赵宇[1]2002年在《人骨髓间充质干细胞及其在骨组织工程应用的实验研究》文中研究指明骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是骨髓中存在的一种具有多分化潜能和高度增殖能力的多能干细胞。在特定的条件下，其能够被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、肝卵圆细胞甚至神经胶质细胞。骨髓间充质干细胞具有下列优点：穿刺取材容易；细胞体外分离培养方法简单；体外培养增殖力强，并定向分化为研究所需的细胞表型；因而骨髓间充质干细胞是目前组织工程(尤其骨组织工程)研究较多的种子细胞。我们通过开展人MSCs的细胞生物学特性、定向诱导分化(如：MSCs分离培养、诱导分化的条件、基因转染的影响)以及其在骨组织工程中应用的实验研究，为临床组织工程化人工骨的移植提供了的理论与实验的研究基础。 本研究的内容包括：人MSCs的生物学特性与定向诱导分化；逆转录病毒载体介导的EGFP基因转染人MSCs；骨髓间充质干细胞在骨组织工程中应用等几个方面。 1、人骨髓间充质干细胞的生物学特性 目的：体外分离培养人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)，研究其一般的生物学特性如细胞生长特点、增值周期、细胞表面分子特点，为其作为组织工程的种子细胞提供理论基础。方法：①运用密度梯度离心方法(1.073g／ml Percoll)分离获得骨髓单个核细胞，应用含10％胎牛血清(经筛选)的L—DMEM体系中培养，除去非贴壁的细胞、进行分离纯化与体外培养从而获得较高纯度的MSCs。研究表明人MSCs为梭形，呈集落样生长。第2～8代细胞生长速度较快，8代以后细胞扩增速度变慢，细胞形态也发生改变，有的呈多角形；②经过流式细胞技术检测细胞表面5种抗原分子的特征，即CD34、CD45阴性、CD29、CD44、CD166阳性，分离细胞的纯度达到95％以上。MSCs的抗原表型不是单一的，具有间质细胞、上皮细胞等细胞的特征，但不表达造血干细胞(HSCs)的标志如CD34；③通过细胞化学染色我们发现人MSCs的糖原染色强阳性、约5％的细胞碱性磷酸酶染色阳性，脂肪(苏丹黑)染色阴性；④运用流式细胞技术测定了人MSCs的细胞周期，结果表明处于G_0／G_1、S和G_2／M期细胞的比例分别为83.11％、5.17％和11.72％，提示大多数的MSCs处于G_0／G_1期，表明MSCs可能具有较高的分化潜能。结果：我们的研究表明，通过密度梯度离心方法分离获得的MSCs纯度高、形态和表型均一，且具有较强的分化潜能。
黄鹏[2]2016年在《面向骨组织工程的磷酸化高分子材料的研制》文中认为骨缺损是临床上最为常见而又棘手的问题之一,新兴的无细胞骨组织工程着眼于骨组织原位再生,是骨缺损修复中颇有前景的方法。该方法的关键之一是能诱导干细胞定向成骨分化的支架材料。本论文基于对骨组织特殊的生理环境的分析,着眼于在骨化中起关键作用的磷酸化的生物有机大分子的仿生,设计、合成一系列可降解的磷酸化高分子材料,将其加工成叁维多孔组织工程支架,系统地表征了它们的性能,并考察了它们和细胞的相互作用。具体研究内容包括:(1)磷酸化聚酯,聚(癸二酰甘油二酯)磷酸酯(PSeD-P)的设计、合成和性能测试。首先基于近年来我们发展的酸诱导环氧开环反应,两步化学反应制备了羟基化聚酯聚(癸二酰甘油二酯)(PSeD)。然后低温下直接用叁氯氧磷进行磷酸化,高效地制备了PSeD-P。