【摘要】目的 建立快速鉴定本院血液病患者感染真菌菌种的方法。方法 收集本院2009年1月-2013年1月住院血液病患者血液样本，经BacT/ALERT 3D血培养仪培养血琼脂培养基及沙保弱培养基分离培养真菌，对其进行总基因组DNA提取，并在真菌ITS保守区设计引物，对血液样本中的真菌DNA测序，建立真菌感染DNA测序检测方法。结论 初步建立了本院血液真菌感染标本DNA测序检测方法，并可对个性化用药提供指导。
【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）32-0207-01
感染真菌的血液病患者免疫功能低下，容易发生严重感染，常有多系统功能紊乱，感染后易出现多器官功能衰竭[1]。为了了解血液真菌感染的种群分布，为临床用药提供指导，我们对本院2009年1月-2013年1月住院血液病人血液样本进行了真菌分布鉴定。
1 材料和方法
1.1试剂 基因组DNA提取试剂盒（Fungal gDNA kit， Biomiga），PCR胶回收试剂盒（DNA Gel/PCR Purification Miniprep kit，Biomiga），Taq DNA聚合酶（2X Taq PCR MasterMix ，Biomiga），95%酒精（Sigma），甲酰胺，HiDi，BigDye 3.1 kit均购自lifetechnologies，引物由Genscript合成，沙保罗琼脂培养基（麦芽糖40g，蛋白胨10g，琼脂20g，蒸馏水1L）
1.2培养及分离 将取1～2ml血液标本接种于沙保罗琼脂培养基，冷却至45℃左右沙保琼脂混合,倾注接种平板[2]。置35℃恒温箱内培养48h。发现真菌及酵母样可疑菌落,转种沙保菌斜面，获得纯培养后进行基因组DNA提取[3]。
1.3ITS片段的PCR扩增
PCR通用引物检测方法的建立：以2×Taq PCR Master Mix建立50μl反应体系，体系如下：
1.4 PCR产物纯化及测序
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，根据DNA Gel/PCR Purification Miniprep kit使用说明进行PCR产物纯化，然后采用ABI 3130xl DNA 序列分析仪进行测序。1/8测序反应体系如下：DNA 1 ?L，BigDye（2.5×）1?L, Seq Buffer（5×）1.5μl，引物ITS1(3.2 pmol / ?l) 1 ?L, 去离子灭菌水 5.5 ?L, 总体积10 ?L；测序PCR循环条件：96 ℃ 1 min →(96℃10 sec →50℃ 5 sec →60℃ 4 min) x 25个循环→4 ℃保存。
1.4序列分析
测序结果在NCBI Blast进行序列同源比对搜索，同源率为100%即认为该菌种。
2 结果
2.1 测序结果 经ITS1，ITS2引物双向测序，测序背景信号低，无套峰、杂峰。通过Seqman软件比对，在引物下游20bp后，序列100%一致。
2.2 真菌菌种分布 血液病患者临床标本分离出640株真菌菌种，包括4个菌属的15个菌种。以白色假丝酵母菌、曲霉菌属、热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌及光滑假丝酵母菌等5种菌为主，分布为白色假丝酵母菌325株占50.8%，曲霉菌属122株占19.1%，热带假丝酵母菌77株12.0%，克柔假丝酵母菌50株占7.8%，光滑假丝酵母菌39株占6.1%，其余27株为其它真菌占4.2%。
3 讨论
血液病并发侵袭性真菌感染在世界的致死率不断攀升[4]。放疗和化疗后机体的免疫防御系统受到损伤，导致真菌感染成为致死的一个主要原因[5]。
利用ITS DNA测序法进行菌种鉴定是目前较多采用的方法。ITS是内源转录间隔(Internally Transcribed Spacer)的英文缩写,位于rRNA编码基因18S,5.8S和28S之间的小基因片段。利用rDNA通用引物能够很容易被扩增出来；同时包含保守与变异序列,能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较，可实现真菌的快速分类与鉴定[6]。本研究针对我院640例病例根据ITS DNA测序法进行序列比对分析，结果达到预期期望，表明ITS1和ITS2引物对真菌有较强的特异性。基于测序结果分析，对比病例，本研究证明次方法可以准确的鉴定感染真菌的种属。
本实验最终以分离培养获得单一菌种的方法获得必要的基因组DNA。另外，由于本实验所用的真菌总DNA提取试剂盒效率较低，需要扩大培养，如果能够从分离步骤就可以获得微量基因组DNA，或者实现真菌菌斑直接PCR方法，对于提高鉴定效率可以大大提高。
本研究以ITS DNA测序法检测鉴定血液病并发侵染性真菌感染菌种，准确度，灵敏度极高，重复性高，从提取样本DNA到完成DNA测序，4小时左右完成鉴定。在本研究建立的鉴定方法上，进一步快速获得单一分离感染真菌菌种DNA或者PCR产物，完全可以形成一套快速，准确鉴定感染真菌菌种的检测体系。
参考文献
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[4]马爱瑛,张琇,刘晓飞.血液病患者合并侵袭性真菌感染的临床研究[J].生物技术通报,2010,11:234-237.
[5] 张淑彩,郭晓，魏晓丽.恶性血液病患者医院感染的研究进展[J].中华医院感染学杂志,2005,15(12):1435-1437.
[6] 王华民,王英,陈锦龙.应用rDNAITS测序检测海南岛条件致病性真菌[J].海南医学院学报,2008,4(1):1-3.
论文作者:宋小彦 蔚利纳
论文发表刊物:《医药前沿》2013年11月第32期供稿
论文发表时间:2014-1-3
标签：真菌论文; 引物论文; 菌种论文; 酵母菌论文; 血液论文; 琼脂论文; 鉴定论文; 《医药前沿》2013年11月第32期供稿论文;