卫重娟[1]2002年在《神经生长因子和醛糖还原酶抑制剂在糖尿病周围神经病发病机制中作用的研究》文中研究说明DNP是糖尿病最常见并发症之一，不仅增高糖尿病患者的死亡率，还严重影响患者的生活质量。糖尿病患者中DNP的患病率多数报道为30～40％。糖尿病病程和慢性高血糖的程度是DNP的危险因素。DNP可累及感觉、运动、自主神经，以感觉缺失为主。DNP在糖尿病中发生早，在人类DNP发病一年内即可测出NCV下降。病理表现不一，主要为有髓神经纤维变性、丢失、再生伴节段性脱髓鞘与复髓鞘，无髓神经纤维变性伴大量再生以及微血管病变。 近来人们比较关注NGF在DNP发病机制中的作用。神经肽SP、CGRP是介导疼痛的神经介质，受NGF的调节。有报道ARI可促进体外培养介质中NGF的产生和／或分泌，因此，我们将雄性Wistar大鼠分为五个组，除个正常对照组外，其余四组通过STZ静脉注射制成糖尿病模型，维持15周后一组作为糖尿病模型对照，另外叁组分别给予NGF、Epalrestat和胰岛素治疗6周。分别在治疗前和治疗后6周时测定摇尾阈值来评估对热痛刺激的反应和神经电生理检查，包括NCV，M波波幅、远端潜伏期、H反射波幅、潜伏期等，尤其是H反射潜伏期因不随生长发育而改变而只受糖尿病本身影响，可作为客观评估未成熟大鼠DNP造模的指标。最后，取腓肠神经观察病理改变和有髓神经纤维计数。应用免疫组化和酶联免疫吸附方法测定DRG中SP、CGRP免疫阳性细胞率和血清及坐骨神经中NGF浓度以评估NGF及其相关神经肽在DNP发病机制中的作用。 结果显示STZ制成的糖尿病模型表现出血糖和HbA1c升高，体重下降及多食、多饮、多尿，说明造模成功。在糖尿病大鼠出现了摇尾阈值升高，MNCV 天律医科大学博士论文 和SNCV下降、M波和H反射的波幅下降及其潜伏期延长的电生理改变。电 镜下见髓鞘明显变性即髓鞘板层结构破坏和瓦勒氏变性，但有髓神经纤维计 数无明显变化。DRG中SP、CGRP免疫阳性细胞率下降，血清及坐骨神经中 NGF水平下降，提示NGF减少并通过对其相关肽的营养支持作用减弱在DNP 发病机制中起作用。摇尾阈值和M波、H反射的波幅在各治疗组均得到明显 改善，ARI对NCV及其潜伏期也有改善作用，而NGF和胰岛素只有部分改 善而无显着性，说明NGF主要作用于神经细胞体，因而对反映轴突功能的 波幅下降起作用，对与髓鞘相关的NCV无效，而且对NGF敏感的主要是小 的无髓慢传导神经纤维，而MNCV和SNCV反映的是大的有髓快传导和运动 神经纤维。胰岛素治疗未出现预期的从根本上阻滞DNP病因的疗效，提示 DNP病理机制的复杂性和多样性。各种治疗对形态学改变均无明显改善，提 示DNP应重在预防，早期治疗可能效果好。糖尿病大鼠血清和坐骨神经中 NGF和DRG中SP、CGRP水平下降，NGF和ARI治疗均有效，说明外源性 给予NGF能到达靶组织及其敏感神经元并发挥其生理功能。ARI对内源性NGF 的合成和l或释放起促进作用。另外，ARI的主要作用点是在与髓鞘相关的SC 内，抑制山梨醇的积累和NatK＋ATPase活性的下降，同时还有改善神经血流 的作用，所以ARI 的治疗效果比较全面。胰岛素治疗只逆转了NGF下降而 对神经肽无效可能源于其与NGF结构上的相似性。各种治疗的不彻底性提 示 DNP发病机制中的多因素作用，增加 NGF的治疗剂量和治疗时限以及提 早干预、联合治疗可能会起较好作用。 我们还观察了 DNP患者服用 ARI EPaireSla［后的临床疗效，以甲钻胺做对 照，发现印irestat无明显副作用，能显着提高部分神经的NCV，只对自觉 神经症状评分中的冷感和腹泻作用有显着性，但多数患者自我感觉较好，说必 明自觉症状和客观神经功能的改善不一定平行，或试验设计中的自觉症状评 分只分四个等级不足以充分反映患者较细微的主观感受改善。随着等级评分 更详尽，用药时限再延长可能会显示更另人满意的结果。
