（浙江大学医学院附属第二医院 浙江 杭州 310008）
【摘要】目的：探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者胸水标本不同预处理方式对EML4_ALK融合基因RT-PCR法检测的影响，以提高肺癌患者EML4_ALK融合基因的阳性检出率。方法：收集本院非小细胞肺癌恶性胸水标本20例，同时采用2种不同的标本预处理方法提取RNA后采用突变扩增系统PCR(ARMS-PCR)法检测EML4_ALK融合基因，一种为直接离心提取法，另一种为制备细胞蜡块后切片提取法，对比两种预处理方式对检测结果的影响。结果：50例非小细胞肺癌标本中，细胞蜡块切片提取法检测到的阳性样本数也同样为3例且与石蜡包埋提取法的阳性样本一致，直接沉淀提取法检测到的阳性标本数为1例，占总数的2%。结论：制备细胞蜡块后切片提取法无论在检测成功率还是阳性检出率方面均显著优于直接离心提取法。
【关键词】非小细胞肺癌；EML_ALK融合基因检测；细胞蜡块
【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）24-0369-03
随着现代分子医学研究的进展，晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗已进入个体化时代，多种靶向药物不断涌现，目前国内已被批准的非小细胞肺癌靶向药物相关基因检测有人类表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、间变淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、c-ros原癌基因1酪氨酸激酶（c-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase， ROS1）[1]。其中，ALK基因检测用于指导靶向药物克唑替尼（Crizotinib）治疗。克唑替尼是一种针对ALK靶点的ATP竞争性酪氨酸激酶小分子抑制剂，可特异性靶向抑制ALK激酶，也可抑制c-MET和ROS1等信号通路。临床试验显示，对于ALK阳性的晚期NSCLC患者，克唑替尼的疗效显著优于传统化疗，二线单药治疗患者的中位PFS为7.7个月，有效率达到65.3%[2]。基于其良好的疗效和耐受性，2013年初，中国食品和药品监督管理总局（CFDA）已批准克唑替尼用于治疗ALK融合阳性的局部晚期或转移性NSCLC患者。ALK变异主要为ALK基因发生重排与其他基因融合，约占所有NSCLC的5%左右，EML4-ALK（棘皮动物微管结合蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶）融合基因变异是其主要类型[3-5]。虽然肿瘤组织活检是最可靠的样本来源，但对于部分因年龄、身体状态、肿瘤部位等各种因素无法取到组织学样本的晚期非小细胞肺癌患者来说，胸水脱落细胞样本是获取检测所需肿瘤细胞的重要途径。以往研究发现，NSCLC中ALK基因融合90%以上为EML4-ALK基因融合，非EML4-ALK融合基因（包括KIF5B-、KLC1-、TFG、GCC2-、CUX11-、KIF3A-、PPFIBP1-、ZNF2-）仅占不到10%，这使实时荧光定量PCR技术成为EML4-ALK融合基因检测的一种重要方法[6]。然而目前为止，虽然在胸腹水中基因组DNA用于肺癌EGFR基因突变检测的可靠性已被大量验证，但是胸水脱落肿瘤细胞中RNA用于EML4_ALK融合基因检测却少有报导。本研究同时采用两种不同的预处理方式提取RNA后采用突变扩增系统PCR(ARMS-PCR)法检测EML4_ALK融合基因，一种为直接离心提取法，另一种为制备细胞蜡块后切片提取法，对比两种预处理方式对检测结果的影响，为临床检测EML4_ALK方法学提供依据。
1.材料与方法
1.1 材料
1.1.1标本 收集浙江大学医学院附属第二医院自2016年1月至2016年12月经细胞学与组织学均诊断为NSCLC的福尔马林固定石蜡包埋组织及胸水标本50例。
1.1.2试剂 RNA提取试剂盒及EML4_ALK融合基因检测试剂盒均购自厦门艾德生物医药科技有限公司。
1.1.3仪器 Mx3000p实时荧光定量PCR仪（美国Stratagene公司），石蜡切片机（徕卡），全自动组织脱水机（Thermo）。
1.2 方法
1.2.1胸水预处理方法 将同一瓶胸水分装至2个50ml离心管中，每管装40ml，2500RPM离心10分钟后弃上清，加入10ml红色固定液，混匀后再次2500RPM离心10分钟后弃上清。取其中一管细胞沉淀直接使用组织胸水RNA提取试剂盒进行RNA提取并逆转录。取另一管细胞沉淀，转移至脱水专用包埋纸中，使用Thermo全自动组织脱水机脱水后包埋成细胞蜡块，使用徕卡切片机切取10微米切片20张于1.5ml离心管内，使用FFPE组织RNA提取试剂盒进行RNA提取并逆转录。
1.2.2 RNA提取及RT-PCR扩增检测 严格按照RNA提取试剂盒及EML4_ALK融合基因检测（荧光PCR法）试剂盒说明书操作，将样本装入MX3000P实时荧光定量PCR仪进行扩增检测。
1.2.3数据处理及统计 所有数据采用SPSS 19.0统计软件，结果运用χ2及Fisher确切概率法，检验水准α=0.05，并设定P值为双侧分布，且以P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 EML4_ALK融合基因检测阳性率对比
