脱氢酶(Ferredoxin-NADP+ oxidoreductase)基因序列。分析了这192条序列的基因结构、基因组上的定位、保守域和多态性,讨论了这些连接多肽的特征与功能。根据连接多肽的系统进化特征将蓝藻连接多肽分成六类,发现多数的连接多肽与藻胆蛋白聚集成簇,并多与藻胆蛋白的亚基、色基及相关的催化酶共享一个启动子。蓝藻连接多肽的产生、分化和消失归因于蓝藻对不同环境选择压力特别是光适应过程中产生的基因复制、水平基因转移或基因丢失。本论文为光学活性藻蓝蛋白的合成、广泛应用以及人工藻胆体的合成奠定了基础,探讨了藻胆蛋白的荧光活性机理,并通过对藻胆体连接多肽系统进化的研究,加深了对蓝藻光系统功能和进化的认识。
参考文献：
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[2]. 钝顶螺旋藻sod基因真核表达载体的构建与表达[J]. 姜晓杰, 王文杰, 高金亮, 李炜, 祁美荣. 生物技术. 2014
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