杨红英[2]2009年在《实验性糖尿病大鼠脑组织病变与氧化应激关系的研究》文中指出第一部分实验性2型糖尿病大鼠模型及观测指标的建立目的建立具有胰岛素抵抗特征及病理过程近似人类2型糖尿病的大鼠模型,并监测血糖、胰岛素和血脂等与血管神经病变密切相关的指标。方法8周龄SD雄性大鼠120只,随机分为30只对照组和90只造模组。对照组大鼠用普通饲料喂养。造模组大鼠用高脂高糖膳食喂养4周,第一次腹腔注射链脲佐菌素(STZ,25mg/kg),检测随机血糖水平。四周后第二次腹腔注射(STZ,40mg/kg),检测随机血糖水平,酶比色法检测糖化血红蛋白。全自动生化分析仪检测血脂水平,放射免疫分析法测定空腹胰岛素并计算胰岛素敏感指数(insulin sensitivityindex,ISI)。以随机血糖≥13.8mmol/L者为成模标准。结果糖尿病大鼠模型血脂升高:LDL为0.75±0.32mmol/L,TC为1.43±1.07mmol/L,TG为1.72±0.6mmol/L,与对照组相比有统计学意义(P＜0.05);胰岛素敏感性降低,敏感性指数为:-2.61±0.34,与对照组相比有统计学意义(P＜0.05);糖化血红蛋白升高:GHb为6.71±1.37%,与对照组相比有统计学意义(P＜0.05)。结论1.高脂膳食喂养结合不同STZ剂量两次注射能成功复制既近似于人类2型糖尿病致病机制又相对简便易得的实验性2型糖尿病大鼠模型。2.模型具有高血糖、高血脂、胰岛素抵抗等2型糖尿病特征,是研究2型糖尿病发病机制和药物研究的理想动物模型。3.模型存在血脂代谢障碍,高血糖和胰岛素抵抗等致血管神经病变并发症发生的重要因素,为观察分析糖尿病实验动物血管和神经病变奠定了良好基础。模型长期稳定性良好,适用于糖尿病慢性并发症的发病机制研究。第二部分实验性2型糖尿病大鼠脑组织病变与氧化应激关系的研究目的:糖尿病脑神经病变是其重要并发症,但机理仍未完全清楚。利用糖尿病鼠模型,观测氧自由基、抗氧化酶和醛糖还原酶(aldose reductase,AR)与脑组织损伤的关系以及血糖浓度对各观测指标的影响,揭示高血糖、氧化应激与微血管损伤及脑组织病理改变之间的内在联系。阐明与糖尿病血管神经病变密切相关的因素。为糖尿病脑神经病变并发症的预防和治疗提供可靠的实验室依据。方法:正常对照组大鼠60只,糖尿病鼠143只为糖尿病组,糖尿病组以空腹血糖分组:13.8mmol/L＜血糖＜16.7mmol/L为L组;血糖＞16.7mmol/L为H组。分别在8周、12周、16周采集血和脑组织标本,制作病理切片,待检。①光学显微镜和电镜观察脑组织病理损伤;②免疫组化和免疫印迹技术检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GP_x)、过氧化氢酶(catslase,CAT)、AR在脑组织的表达;③RT-PCR检测血SOD、GP_x以及血、脑AR mRNA表达;④紫外分光光度法及化学比色法测定血清O_2~-、H_2O_2、SOD、CAT水平,NADPH减少法测定脑组织和血清中的AR活性;⑤荧光免疫和酶法检测抗中性粒细胞胞浆抗体。