李开诚[1]2002年在《脊髓源性蛋白激酶在蜜蜂毒诱致的病理性痛中的作用》文中指出病理性疼痛是一种常见的临床痛症，它既表现为持续性的自发病又伴有长时程的痛超敏(hyperalgesia)现象。为阐明病理性痛的胞内发生机制，本研究采用具有多样临床痛表现的蜜蜂毒动物模型对脊髓水平的蛋白激酶(PKs)在病理性痛中的作用机制进行研究。蜜蜂毒模型是一新的病理性痛动物模型，它不但可以诱发一持续性自发痛过程，而且还可诱致长时程的痛敏(包括原发性热和机械性痛敏以及继发性热痛敏)现象。此模型较好地模拟了临床病理性痛的特点，因此是评价痛信号转导机制的良好模型。以往研究证明PKC、PKA等胞内信号转导途径均参与介导痛信息的传递过程，但其在不同性质的痛(自发痛与痛敏，机械性与热痛敏)发生和持续慢性化过程中的作用是否相同尚无明确的结论。本研究主要利用行为学方法观察脊髓源性PKC、cAMP-PKA两条胞内信号转导途径在蜜蜂毒诱致的病理性痛中的作用，得到以下结果： 1、脊髓PKC和cAMP-PKA在蜜蜂毒诱致持续自发痛发生和持续慢性化中的作用 预先鞘内分别给予PKC、腺苷环化酶[adenylyl cyclase (AC)]和PKA拮抗剂chelerythrine chloride(CH)、SQ22536和H-89，10分钟后在大鼠一侧足底皮下注入蜜蜂毒(0.2mg／50μl)，结果发现：CH(0.01，0.1，1 nmol)，SQ22536(0.1，0.5，1 nmol)和 H七9门．00，0．of，0．l伽OI）均可对持续自发痛反应产生剂量依赖性的抑制作用；在大鼠皮下注入蜜蜂毒（0．Zm旮O…）5分钟后，鞘内给予＊＊C、＊C和＊KA桔抗剂 CH、SQ22536和 H－89，结果发现：CH（11llTIOI）和 H－89（0．lmOI）也可产生一种抑制自发痛反应的作用，6 SQ22536（m。叩u无此效应。2、脊髓＊＊C和C人M卜＊KA在蜜蜂毒诱致继发热痛敏发生和持续慢性化中的作用 预先鞘内分别给子PKC、AC和P皿桔抗剂CH、So22536和H89，10分钟后在大鼠一侧足底皮下注入蜜蜂毒（0．2 mg／50 PI八结果发现：CHO刀1，0．l，InmoD，SQ22536（0．l，0．5，lmOI）和 H－89（0．001，0．of，0．lmOI）均可对继发热痛敏产生剂量依赖性的抑制作用；在大鼠皮下注入蜜蜂毒（0．2 mg／50…）3。1、时后，鞘内给子PKC、AC和 P耿 ＃抗剂 CH、SQ22536和 H－89，结果发现：CH（l！llllol）、H－89（0．lMOI）和 SQ22536（111．－－－－OI）也可产生抑制继发热痛敏的作用。3、脊髓＊＊C和C人M卜＊KA在蜜蜂毒诱致原发性热痛敏发生和持续慢性化中的作用 预先鞘内分别给子PKC、AC和P砒 ＃抗剂CH、So22536和H七9，在大鼠皮下注入蜜蜂毒（o二＊ 扣…）4小时后检测痛敏，发现：mO刀1，0．1，InmOD可剂量依赖性地抑制原发热痛敏的作用；6 SQ22536 （．l，0．5，IIUnol冲H－89（0．001，0刀1，0．Inxnol）无此效应；大鼠皮下注入蜜蜂毒（0．2 mg／50 pl）3d’时后再鞘内分X4给予 PKC、AC和P以桔抗剂 CH、So22536和H｛9，结果发现：CH（ Illllol）可抑制原友热痛敏，而 H89（0．lmOI）和 So22536（mOI）也无此效应。4、脊髓＊＊C和C A：Nl；，A：Nl；，IKA在蜜的诱致的原发性渊性痛账生和持续慢性化中的作用 预先鞘内分别给予PKC、AC和P耶桔抗剂CH、SQ22536和H七9，在大鼠皮下注入蜜蜂毒（0．2 mg／50 PI）4d’时后检坝痛敏，发现：SQ22536（．l，0．5，Inmol） 一2 一和H－89（0刀of，0刀1，0．Inmol）可剂量依赖性地抑制原发机械性痛敏的发生；而CHO．of，0．l，Inmol）无此效应；大鼠皮下注入蜜蜂毒门．2 mg／50 pl）3小时后再分别鞘内给予PKC、AC和PM桔抗剂CH、SQ22536和H－89，4。J、时检测痛敏发现：HS叭0．Inlnol）可抑制原发性机械性痛敏的作用，6 CH（mOI）和So22536mOI）则无此效应。 结论：门）脊髓源性PKC和PKA共同激活参与了蜜蜂毒诱致的持续性自友痛和继发热 痛敏的诱导和持续慢性化过程，而CAMP则参与了蜜蜂毒诱致的持续性自发 痛的诱导过程和蜜蜂毒诱致的继发热痛敏的诱导和持续慢性化过程。（2）脊髓源性PKC参与了蜜蜂毒诱致的原发性热痛敏的诱导和持续慢性化过程， 而CAMP－PKA则不参与蜜蜂毒诱致的原发性热痛敏的诱导和持续慢性化过 程。门）脊髓源性。AAl，－PKA参与了蜜蜂毒诱致的原发性机械痛敏的诱导和持续慢 性化过程，PKC则不参与蜜蜂毒诱致的原发性机械性痛敏的诱导和持续慢 性化过程。