通过核磁(NMR)、全反射红外光谱(ATR-FTIR)、凝胶渗透色谱(GPC)、电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)、对水接触角、体外降解实验表征了材料结构、组成和理化性质。然后用盐析法将其加工成组织工程支架,用ICP-AES、热失重分析(TGA)、示差扫描量热分析(DSC)、万能试验机等对支架的性能进行了考察。最后研究了PSeD-P与成骨细胞和骨髓间充质干细胞(BMSC)之间的二维和叁维相互作用,证实了其能促进成骨细胞贴附、增殖和成熟,同时能促进BMSC的成骨分化和矿化。(2)磷酸化程度可控的聚(癸二酸甘油二酯)磷酸酯(PGS-P)的设计、合成和性能研究,基于广泛应用的生物材料聚(癸二酸甘油二酯)(PGS),我们用第一部分发展的方法,通过叁氯氧磷对PGS直接磷酸化,可控地制备出了一系列不同磷酸化程度的PGS-P。通过NMR、ATR-FTIR、GPC对材料进行结构表征,通过ICP-AES测定了其中磷的含量,通过对水的接触角测定其亲水性能,然后用盐析法将其加工成组织工程支架,并通过ICP-AES,TGA,DSC,万能试验机等对支架的组成和性能进行了测定,并考察了支架的体外降解性能。最后考察了其和骨髓间充质干细胞(BMSC)的相互作用,研究了磷酸化程度对成骨分化的影响。本文完成了一系列可降解的磷酸化程度可控的具有潜在成骨诱导性的高分子材料的设计与合成,为骨组织工程提供了新材料。同时研究表明磷酸化及其程度能有效地调节了材料和细胞的相互作用,中等磷酸化程度最有利于BMSCs成骨分化,从而为新的成骨诱导性材料的设计提供了参考。
单建林[3]2004年在《人骨髓间充质干细胞的微载体培养及成骨诱导培养》文中指出目的:建立一种快速、大量培养人骨髓间充质干细胞(bMSCs)及快速、大量成骨诱导培养人bMSCs成为成骨细胞的方法,以满足组织工程技术治疗大段骨缺损对细胞数量和质量的需要。方法:1. 利用微载体培养人骨髓间充质干细胞:将普通培养瓶培养的第3代人bMSCs分为两部分,一部分1×107个采用微载体培养,另一部分继续采用普通培养瓶培养,分别观察细胞增殖情况,作出生长曲线,比较两种方法细胞增殖速度 (细胞扩增倍数/培养天数)。 2. 利用微载体法成骨诱导培养bMSCs:将普通培养瓶培养的第3代人bMSCs采用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养,观察细胞增殖情况,作出生长曲线,与普通成骨诱导培养法比较细胞增殖速度。分别于培养的第2,4,6,8,10,12,14d检测诱导细胞的ALP活性,并与普通成骨诱导方法进行对比,作出ALP活性曲线。最后进行细胞ALP染色、Ⅰ型胶原、骨钙素的免疫组化染色,观察所培养细胞的成骨细胞表型的表达。结果:1. 利用微载体培养人骨髓间充质干细胞:微载体法接种24h后约87.1%的bMSCs细胞贴附于微载体并铺展,3d后生长加速,约8~9天后细胞生长达最大值,最终细胞收获密度为接种时的约15~20倍,细胞增殖速度是普通培养法的约3.1倍,二者有非常显着差异(P<0.01) 。2. 利用微载体诱导培养人间充质干细胞为成骨细胞:微载体法接种24h后约85.9%的bMSCs细胞贴附于微载体并铺展,3d后生长加速,约10~11d后细胞密度达最大值,最终细胞收获密度为接种时的约15~20倍,细胞增殖速度是普通培养法的约3倍,二者有非常显着差异(P<0.01) 。诱导细胞的ALP活性在培养的约第12d达最大值,并表达ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素等成骨细胞表型。微载体成骨诱导细胞的ALP活性与普通成骨诱导方法无显着差异(P>0.05)。结论:应用微载体技术可以比普通培养法更快的速度扩增bMSCs,更适合组织工程技术治疗大段骨缺损的对种子细胞的需要。应用微载体技术可以成功地进行bMSCs的成骨诱导和更快地扩增,可以满足骨组织工程量和质的需要。