结果:1.糖尿病鼠脑组织病理改变:光学显微镜显示16周脑组织血管内皮细胞肿胀,胞核不清,胞浆稀疏,周细胞退行性变。部分微血管管壁玻璃样变性,管壁塌陷呈波状。胶质细胞局灶性增生,颗粒层变薄。电子显微镜显示脑组织血管和神经组织损伤随大等病变。病程初期大部分神经细胞正常,12周少数神经细胞皱缩,16周神经细胞皱缩多见,核浓缩,胞膜及核膜皱缩。线粒体显示由增生、数目增多、轻度肿大到肿胀明显、固缩的病理损伤过程。不同血糖浓度引起的病理改变在同样病程不同组表现不同,H组的病理损伤比L组严重。2.糖尿病组血O_2~-活性明显高于对照组(p＜0.05),H组与L组相比无统计学意义(p＞0.05),糖尿病组血H_2O_2含量明显高于对照组,有非常显着的差异(p＜0.01),H组与L组相比差异有统计学意义(p＜0.05)。3.糖尿病组血GP_x、Cu-Zn-SOD、Mn-SOD mRNA表达均明显高于对照组(p＜0.05),L组与H组相比无显着差异(p＞0.05),糖尿病组血和脑组织匀浆AR mRNA表达明显高于对照组(p＜0.05),L组与H组相比,血与脑组织相比均无统计学意义(p＞0.05)。4.糖尿病鼠血GP_x、SOD活性明显低于对照组(p＜0.05)、CAT活性与对照组相比无统计学意义(p＞0.05),AR活性明显高于对照组(p＜0.05),SOD活性H组明显低于L组(p＜0.05),GP_x、CAT及AR活性H组与L组比较无统计学意义(p＞0.05),糖尿病鼠脑组织AR活性明显高于对照组(p＜0.05),L组与H组相比无统计学意义(p＞0.05),糖尿病鼠血与脑组织AR活性增长率比较无统计学意义(p＞0.05)。5.SOD、GP_x、CAT在脑组织的表达随病程进展逐渐减少。AR的表达在病程8周和12周表达量明显比正常增加,16周较前减少。GP_x、CAT、SOD及AR在糖尿病鼠和对照组大鼠的脑皮质、海马和血管均有表达,SOD主要在胞浆及胞膜表达,CAT和GP_x主要在胞浆表达,AR主要在胞核及核膜表达。6.人和鼠正常对照组ANCA均未检出阳性,糖尿病患者中检出4例阳性,糖尿病鼠中检出1例阳性。结论:1.糖尿病鼠脑血管及神经组织均出现程度不等的病理改变,且随病程进展日趋明显。血糖浓度较高的H组比L组病理损伤发生早、进展快。表明存在明显的脑组织损伤且与病程和血糖水平密切相关。2.糖尿病鼠血氧自由基水平升高,抗氧化酶基因表达增加,抗氧化酶活性降低。表明糖尿病鼠全身存在氧化应激增强的证据。SOD、GP_x、CAT在脑组织的表达呈现病程初期增高随病程进展逐渐下降的趋势,表明糖尿病氧化应激在脑组织有明显表现。3.糖尿病鼠血H_2O_2含量和SOD活性在不同血糖浓度组差异有统计学意义,表明其活性改变与血糖浓度密切相关。O_2~-及GPx、CAT活性;SOD、GPx基因表达均显示不同血糖浓度组差异无统计学意义,提示血糖浓度改变对这些因素无明显影响。可能是单纯控制血糖不能有效治疗和预防糖尿病及其并发症的原因之一。4.糖尿病鼠血及脑组织AR mRNA表达、血AR活力均明显高于对照组,脑组织AR表达随病程进展增加,与同时发生的脑组织病变密切相关,表明AR活性升高是脑组织损伤的重要原因。脑组织AR表达量16周时H组低于L组,提示AR与血糖浓度的关系不是随之增长的线性关系。5.人和鼠正常对照组ANCA均未检出阳性,糖尿病患者检出4例阳性和糖尿病鼠各检出1例阳性。提示ANCA在糖尿病微血管炎症中不起主要作用,但可能是病因之一。糖尿病大鼠脑组织存在明显的氧化应激和AR含量改变且与脑组织血管和神经病变密切相关,氧化应激与AR交互作用共同促进了糖尿病脑损伤的发生。氧自由基、抗氧化酶、AR的变化与血糖浓度的关系呈现不同的规律性,可能是抗氧化和ARI治疗糖尿病神经病变效果出现差异的重要原因。