王燕[2]2015年在《脊髓Rac1-PAK信号通路在蜜蜂毒诱导炎性痛发生和维持中的作用机制》文中研究表明疼痛(Pain)是具有生物学意义的警戒信号,对机体具有自身保护作用。然而,急性痛长期迁延不愈时就会诱发慢性痛,不仅能造成感觉神经系统功能障碍,同时也会导致焦虑、抑郁和认知障碍等精神共病,严重影响人们的工作、学习和生活。既往50年的研究在伤害性信号从外周到脊髓的神经传导,以及外周敏化和脊髓中枢敏化机制等方面上取得较大进展。但是,由急性痛向慢性痛的演变过程,及其神经调控机制至今仍旧不清。这为临床有效诊治慢性痛设置了障碍。目前,探索疼痛发生、发展和慢性化机制的研究既是国际前沿神经科学研究的热点,也是医学难题之一。外周组织损伤和持续性炎症对机体是一种非常强烈而长期的有害刺激。组织损伤后,组织内的ATP、H+、K+等炎症介质释放,从而引起P2X3、TRPV1、TRPV2等通道激活,促使脊髓伤害感受性神经元保持高兴奋状态,并伴随交感神经活化。同时,外周组织损伤和炎症导致伤害性感受器阈值降低,引起外周敏化。当持续性的伤害性刺激信号传导至脊髓背角后,能够引起伤害性感受神经元的激活和敏化即出现所谓的神经可塑性变化,如后放电、wind up现象、LTP等中枢敏化现象。脊髓胶质细胞的活化、抑制性神经元活性降低以及源自脊髓上位脑结构,包括丘脑、皮层、扣带回、岛叶、脑干等的下行痛抑制系统作用的削弱和下行易化系统作用的增强都参与和诱导伤害性反应在脊髓背角的表达和敏化,最终导致脊髓前角运动神经元兴奋性增强,进而易化伤害性反射,形成持续性自发痛、痛敏、异常痛敏以及镜像痛(或痛敏)。经过10余年的持续性研究,我们实验室证实蜜蜂毒(bee venom,BV)痛模型能够很好地模拟临床炎性痛的病理性状态特征。向大鼠足底注射蜜蜂毒溶液,不仅可以即刻引起大鼠局部注射区组织出现长时程的红肿、渗出等炎性痛表现,而且还可以诱发出单相、时程持续达72~96小时的自发性缩足反应行为以及抬足、舔足等特别关爱受伤足部的行为活动。此外,BV注射后2小时,注射部位可出现原发性热痛敏和原发性机械痛敏,而注射部位远端出现继发性热痛敏,注射对侧足出现镜像热痛敏等。蜜蜂毒模型与以往的福尔马林、角叉菜胶、酵母多糖等疼痛模型不同,它不仅无种属差异性,还具有较多的疼痛表型。因此,蜜蜂毒模型是研究病理性痛涉及外周和中枢敏化机制的一个理想的疼痛模型。本课题工作主要基于两方面目的,一方面探索何种脊髓或者外周信号分子参与蜜蜂毒引起的伤害性反应和相应痛觉敏化现象的发生和维持过程;另一方面,以临床治疗为目的,通过蜜蜂毒模型,为临床病理性痛的防治提供新的药物治疗靶点,从而有效缓解患者的持续性或慢性痛。Rac1,又称Ras的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)蛋白是一种Rho家族成员小G蛋白。大量研究表明,Rac1参与对细胞增殖、分化、凋亡的调节,还与神经元的发育、存活和神经退行性病变密切相关。有研究指出,Rac1不仅与神经元突触的可塑性变化相关,而且参与调节神经病理性痛状态下的脊髓神经元树突棘的形态以及突触的兴奋性和信号传递过程。Tan等在多种神经病理性痛模型中发现,外周神经损伤后10天、脊髓损伤和烫伤后28天,脊髓树突棘的数量、棘头的大小和长度都发生改变,且背角WDR(wide dynamic range)神经元超兴奋,出现热痛敏和机械痛敏现象;鞘内连续3天给予Rac1特异性抑制剂NSC23766可翻转树突棘的异常改变,并降低脊髓背角WDR神经元的兴奋性,从而有效缓解神经病理性痛相关行为。然而迄今为止,在炎性痛条件下涉及脊髓Rac1信号通路的作用并未见报道。基于此,本课题通过蜜蜂毒模型研究Rac1-PAK信号通路是否参与外周炎性痛的发生和发展。采用蜜蜂毒模型和鞘内给予Rac1抑制剂的方式,利用免疫荧光组织化学技术观察Rac1在大鼠脊髓背角中的表达和细胞定位分布;应用western blotting法观察Rac1及其下游信号分子蛋白的表达变化;利用行为药理学的方法评估Rac1抑制剂对蜜蜂毒所致自发痛、热痛敏和机械痛敏的抑制作用。实验结果如下:一、Rac1在大鼠脊髓背角中的表达和细胞定位分布免疫荧光组织化学技术显示Rac1在正常大鼠脊髓背角的浅层(I-II)和深层(III-VI)均有广泛分布,且Rac1与Neu N存在共标现象,而与GFAP和Iba1则极少共标。以上结果提示相对于星形胶质细胞和小胶质细胞,Rac1主要集中表达于神经元胞体中。在大鼠一侧足底接受生理盐水或BV注射后,免疫荧光双标记法发现Rac1仍然主要分布于神经元的胞浆中。