刘威[4]2013年在《矿化纳米纤维和静电纺丝纳米纱线的制备及其在骨组织工程中的应用》文中研究说明创伤和疾病等引起的骨缺损是临床上面临的难题,并且随着社会人口老龄化的加剧,与骨组织相关的问题越来越多。临床上修复骨的手段主要有以下几种：自体骨移植、异体骨移植和异种骨移植等。其中自体骨移植被认为是修复骨缺损的“黄金标准”,但是自体骨移植增加病人的痛苦和感染的几率,并且容易引起新的骨缺损。组织工程的兴起为骨修复提供了新方向。天然骨组织在不同尺度上具有不同的结构。微观尺度为叁维多孔结构；纳米尺度为纳米级羟基磷灰石(HA)在几百纳米至1微米的胶原蛋白纤维中有序排列的结构。天然骨组织的主要组成成分为无机的HA和Ⅰ型胶原蛋白。从仿生天然骨组织的结构、组成和功能的角度出发,制备接近天然骨组织的结构、组成和功能的组织工程支架用于引导骨再生具有重要的意义。本课题从仿生天然骨组织的细胞外基质的角度出发,采用静电纺丝法制备纳米纤维,然后控制外加矿化条件、组分和矿化时间用10倍模拟体液(10SBF)调控钙磷化合物在纳米纤维上的生长的形态、数量、生长的部位和纳米纤维膜的结构。扫描电子显微镜(SEM)下观察到,在静态矿化条件下,矿化物在纳米纤维表面生长,呈现无规形态。在动态矿化条件下,纳米球状矿化物在合成材料纳米纤维表面生长；在含有胶原蛋白的纳米纤维内部生长,并且沿单根纳米纤维轴向生长。随矿化时间增加,矿化物尺寸增大,数量增多；纳米纤维膜形态和结构逐渐难以保持。通过x-射线衍射(xRD)、红外光谱分析(FTIR)和X-射线能谱仪(EDS)对无机物的结晶结构和组分进行分析。通过检测接触角和力学性能发现,矿化物极大的改善了支架的亲水性,并且增强了支架的力学性能。体外实验结果表明,矿化复合纳米纤维膜[M-P(LLA-CL)/COL]上生长的成骨细胞形态良好；支架与细胞结合紧密。噻唑蓝(MTT)实验结果表明矿化物促进了细胞的增殖。检测细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙蛋白分泌发现,在矿化复合纳米纤维膜上的细胞ALP活性和骨钙蛋白表达得到促进。矿化复合纳米纳米纤维膜具有良好的生物相容性和促进成骨细胞分化的能力。进一步研究了矿化复合纳米纤维膜对干细胞行为的影响。SEM观察到人骨髓间充质干细胞(hMSC)在M-P(LLA-CL)/COL上具有较好的形态,与支架结合紧密。MTT检测干细胞的增殖行为结果表明干细胞在M-P(LLA-CL)/COL上生长良好。通过ALP活性检测、钙结节观察和免疫荧光染色观察,发现矿化纳米纤维膜促进了干细胞分化。胶原蛋白和含HA的球状矿化物共同起积极作用。此外,矿化物改变了纳米纤维膜的表面拓扑结构,可能对hMSC向成骨细胞分化产生了积极影响。M-P(LLA-CL)/COL具有良好的生物相容性和诱导成骨能力,具有在骨组织工程中应用的潜力。为了仿生天然骨组织的叁维多孔结构,采用冷冻干燥法制备了纳米纱线增强胶原蛋白叁维多孔支架。与静电纺丝纳米纤维相比,静电纺丝纳米纱线保留了纳米纤维的形态和结构,其微米级尺寸便于处理加工。采用水循环法从下层容器的水面收集P(LLA-CL)纳米纱线。纱线直径分布均匀,取向度较高。把冷冻干燥后的长纳米纱线处理成1-2mm的纳米纱线,在光镜下观察到纳米纱线分离较好,没有缠结现象。