李洪燕[3]2008年在《硝克柳胺防治糖尿病并发症作用机制研究》文中指出糖尿病慢性并发症,是糖尿病致死致残的主要原因。糖代谢异常导致血管、神经以及组织器官的损伤。微血管并发症有糖尿病眼病、糖尿病肾病等;大血管并发症有冠心病、脑中风、糖尿病坏疽等;糖尿病神经并发症包括感觉神经、运动神经及植物神经异常等。糖尿病并发症的主要发病机制有醛糖还原酶活性增强、糖基化终末产物(AGE)形成增多、PKC活性增加以及氧化应激。硝克柳胺是中国医学科学院药物研究所研究开发的1.1类化学药品,已申请中国和国际化合物发明专利。在大鼠顺铂急性肾损伤模型、大鼠5/6肾切除模型、链脲霉素(STZ)致大鼠糖尿病肾病模型以及遗传性高血压大鼠(SHR)肾损伤模型的研究,均被证明具有明显的肾功能保护作用。本论文在动物体内、分子和细胞水平,从糖尿病并发症发病的共同机制AGE和醛糖还原酶,以及糖尿病肾病相关的致纤维化因子TGF-β1、CTGF的表达和基质金属蛋白酶(MMPs)活性等方面,探讨硝克柳胺防治糖尿病并发症的作用机制,为这类药物的进一步开发与应用奠定基础。首先在大鼠STZ糖尿病模型观察了硝克柳胺的防治糖尿病并发症的作用。实验设正常组、模型组、阳性药氯沙坦10mg/kg治疗组、硝克柳胺7.5、15及30mg/kg叁个剂量治疗组。每周测体重、血糖,统计白内障发生率。于药物治疗8、12、16及20周,测定大鼠血生化指标及尿白蛋白。于治疗20周时,处死动物,取心脏、主动脉及肾脏做病理学检查,免疫组化检测主动脉及肾脏组织糖基化产物CML的表达,检测肾脏致纤维化因子TGF-β1、CTGF及胞外基质成分FN及ColⅣ水平。实验结果显示,硝克柳胺本身不影响血糖水平,对糖尿病大鼠的糖尿病并发症症状有缓解作用。糖尿病模型组大鼠体重增长较正常大鼠缓慢;硝克柳胺治疗组大鼠体重较正常大鼠下降,但平均体重明显高于模型组。糖尿病模型组大鼠在造模后6周出现白内障,至实验结束(造模后20周)时白内障发生率达80%。硝克柳胺治疗组大鼠在造模后8周发生白内障,至实验结束时,30 mg/kg治疗组的白内障发病率仅为37.5%,明显低于模型组。糖尿病模型组大鼠在造模后8周即出现高血脂症状,甘油叁酯水平升高近1倍,胆固醇水平升高约30%;硝克柳胺治疗组大鼠血中甘油叁酯及胆固醇水平均低于模型组,30 mg/kg治疗组血脂水平接近正常。糖尿病模型组大鼠在造模后8周出现肾功能障碍,表现为血尿素氮(BUN)升高、白蛋白尿症状;造模后20周病理学检查显示,肾脏肥大、肾小球硬化、系膜区扩张、基底膜增厚以及肾小管上皮细胞空泡变性。硝克柳胺30 mg/kg治疗组大鼠的肾功能指标BUN及24 hr白蛋白排出量(UAE)明显低于模型组,肾组织病理损伤程度也比模型组轻,与阳性药氯沙坦效果相当。结果表明,硝克柳胺有效缓解了糖尿病大鼠的体重降低;延缓了糖尿病白内障的发生,并且降低白内障发生率;有效纠正了糖尿病大鼠的高血脂症状;对糖尿病肾脏病理损害有保护作用,明显改善了糖尿病大鼠受损的肾功能。AGE是糖尿病慢性并发症主要发病机制之一。