尽管BV可以引起单位面积下大鼠脊髓浅层(I-II)和深层(III-VI)的GFAP和Iba1的数量增多,但是与Rac1共标的阳性数并没有明显增多,仍与GFAP和Iba1有极少的共标。二、脊髓Rac1信号通路在大鼠BV引起的炎性痛状态下的变化通过Western blotting法检测大鼠脊髓组织中目的蛋白,实验发现Rac1及其下游信号分子PAK磷酸化水平在大鼠足底注射蜜蜂毒2 h后明显增高,而经过致炎处理后脊髓组织中的Rac1和PAK总蛋白的相对表达量无明显变化。提示,在外周持续性痛状态下Rac1信号通路被激活。脊髓鞘内给予NSC23766后,Rac1及其下游信号分子PAK的磷酸化水平被有效翻转。此外,通过Rac1激活试剂盒检测Rac1活性,进一步发现一侧足底注射蜜蜂毒可引起脊髓双侧Rac1的活性水平显着增加,且Rac1的高活性表达可被鞘内注射NSC23766完全翻转。既往研究证明丝裂原激活蛋白激酶是GTP-Rac1-PAK的下游分子靶点,且课题组前期实验已证实炎性痛刺激可引起MAPK的激活,表现为ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平增加。因此,本实验中我们深入观察炎性痛状态下Rac1信号通路是否参与MAPK信号通路的调控。实验结果表明Rac1抑制剂NSC23766可显着降低BV引起的p-ERK和p-p38增加,而ERK和p38总蛋白没有明显变化。叁、鞘内给药阻断Rac1信号通路对BV引起的炎性痛的作用在行为药理学水平上,BV注射前给予NSC23766能够剂量依赖性地完全抑制蜜蜂毒诱致的持续性自发痛反应和原发性热痛敏、镜像热痛敏,以及部分抑制原发性机械痛敏,但不抑制对侧机械痛敏;BV注射后2h给予NSC23766(后处理)能够完全抑制蜜蜂毒皮下注射所诱致的原发性热痛敏、镜像热痛敏,部分抑制原发性机械痛敏。四、鞘内注射NSC23766对大鼠运动功能的影响利用Rota-Rod装置我们检测了NSC23766对正常大鼠运动能力的影响。我们发现,在前叁次实验中,正常大鼠在仪器上的运动时间呈线性增多,而后五次大鼠在仪器上运动的时间趋于稳定。与对照组相比,Rac1对正常SD大鼠的运动协调能力没有影响。结论1、细胞水平上,Rac1广泛分布在脊髓背角浅层(I-II)和深层(III-VI),并与Neu N存在共标,表明Rac1主要表达于神经元胞体中。然而Rac1与GFAP和Iba1有极少的共标。说明Rac1主要通过神经元发挥作用。2、外周炎性痛条件下,脊髓背角GTP-Rac1-PAK-ERK/p38 MAPK信号通路被激活,而特异性抑制剂可阻断Rac1的活性及其下游MAPK信号通路。3、大鼠行为药理学上,NSC23766能够完全抑制蜜蜂毒所致的持续性自发痛和原发性热痛敏、镜像热痛敏,部分抑制原发性机械痛敏;不能对大鼠基础热和机械痛敏产生抑制作用。表明脊髓Rac1信号通路的激活参与并调控蜜蜂毒炎性条件下所致的中枢敏化的病理过程,但不参与正常的生理痛过程。
彭小莉[3]2003年在《筛选镇痛抗炎中药循证实验医学方法的建立及应用探讨》文中研究指明中医学对痛证的认识及其理、法、方、药的形成，有着悠久的历史。但长期以来，一方面因中医证和方剂等多因素复杂性，临床观察和临床实验仅限于低水平重复，缺乏设计良好的大的多中心、随机分组、双盲、安慰剂对照实验的系统评价的客观证据，而主要靠“经验医学”方法，因此造成中药镇痛疗效一直难以得到国际上公认。另一方面，在镇痛中药的基础研究中，由于知识老化和对国际上关于临床病理性痛发生机制研究的跟踪不及时，在筛选镇痛新药时，还不能认识到“生理性痛”与“病理性痛”发生机制的差异性，以及病理性痛发生和持续慢性化过程中机制的多样性，所以常困动物模型的选择不当，导致药效无法正确评价，也使药物的作用部位和机制研究难以深入下去，这严重阻碍了镇痛中药的研究和开发。要克服和解决上述问题的关键是在临床和基础双轨研究中建立一整套“循证医学”的实验方法，对中药疗效进行客现的而非主观的临床前和临床期评价。为了探讨此问题，本实验拟探讨建立一个“循证医学”的动物实验方法，即为了筛选和评价有效镇痛抗炎中药而建立了一套动物实验模型方法。 外周组织或神经损伤可引起持续性自发痛、原发性热和机械性痛敏以及损伤部位红、肿、热等炎症反应。而建立与临床病理性炎性痛相似的动物模型对全面评价药物的镇痛抗炎作用意义重大。成年清醒大鼠一侧后肢足底皮下注射蜜蜂毒（BV，0．2％，50…）可立即诱发注射侧长达1小时以上的单相自发痛行为（如注射侧持续自发缩足反射行为），并伴有持续3－4天的原发性热和机械性痛敏现象以及注射肢体红肿等炎症反应。皮下注射福尔马林（F，2．5％，50 pl）也可诱导出一双相的持续性自发痛过程，但无长时程的痛超敏现象．