SEM观察到处理后的纳米纱线保持了纳米纤维的形态和结构。用光学显微镜和SEM观察到纳米纱线在支架中分散均匀,没有缠结现象,大部分纳米纱线组成了多孔支架的孔壁。统计支架孔径发现,纳米纱线的加入降低了支架的孔径尺寸。检测支架的吸水率发现,随纳米纱线加入的量增加吸水率下降。检测支架的力学性能发现适量纳米纱线的加入能增强支架的力学性能。随纳米纱线加入增多,支架的收缩率随之降低。MTT结果表明适量纳米纱线的加入促进细胞的增殖；过量的纳米纱线,破坏支架孔隙,不利于细胞的增殖。SEM观察细胞在支架上的形态发现,细胞贴附在支架的孔壁上生长。通过检测ALP活性和骨钙蛋白染色发现适量纳米纱线的加入促进了干细胞分化。此外还发现细胞能够迁移长入多孔支架内部。上述结果表明,适量纳米纱线(4mg/mL左右)增强的叁维多孔支架具有在骨组织工程中应用的潜力。传统的骨移植手术有诸多缺点。微创手术(MIP)的出现为骨移植手术提供了新的手段,进而对骨移植材料的研发提出了新要求。把P(LLA-CL)纳米纱线加入可注射胶原蛋白水凝胶中,制备得到一种新型的可注射骨移植支架。这种支架在37℃下2h凝胶。光学显微镜和SEM观察发现纳米纱线在水凝胶中分散均匀,没有缠结现象。流变仪检测结果发现,纳米纱线增强了支架的力学性能。可注射性测试表明新型支架能具有良好的可注射性。与对照组相比,所用针头的尺寸更小。体外细胞实验结果表明纳米纱线有效阻止了细胞多层团聚形态的出现,MTT检测表明细胞在新型支架上增殖良好。通过ALP活性检测和骨钙蛋白荧光染色发现纳米纱线的加入促进了干细胞的分化。共聚焦显微镜3D扫描结果发现在新型支架上的细胞荧光分布更均匀,并且在新型支架上层的细胞呈现成骨细胞的不规则多边形形态。上述结果表明纳米纱线增强的可注射水凝胶具有应用于MIP和骨组织工程的潜力。
侯威, 周淑平, 张卫[5]2019年在《锶纳米纤维能促进骨组织再生》文中进行了进一步梳理为了探究锶纳米纤维在骨组织再生中的作用机制,本研究通过静电纺丝来制备聚合物纳米复合材料工程支架,促进骨组织再生。将碳酸锶纳米粒子(nSrCO3)以10%和15%重量比添加到聚己酸内酯(PCL)中,做成纤维直径在300～500 nm范围内的纳米复合材料纤维支架(PCL+10%SrCO3和PCL+15%SrCO3),掺入nSrCO3后降低了纤维支架的结晶度和弹性模量,复合PCL+15%SrCO3支架可在4 d内释放出高达58 ppm的Sr2+离子。细胞研究证实,体外使用的含有15%n Sr CO3的复合支架增强了人间充质干细胞的增殖。在PCL+15%SrCO3中,最小沉积量显着增加达约4倍,促进了骨形成。在PCL+15%SrCO3纤维中,成骨标志物如BMP-2和Runx2的mRNA和蛋白的高表达也可以证明锶纳米纤维能促进骨形成。本研究为研究锶纳米纤维在促进骨组织再生中的运用提供了一定的参考价值。
参考文献：
[1]. 人骨髓间充质干细胞及其在骨组织工程应用的实验研究[D]. 赵宇. 中国协和医科大学. 2002
[2]. 面向骨组织工程的磷酸化高分子材料的研制[D]. 黄鹏. 东华大学. 2016
[3]. 人骨髓间充质干细胞的微载体培养及成骨诱导培养[D]. 单建林. 第叁军医大学. 2004
[4]. 矿化纳米纤维和静电纺丝纳米纱线的制备及其在骨组织工程中的应用[D]. 刘威. 东华大学. 2013
[5]. 锶纳米纤维能促进骨组织再生[J]. 侯威, 周淑平, 张卫. 基因组学与应用生物学. 2019
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