AGE除了直接的损害作用,还通过与AGE受体(RAGE)相互作用,诱导特异的细胞免疫应答,诱导TGF-β1、CTGF等致纤维化因子高表达。免疫组化结果显示,糖尿病模型组大鼠主动脉壁和肾组织中CML-AGE水平升高,而在硝克柳胺治疗组大鼠主动脉壁和肾组织中表达较低;TGF-β1、CTGF以及胞外基质成分FN、ColⅣ在模型组大鼠肾组织中表达均比正常大鼠高,硝克柳胺治疗组大鼠肾组织中表达均较低。结果进一步证实AGE是糖尿病并发症的致病因素,硝克柳胺通过干预AGE及其下游TGF-β1、CTGF的作用,抑制胞外基质沉积,从而阻止肾小球硬化和间质纤维化,延缓糖尿病慢性肾病进程。为了研究硝克柳胺的抗AGE形成与交联作用,在体外建立了AGE形成体系,采用荧光检测法、ELISA方法以及圆二色谱法,观察硝克柳胺的抗AGE形成作用;在体外葡萄糖和核糖介导的溶菌酶蛋白分子糖基化交联体系,通过SDS-PAGE凝胶电泳检测硝克柳胺的抗交联作用。50 mg/ml牛血清白蛋白及0.5 mM D-葡萄糖在37℃暗处反应一定时间,可检测到AGE特征荧光值(Em370nm,Ex440nm),在SDS-PAGE凝胶电泳图上可见到分子量增加的糖基化BSA条带,提示50 mg/ml牛血清白蛋白与0.5 mM D-葡萄糖在37℃暗反应条件下可形成BSA糖基化产物。硝克柳胺以及硝克柳胺与BSA共孵育产物,对AGE的荧光检测无干扰。在BSA-葡萄糖AGE形成体系,200μM硝克柳胺及其水溶性钾盐均能抑制AGE荧光值增加,对AGE非荧光产物CML-BSA形成也有抑制作用,与同剂量的阳性药氨基胍(AG)相比作用强度相似。BSA在圆二色谱表现为特异负吸收双峰,BSA-葡萄糖糖基化产物在圆二色谱表现为特异负双峰减弱变平坦,而水溶性硝克柳胺钾盐能够抑制这种变化趋势,与其抑制BSA糖基化有关。明胶是细胞外基质的主要成分,核糖是还原性较强的五碳糖。在BSA/明胶与葡萄糖或核糖的反应体系,BSA和明胶更容易被核糖糖基化。在体外两种蛋白与两种糖的AGE形成体系,硝克柳胺均明显抑制AGE荧光值的增长。在体外蛋白质与还原糖的反应体系中,经过一段反应时间,可以产生蛋白分子链间交联,在SDS-PAGE凝胶电泳图谱上表现为单分子量、2倍分子量及多倍分子量的蛋白条带。在溶菌酶与葡萄糖及核糖反应体系中,核糖比葡萄糖更容易介导蛋白交联。硝克柳胺及其钾盐明显抑制了葡萄糖及核糖介导的溶菌酶蛋白分子间的交联。上述结果表明,硝克柳胺及其钾盐对荧光AGE及非荧光AGE的形成均具有明显的抑制作用;对糖基化蛋白交联反应,硝克柳胺也表现了较强的抗交联作用。多元醇通路增强也是糖尿病并发症的主要发病机制之一。高血糖时,醛糖还原酶被激活造成细胞内山梨醇大量堆积,引发一系列病理改变,从而诱发白内障、视网膜病变、神经病变、肾脏病变等糖尿病并发症。硝克柳胺对大鼠晶状体醛糖还原酶的活性有较强的抑制作用,IC_(50)在0.7μM左右。为进一步研究硝克柳胺防治糖尿病肾病的作用机制,在细胞水平观察了AGE及高糖对原代培养的大鼠肾系膜细胞rMC及人肾小管上皮细胞系HKC细胞周期的影响,对rMC TGF-β1及CTGF基因表达的影响以及对细胞分泌的基质金属蛋白酶(MMPs)活性的影响。流式细胞术的结果显示,硝克柳胺本身不影响rMC及HKC的细胞周期分布。0.1 mg/ml AGE及25 mM葡萄糖对rMC作用24 hr后,细胞周期改变均表现为:G1期细胞比例增加,S期细胞下降;硝克柳胺能干预AGE引起的rMC细胞周期改变,但几乎不影响高糖诱导的细胞周期变化。