因为经过大量实验研究，这两个动物痛模型能够反映临床病理性痛特点，而且发生机制较清楚，所以较适合筛选镇痛中药。 根据药性，中药可大致分为平性、温热和寒凉叁大类，在筛选有效镇痛杭炎中药时应该考虑这叁类药性的天然植物药在作用效果和机制上是否一致的问题．困此，本实验采用蜜蜂毒模型和福尔马林模型，选用已在其他模型上证实有镇痛杭炎作用的平性类、温热类和寒凉类的叁类中药的镇痛抗炎效果做比较评价，以期为今后大规模筛选和评价镇痛抗炎中药的有效成分，开展有效成分血液动力学及其神经药理学机制研究提供模型系统。 此外，为了进一步了解这叁类中药在预防和治疗两方面的作用效果是否一致，本研究在给药时间上设计分为两个给药组，即致痛前（致痛剂注射前10－30Inin）和或致痛后（在持续性自发痛完全建立之后smin，或在痛敏完全建立并达到稳定状态的 2－4小时期间）给药。一、4夯匆搅衅亿翔织拨涝诊早种燃牲g发疗封懈疲嘉1．乎性类中来对夕人寄亿学纽织握涝诊早种样尊牲8发瘀时件刀痰果 为了研究平性类中药的抗外周化学组织损伤诱导的持续性自发痛的 作用效果，本部分实验选择两种市售中药镇痛制剂一鸡矢藤和野木瓜注 射液，评价了这两种注射液静脉给药在BV模型和F模型上的抗伤害作 用。在 BV模型上，致痛前分别注射 0．32 mwg、1石 mwg和 9刀 mwg 叁个剂量的市售浓度为 500％门 支）鸡矢藤注射液或市售浓度为 250o门．og／Zml／支）野木瓜注射液，对 BV诱致的 lh自发缩足脓次数 具有剂量依赖性抑制作用；致痛 5 min后分别给予鸡矢藤或野木瓜注射液 对BV诱发的自发痛反应也产生显着的抑制作用。在F模型上，致痛前 或致痛后分别给予单一有效剂量门石 mwg）的鸡矢藤或野木瓜注射液 对F诱发的自发痛反应也产生显着的抑制作用。实验结果提示，对外周 化学组织损伤诱致的持续性自发痛反应，鸡矢藤或野木瓜注射液有显着 的抑制作用，而且没有模型间差异。2．水喇和挟于捞乃种中穷勿斡对今尸lithe织握涝劳早勿燃性力发瘀 Mk＄ ＃lbf1Hg 内服药物是中医临床治疗的最主要的方法。汤剂（即水煎剂）和粉 －3－ 第 四 军 医 大 学 硕 士 学 位 论 文 剂是最为常用的制备简便、便于服用和保存的口服中药剂型。由于制备 工艺不同，水煎剂和冻干粉的对持续性自发痛的抗伤害是否有差异？困 此，本部分实验选择了被认为有镇痛抗炎作用的白芜，比较观察了水煎 剂和冻干粉两种剂型对化学组织损伤诱致的持续性自发痛反应的抗伤害 作用。致痛前分别给予 0．lgiml、0．4 g／ml和 2．0 g／il叁个剂量的白茧水 煎剂和冻干粉门 ml／kg）对 BV诱致的 lh自发缩足反射次数具有剂量 相关性抑制作用；0．4g／inl的白芜水煎剂和冻干粉对F诱致的双相性自发 缩足反射也有显着的抑制作用，表明白茧对外周化学组织损伤诱导的持 续性自发痛的抑制作用，没有制剂间和模型间差异。3．温娇姜4符对外尸化翔织损涝诊早的燃姓g发虏伽发果的地致研 S 实验1、2的结果显示中药（天然植
郑继宏[4]2001年在《P2x受体及NK受体在蜜蜂毒诱致的病理性痛中的作用》文中研究表明病理性疼痛是一种常见的临床痛症，它既表现为持续性的自发痛又伴有长时程的痛超敏（hyperalgesia）现象。为阐明病理性痛的发生机制，本研究采用蜜蜂毒模型对P2x受体及NK受体在病理性痛中的作用机制进行研究。蜜蜂毒模型是一新的病理性痛动物模型，它不但可以诱发一持续性自发痛过程，而且还可诱致长时程的痛敏（包括原发性热和机械性痛敏以及继发性热痛敏）现象。此模型极好地模拟了临床病理性痛的痛症，优于以往的其它病理性痛模型。P2x受体属于离子门控型受体，目前已有7种受体亚型被克隆，ATP为该受体的内源性激动剂；NK受体属于G-蛋白耦联受体，由NK1，NK2，NK3叁种受体亚型组成，SP，NKA，NKB分别为该叁种受体的内源性激动剂。P2x受体及NK受体广泛分布于中枢及外周神经系统，不同亚型受体的分布特征有所不同。以往研究证明P2x受体及NK受体参与介导痛信息的传递过程，但其在不同性质的痛（自发痛与痛敏，机械性与热痛敏）发生和持续慢性化过程中的作用是否相同尚无明确的结论。本研究主要利用行为学方法观察脊髓源性和非脊髓源性P2x受体及脊髓源性NK受体在蜜蜂毒诱致的病理性痛中的作用，得到以下叁个方面的结果：1．脊髓P2x受体在蜜蜂毒诱致的持续自发痛的作用 预先鞘内给予P2x受体拮抗剂磷酸吡哆醛-6-偶氮苯基-2'，4'-二磺酸（PPADS），15分钟后在大鼠皮下注入蜜蜂毒①．2 mg乃0 pl），结果发现 5 pg和 10 pg PPADS可产生一种剂量依赖性的抑制效应，而30 pg PPADS对自发痛反应不产生任何抑制作用。