50例非小细胞肺癌标本中，石蜡包埋组织提取法总共检测到阳性样本3例，占总数的6%，细胞蜡块切片提取法检测到的阳性样本数也同样为3例且与石蜡包埋提取法的阳性样本一致，直接沉淀提取法检测到的阳性标本数为1例，占总数的2%，显著低于细胞蜡块切片提取法。
3.讨论
目前常用的ALK融合基因检测方法有三种：荧光原位杂交（FISH）、基于PCR扩增的检测技术（RT-PCR联合测序技术、qRT-PCR等）和免疫组织化学法（IHC）[7]。三种方法各有其优缺点。FISH虽然是临床试验验证的标准方法，但价格昂贵，操作规范要求较高，且无法区分ALK融合的具体类型；RT-PCR对标本取材要求较高，RNA容易降解，需专用的试剂盒进行检测；IHC简便易行，但阳性标准不统一。虽然ALK阳性的NSCLC仅占全部NSCLC的5%左右，但是中国每年新发的NSCLC病例数仍接近30,000例 ，因此，精确诊断ALK阳性的NSCLC便成了临床上的当务之急。
目前国内外研究报道指出胸水细胞块是检测NSCLC中ALK融合基因的有效途径，然而细胞块的制备方式对检测结果的影响却未见报导。本文通过比较两种不同的细胞预处理方式对EML4_ALK融合基因检测结果的影响，发现制备细胞蜡块并切片的方法与组织学检测结果具有较高的一致性，且阳性率显著高于直接沉淀提取法。此外，直接沉淀提取的方法不仅阳性率较低，而且还常常无法获取足够高质量的RNA。制备细胞蜡块虽然需要花费更多的预处理时间及人力，却能取得稳定且可重复的RNA样本，且福尔马林对肿瘤细胞RNA的片段化并未显著影响EML4_ALK融合基因的检测。综上所述，制备细胞蜡块并切片是肺癌胸水样本提取RNA使用RT-PCR法检测EML4_ALK融合基因的理想预处理方法。
【参考文献】
[1] Kumarakulasinghe NB, van Zanwijk N, Soo RA. Molecular targeted therapy in the treatment of advanced stage non-small cell lung cancer (NSCLC). Respirology. 2015;20:370-8.
[2] Camidge DR, Bang Y, Kwak EL, Shaw AT, Iafrate AJ, Maki RG, et al. Progression-free survival (PFS) from a phase I study of crizotinib (PF-02341066) in patients with ALK-positive non-small cell lung cancer (NSCLC). Journal Of Clinical Oncology. 2011;29.
[3] Soda M, Choi YL, Enomoto M, Takada S, Yamashita Y, Ishikawa S, et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature. 2007;448:561-6.
[4] Wong DWS, Leung ELH, Kam-Ting K, Tam IYS, Sihoe ADL, Cheng LC, et al. The EML4-ALK Fusion Gene Is Involved in Various Histologic Types of Lung Cancers From Nonsmokers With Wild-type EGFR and KRAS. Cancer. 2009;115:1723-33.
[5] Shaw AT, Yeap BY, Mino-Kenudson M, Digumarthy SR, Costa DB, Heist RS, et al. Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer who harbor EML4-ALK. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2009;27:4247-53.
[6] Huang SW, Harris J, Nonaka D, Blackhall F, Gaunt L, Wallace A. Validation of RT-PCR methodology for the diagnosis of EML4-ALK fusion gene in non-small cell lung cancer. J Med Genet. 2012;49:S54-S.
[7] Letovanec I, Peters S, Tsourti Z, Finn SP, Soltermann A, Bubendorf L, et al. Evaluation of RT-PCR Methodology for ALK Assessment in Patients with NSCLC in Europe: Results from the ETOP Lungscape Project. J Thorac Oncol. 2015;10:S693-S4.
论文作者:俞晓燕
论文发表刊物:《医药前沿》2017年8月第24期
论文发表时间:2017/9/6
标签：细胞论文; 基因论文; 阳性论文; 肺癌论文; 切片论文; 样本论文; 方法论文; 《医药前沿》2017年8月第24期论文;