在HKC细胞,AGE作用24 hr后细胞周期改变表现为G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显下降;硝克柳胺能抑制AGE引起的G1期增多及S期减少。25 mM葡萄糖及5 ng/ml TGF-β1对HKC细胞周期的影响均为G1期阻滞,硝克柳胺未能缓解高糖及TGF-β1引起的HKC细胞周期改变。AGE使rMC细胞TGF-β1及CTGF基因表达增加,分泌到细胞外液中的TGF-β1及CTGF增多。硝克柳胺对AGE诱导的TGF-β1及CTGF基因表达及分泌增加均有干预作用。高糖也导致rMC细胞分泌到细胞外液中TGF-β1及CTGF的增多,硝克柳胺对高糖诱导的TGF-β1及CTGF分泌增加干预作用较弱。说明硝克柳胺通过干预AGE的作用,使过表达的TGF-β1及CTGF降低,进而抑制了AGE对细胞周期的影响。AGE使rMC及HT1080分泌的基质金属蛋白酶MMP2及MMP9的活性降低,硝克柳胺能够部分恢复MMPs的活性。以上结果提示,硝克柳胺对AGE及高糖诱导的细胞G1期增多、TGF-β1及CTGF高表达以及MMPs活性降低均有干预作用。综上所述,硝克柳胺防治糖尿病并发症的作用机制在于:抑制AGE形成,抗AGE交联,抑制醛糖还原酶活性;硝克柳胺抗糖尿病肾病的作用机制,还与抑制AGE引起的细胞周期改变、TGF-β1及CTGF高表达以及MMPs活性降低有关。顺铂为金属铂类络合物,抗癌谱广,是临床化疗一线药。但对肾、神经系统及胰腺有毒性。最常见最严重的毒性是由于直接对肾小管的损伤作用而引起的肾功能损害,顺铂的肾毒性是其剂量限制性毒性。本实验室以往研究表明,硝克柳胺对顺铂所致大鼠肾功能损伤有保护作用,但对肝肾组织升高的脂质过氧化水平无影响,体外实验也未观察到抗氧化活性。提示硝克柳胺抗顺铂肾毒性作用存在其它机制。顺铂的肾毒性主要是肾小管上皮细胞损伤。采用MTT方法、生长曲线法及流式细胞术,观察到顺铂抑制人肾小管上皮细胞HKC的增殖,将其阻滞在s期,对HKC有直接的毒性作用;硝克柳胺与顺铂合用时,抑制了顺铂的细胞毒作用。顺铂的抗肿瘤机制及其肾细胞毒性机制在于其与DNA碱基的结合,引起DNA交联而改变构象。DNA构象的改变在圆二色谱表现为峰型的改变。顺铂与DNA分子中相邻两个碱基结合后,改变碱基相互旋转角度,破坏了碱基堆积规律,导致碱基间相互作用减小,使CD峰值降低,峰位红移。当体系中含有EDTA时,EDTA与顺铂螯合,使顺铂不能与DNA碱基结合,因此DNA的CD峰谱几乎没有变化。当体系中含有0.8μM硝克柳胺,DNA、顺铂、硝克柳胺分子比为1:2:8时,硝克柳胺抑制了顺铂DNA CD峰谱的改变。提示硝克柳胺可能通过螯合顺铂分子,干扰其与DNA结合而发挥作用。已知AGE形成和交联过程都需要金属离子参与,硝克柳胺的金属螯合作用可能是其抗AGE形成和交联的主要机制之一。
参考文献：
[1]. 神经生长因子和醛糖还原酶抑制剂在糖尿病周围神经病发病机制中作用的研究[D]. 卫重娟. 天津医科大学. 2002
[2]. 实验性糖尿病大鼠脑组织病变与氧化应激关系的研究[D]. 杨红英. 昆明医学院. 2009
[3]. 硝克柳胺防治糖尿病并发症作用机制研究[D]. 李洪燕. 中国协和医科大学. 2008
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