2．外周n 受体在蜜蜂毒诱致的自发痛和痛敏中的作用 在皮下注入蜜蜂毒 5分钟前，在大鼠足底皮下给予PPADSQ0，40 nmol乃0…），结果发现两个剂量的PPADS对自发痛均产生抑制效应，两个剂量的抑制效应无显着差别。给予蜜蜂毒2小时后，检测两侧足底对机械刺激阈值及热刺激潜伏期的变化，结果发现外周给予PPADS对蜜蜂毒诱致的原发性机械性痛敏无作用，而对原发性热痛敏产上一剂量依赖性的抑制作用，此外，同样处理后对继发性热痛敏无抑制作用。3．脊胆NK受体在蜜蜂毒诱致的自发痛和痛敏中的作用 预先鞘内给予非选择性 NKIo受体桔抗剂 spantide （刀5，0．5，5 figX 5分钟后在大鼠皮下注入蜜蜂＃N．2 mg／50叫，结果发现叁个剂量的 spantide对自发痛产生一剂量依赖性的抑制效应，5 pg spantide对原发性及继发性热痛敏也具有明显的抑制作用，而对原发性机械性痛敏无作用。对照组在蜜蜂毒注入3．4小时后鞘内给与spantide发现药物对机械性及热痛敏均无翻转作用。蜜蜂毒注入后5分钟鞘内给予 spantide 乃 Ug）对长时程自发痛也有抑制效应，药物起效时间约为 5分钟。 预先鞘内给子选择性 NK3受体桔抗剂 SR142801O0，65 pg＞ 5分钟后在大鼠皮下注入蜜蜂毒①．2 mg乃0 卜，结果发现 SR142801对自发痛无明显抑制作用，对机械性痛敏及热痛敏亦无作用。蜜蜂毒注入后5分钟鞘内给予SR142801 ＊0pg）对长时程自发痛无抑制效应。对照组在蜜蜂毒注入3＊小时后鞘内给与SR142801发现药物对机械性及热痛敏均无翻转作用。（l）脊髓源性 PZX受体参与了蜜蜂毒诱致的持续性自发痛的诱导过程。
郝键[5]2008年在《外周丝裂原活化蛋白激酶在蜜蜂毒肽诱致病理性痛中的作用》文中提出在过去的10年中,本研究组在Lariviere and Melzack提出蜜蜂毒(Bee venom,BV)模型的基础上进行了更进一步的研究。该模型的特点是可以模拟临床病理性痛的叁大表现,包括:1)持续性自发痛,2)原发性热痛敏和机械痛敏,3)继发性痛敏和“镜像痛敏”。同时本研究组还应用在体电生理单细胞胞外记录技术,在蜜蜂毒足底注射侧脊髓背角相应节段诱导出脊髓背角广动力域(wide-dynamic-range,WDR)神经元自发放电反应增强及对注射部位热和机械刺激反应增强现象,其持续时程和反应形式与行为学的结果一致。随后本研究组还对蜜蜂毒成分进行了深入研究,蜜蜂毒是含有二十余种成分的复合物,其主要成分包括:(1)蜜蜂毒肽(Melittin),是蜜蜂粗毒中最主要(在冻干的粗毒中占50%左右)的物质成分;(2)蜂毒明肽(Apamin),在冻干的粗毒中仅占2%;(3)其他主要致伤害成分,如磷脂酶A_2(12%)、透明脂酸酶(小于3%)、肥大细胞脱颗粒肽(2%)、组胺(1.5%)、Melittin F等。因为已有报道称皮下分别注射磷脂酶A_2、透明脂酸酶、肥大细胞脱颗粒肽、组胺和5-HT等化学物质不能引起像蜜蜂毒和福尔马林那样的长时程持续自发缩足反射行为,而且也不能长时程激活外周初级传入C纤维和脊髓背角伤害性神经元持续放电增强,所以推测这些物质不是蜜蜂毒中主要致炎致痛成分。我们还应用行为药理学、在体单细胞胞外记录、离体单细胞全细胞膜片钳记录以及钙成像等技术对蜜蜂毒肽的生物学作用及机制进行深入研究,发现蜜蜂毒肽(Melittin)是蜜蜂毒中主要的致炎致痛化学成分,是蜜蜂毒诱发持续性自发痛、热和机械痛敏以及炎症反应的主要因素。它可以直接敏化外周初级感觉神经元,开放细胞上辣椒素受体的非选择性阳离子通道(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1),从而介导蜜蜂毒肽诱致的持续性自发痛和热痛敏以及脊髓背角伤害性神经元的功能改变,还可以通过激活磷脂酶A2-脂氧合酶代谢途径并在胞内蛋白激酶A、C的协助下调节TRPV1的开放从而引起皮下注射蜜蜂毒肽后行为学上表现的持续性自发痛和热痛敏等,并且已有人体实验证明蜜蜂毒肽可以引起自发痛和原发性机械痛敏。然而蜜蜂毒肽引起的多种痛相关行为的外周传入机制还未完全清楚地描述。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinases, MAPKs)作为一类在进化中高度保守的蛋白激酶,参与了细胞内部许多方面的调节,它通过将胞外刺激转化为胞内的转录和翻译后反应,从而将细胞表面的受体同胞内关键的调节目标联系起来,在细胞信号传导通路中发挥关键的作用。在哺乳动物细胞中,有叁个MAPK家族成员已经得到比较清楚的描述,即ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase 1 and 2),c-Jun N末端激酶/应激激活的蛋白激酶(JNK/SAPK,c-Jun N-terminal kinase/stress-actived protein kinase)和p38激酶。其中ERK、JNK以及P38丝裂原活化蛋白激酶在蜂毒肽引起的伤害性刺激反应以及痛敏中是否发挥了作用?其ERK、JNK、P38的作用是否一致?当前的研究能否帮我们进一步阐述蜂毒肽引起的多种痛相关行为的外周传入机制?于是我们展开了外周丝裂原活化蛋白激酶在蜜蜂毒肽诱致的病理性痛中作用的相关研究。实验方法主要是在大鼠后足底皮下局部注射蜜蜂毒肽引起的炎症反应部位先后分别注射细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)抑制剂U0126、c-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)抑制剂SP600125以及P38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂SB239063,通过行为药理学的方法观察它们在蜜蜂毒肽诱致的病理性痛中的作用。结果:(1)在未进行任何处理的大鼠后足皮下注射ERK、JNK、P38抑制剂不能改变大鼠对热反应的潜伏期和对机械刺激的反应阈值,这提示在正常生理状态下,这叁个主要外周丝裂原活化蛋白激酶亚家族成员在正常痛感觉传递过程中作用较小。(2)通过前给药方式ERK、JNK及P38抑制剂能明显的抑制蜂毒肽诱发的持续性自发痛的产生,并呈剂量依赖性;通过后给药的方式也能明显的抑制蜂毒肽诱发的持续性自发痛的维持。(3)对于热痛敏,在前给药组中,ERK、JNK、P38抑制剂均能抑制蜂毒肽诱发原发性热痛敏的产生;且在后给药组中于蜂毒肽皮下注射2到3小时后分别在同侧皮下注射ERK、JNK、P38抑制剂也能部分逆转热痛敏,说明这叁种蛋白激酶在蜂毒肽诱发原发性热痛敏产生和维持的过程中发挥了作用。(4)对于机械性痛敏,无论是通过前给药方式还是通过后给药方式, ERK与JNK抑制剂对蜂毒肽诱发原发性机械痛敏无抑制作用,说明这两种蛋白激酶并未参与蜂毒肽诱发原发性机械痛敏的产生与维持;而P38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂对原发性机械痛敏的产生无抑制作用,对原发性机械痛敏的维持有部分抑制作用。(5)在对侧足底局部注射这叁种激酶抑制剂,对注射蜂毒肽一侧足底的持续性自发痛、原发性热和机械痛敏的产生和维持也无影响,这样就排除了这叁种抑制剂的系统作用途径。结论:外周丝裂原活化蛋白激酶的活化可能参与蜂毒肽诱发的自发痛以及原发性热痛敏的产生和维持,但是对蜂毒肽诱发的原发性机械痛敏无作用,提示我们在外周机械和热痛敏传递的分离。
李开诚[6]2005年在《蜜蜂毒肽诱发炎性痛和痛敏的细胞和分子机制》文中认为过去的8年中,在Lariviere和Melzack(1996)描述皮下注射蜜蜂毒产生持续自发痛(他们只描述了负重4级法的行为学定量结果)的基础上,本研究组对皮下注射蜜蜂毒进行了长时程观察,发现这种处理可以模拟出临床病理性痛的叁大表现:1)持续自发痛,2)原发性热和机械性痛敏,3)继发性痛敏和“镜像痛敏”(Mirror-image hyperalgesia)(Chen et a1., 1999b; Chen andChen, 2000, 2001; Chen, 2003)。同时应用在体电生理单细胞胞外记录技术,成功地在注射侧脊髓背角相应节段诱导出脊髓背角广动力域(wide-dynamic-range, WDR)神经元自发放电反应增强和对施加在注射部位热和机械刺激反应性增强现象,其持续时程和反应形式与行为学的结果相似(Chen et a1., 1998, 1999a; You and Chen, 1999; You et a1., 2002; Zheng et a1.,2002; Chen, 2003)。而蜜蜂毒是一个含有二十余种成分的复合物(Habermann,1972; Dempsey, 1990; Lariviere and Melzack, 1996),其主要成分有:(1)蜜蜂毒肽(Melittin),是蜜蜂粗毒中最主要(在冻干的粗毒中占50%左右)的化学物质成分;(2)蜂毒明肽(Apamin),在冻干蜜蜂粗毒中仅占2%;(3)其它主要致伤害成分,如磷脂酶A_2(12%)、透明质酸酶(<3%)、肥大细胞脱
陈会生[7]2003年在《实验性镜像痛敏及其神经机制研究》文中研究说明在临床上，躯体某一部位损伤后，不但可导致损伤部位的疼痛和痛敏，而且有时也可导致身体相对应体节的对称部位出现疼痛和痛敏的现象。这种躯体一侧组织或神经损伤可导致对侧相对应的部位出现疼痛的现象，被称为镜像痛(Mirror-image pain)。至今镜像痛的发生机制尚不清楚。最近我们在蜜蜂毒动物实验模型上研究发观：大鼠一侧后肢足底皮下注入蜜蜂毒不但可诱致持续性自发痛反应、原发性热和机械性痛敏，而且还可诱致非注射侧热痛敏(Chen et al., 1999a)，而且痛敏部位具有对称性，因而称之为实验性镜像热痛敏。这个实验现象为研究镜像痛或痛敏的外周或中枢神经机制提供了有用的模型。在硕士课题中，作者进一步发现皮下注入蜜蜂毒诱致的镜像热痛敏具有空间的对称性和时程上的平行性(Chen and Chen 2000)，并且首先证明了脊髓对侧中枢敏化介导了实验性镜像热痛敏的发生(Chen et al., 2000)。在以往发现的基础上，本课题进一步探讨了以下几个问题： (1) 实验性镜像热痛敏赖以持续的中枢敏化过程的建立是否由外周皮肤组织损伤部位所发生的持续性冲动所驱动?如果是，这个过程是否具有中枢累加的“时间窗口”效应? (2) 参与介导实验性镜像热痛敏的初级传入纤维是否为辣椒素敏感的纤维(主要是C和部分Aδ纤维)? 第四军医大学博士学位论文一 门）实验性镜像热痛敏是否受来自延髓网状结构．脊髓背角的下行痛易化系统的影 响？ （4）脊髓水平的兴奋性氨基酸谷氨酸受体（NMDA和非NMDA受体）在实验性镜 像热痈敏的发生过程中的作用如何？结果：二．实验性镜像热邢敏赖以持续的中枢敏化过程的建立依赖伤害性信息在脊髓水平的时间总和，且这个过程具有时问窗口 我们以前的研究己经证明：中枢敏化的过程参与了蜜蜂毒诱致的实验性镜像热痛敏的发生，本部分实验拟探讨中枢敏化的建立是否由外周皮肤组织损伤所诱导。如果是，这个过程是否存在一个中枢累加的“时间窗口”效应。为了证明这个假设，实验采用成年 SD大鼠，将两个剂量的蜜蜂毒注入一侧后肢足底，然后在注射 5、10、20分钟后分别切断注射侧坐骨神经。结果表明：低剂量（O．lmghop！）蜜蜂毒注射需要Zo分钟，而高剂量（0．Zmg／so卜1）蜜蜂毒注射需要10分钟就能够引起实验性镜像热痛敏。这个结果提示：外周皮肤组织损伤所致的伤害性冲动触发中枢敏化的建立，且在脊髓水平存在一个累加的“时间窗口”效应。 （具体内容见发表论文叁）2．辣椒素敏感的初级传入纤维参与介导实验性镜像热痛敏的发生 为了进一步探讨参与实验性镜像热痛敏的外周初级传入纤维的性质，本部分实验将辣椒素局部涂敷坐骨神经和隐神经，以破坏辣椒素敏感的初级传入细纤维。同时，将其溶媒 （Tween80：ethanol：Saline＝1：l：8）局部涂敷于坐骨神经和隐神经或将辣椒素涂敷于局部肌肉作为对照。结果表明：（l）与对照组相比，毁损辣椒素敏感的初级传入纤维可明显地抑制蜜蜂毒诱致的持续性自发缩足反射：（2）同样处理也可完全阻断实验性镜像热痛敏的发生。该结果提示，辣椒素敏感的初级传入纤维参与介导蜜蜂毒诱致的持续性自发痛的发生，并进而触发中枢敏化的建立。（具体内容见发表论文四）3．来自延髓吻段内侧部的下行痛易化系统激活参与实验性镜像热痛敏的发生 近年来越来越多的证据表明，来自脊髓上位延髓吻段内侧部（Rostral Medal Medul4 －2－ 第四军医大学博士学位论文一RMM）的下行痈易化系统参与组织和神经损伤诱致的病理性痛的发生过程。为了观察RMM．脊髓背角下行痛易化系统在实验性镜像热痛敏的作用，本部分实验将双侧RMM进行化学损毁。结果表明，双侧化学损毁IUiM的神经元可明显抑制蜜蜂毒诱致的持续性自发痛，并阻断实验性镜像热痈敏的发生，但对原发性热和机械性痛敏无作用。这个结果提示，来自脊髓上IUAM的下行痛易化系统激活参与了蜜蜂毒诱致的持续性自发痛和实验性镜像热痛敏（中枢敏化）的发生，但不参与原发性热和机械性痛敏的发生过程。（具体内容见发表论文五）4．脊髓水平的NMDA和非NMDA受体参与介导实验性镜像热痛敏的发生 兴奋性氨基酸谷氦酸受体在伤害性信息的传递中扮演着重要角色，而且在脊髓中枢敏化建立的过程中也发挥重要作用。本部分实验采用在蜜蜂毒注射前鞘内分别给予NMI）A和非NMI）A受体桔抗剂MK－801和CNQX，观察其对蜜蜂毒诱致的实验性镜像热痛敏的作用。结果表明：同对照组相比，蜜蜂毒注射前10分钟鞘内分别给予y－801和CNQX可明显抑制蜜蜂毒诱致的自发缩足反射，阻断镜像热痛敏的发生，但对原发性热和机械性痛敏的发生没有作用。这个结果提示，脊髓水平的NMDA和非hA受体在蜜蜂毒诱致的待续性自发痛和实验性镜像热痛敏的发生过程中扮演着重要角色，但在原发性热和机械性痛敏中不扮演任何角色。结论： 综合以往和本研究?
李萌萌[8]2002年在《新生大鼠持续炎症伤害性刺激对成熟后痛敏感性和脊髓NGF-TrKA、BDNF-TrKB、IL-1β-COX2表达的影响效果》文中研究指明近年来，实验研究发现新生儿受到伤害性刺激时，可以影响到他们成年后痛感受能力，因此对疼痛的胚胎和生后发育分子与细胞生物学的深入研究具有重要的临床意义。虽然目前临床和少数基础研究资料已经显示新生大鼠生后持续伤害性刺激可导致痛行为异常和脊髓背角灰质结构重塑，但是在以下方面尚缺乏系统研究资料：(1)新生持续伤害性刺激对成熟动物不同病理性痛行为(持续性自发痛、原发性热或机械痛敏、继发性痛敏)的影响是否一致?(2)新生持续伤害性刺激对NGF-TrkA、BDNF-TrkB、IL-1β-COX2在脊髓的发育是否有影响?为了阐明以上问题，本实验应用具有多样临床病理性痛特征的蜜蜂毒动物痛模型和常规ABC法免疫组织化学染色技术对上述问题在以下四个方面进行了系统研究，其结果如下： — — 一、新生大鼠基础热刺激缩足反射潜伏期、机械刺敌缩足J气射阈值及外周化学组织损 伤诱致新生大鼠持续自发痛反应和原发性热痛敏或机械痛敏的年龄变化特点 l．新生不同年龄大鼠（PI、P4、P7、P14、PZI、P28）在相同条件下测量每只大鼠 的基础热刺激缩足反射潜伏期OWTL）和机械刺激缩足反射阈值①ViAT）．基础 PVTh在N时最低，随着生后年龄增长而增高，至P7时达到最高峰，此后在 P7－P28友育期间平稳．舢＊PWMT在PI－PZI友育期间极低且保持平稳，动物表 现为对机械刺激高度敏感．从PZI－28友育期间；PVMT逐渐增高，且在P28时 比PI－P21期间的PWMT均值增高了10倍． 2．新生大鼠在不同年龄（PI、P4、P7、P14、PZI、P28）给予外周化学组织损伤（皮 下注射蜜蜂毒）诱致新生大鼠持续自友痛反应其结果是：新生大鼠自PI开始对 皮下注射蜜蜂毒已具有自发痛反应，而且随着蜜蜂毒浓度增高，动物1小时自友 缩足反射次数的平均总数增多，提示皮下注射蜜蜂毒对新生大鼠持续自发痛反应 具有浓度依赖性作用．且对每个生后年龄蜜蜂毒最大剂量．反应浓度组进行1小 时时程观察，友现PIP28新生大鼠对皮下蜜蜂毒的反应形式，与成年相似，呈 现单相反应形式． 3．新生大鼠在不同年龄（PI、P4、P7、P14、PZI、P28）遭受外周｛匕学组织损伤导 致新生大鼠热病敏的发生，非伤害性刺激（皮下注射生理盐水）和伤害性刺激（皮 下注射蜜蜂毒）均可导致 PI－P14动物的 PWTh T降，但是从 P14动物开＆g具有 分辨痛刺激的能力，困为此年龄只有蜜蜂毒才弓】起 PWTL下降，而生理盐水对 PW’TL无显着影响。接受外周伤害性和非伤害性刺激的新生大鼠在刊－ZI均表现 对机械或触刺激超敏感，但在 PZI之后；只有蜜蜂毒才可以弓】起 PWMT T降， 而生理盐水则对PWMT无影响。 二、新生不同年龄大鼠外周化学组织损伤处理对其成熟后基础热刺激缩足反射潜伏期 或机械刺激缩足反射阈值及持续自发痈反应和痛敏的影响效果 上 在新生 PI、P4、P7、P14、P21和 P28给予皮下蜜蜂毒或生理盐水刺激之后，使 动物成活至 2－3个月（成年）分别测定每只大鼠基J出 PWTL、PW’MT。成熟大鼠 基础＊WT L组间无显着差异（P＞0刀5），但基础＊WM T在n1以前经＊V处理 — — …T显着降低（P＜0．01）。 2．对上述成年大鼠在原损伤部位再次注射蜜蜂毒造成局部组织2次损伤，结果表明 新生不同年龄给予伤害性刺激对成年 2次伤害性刺激弓】起的持续性自发痛均具有 增强作用． 3．对成熟大鼠痛敏时程（2、4、8、24、48、72、96，J、时）观察发规新生PI－PZI伤 害性处理和非伤害性处理对成年大鼠原损伤部位再次局部组织损伤所诱致的热 痛敏的影响无显着差别，提示成年大鼠热痛敏发生的程度不受新生伤害性刺激经 历的影响。但是；新生 P42给子蜜蜂毒处理的成年大鼠不出现蜜蜂毒诱致的机 械痛敏或触诱发痛，而成年大鼠皮下蜜蜂毒再处理仍可在新生生理盐水处理的部 位引起原发性机械病敏，痛敏程度与以往成年动物结果相似．新生 PZI给子蜜蜂 毒处理可以显着增强成年蜜蜂毒诱致的机械痛敏或触诱发痛． 叁、新生不同年龄大鼠外周化学组织损伤处理对其成熟后基础痛阈与持续自发痛反应 和痛敏影响效果的性别差异 1．不同龄新生大鼠（出生后1、4、7、14、21、28d）外周组织损伤对雌雄大鼠成年 后的基础N『TL无显着影响；且不同性别伤害性
参考文献：
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[3]. 筛选镇痛抗炎中药循证实验医学方法的建立及应用探讨[D]. 彭小莉. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[4]. P2x受体及NK受体在蜜蜂毒诱致的病理性痛中的作用[D]. 郑继宏. 第四军医大学. 2001
[5]. 外周丝裂原活化蛋白激酶在蜜蜂毒肽诱致病理性痛中的作用[D]. 郝键. 第四军医大学. 2008
[6]. 蜜蜂毒肽诱发炎性痛和痛敏的细胞和分子机制[D]. 李开诚. 第四军医大学. 2005
[7]. 实验性镜像痛敏及其神经机制研究[D]. 陈会生. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
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