( 浙江大学医学院附属儿童医院眼科 浙江 杭州 310003)
通讯作者，E-mail：zjulb@zju.edu.cn
【摘要】目的：探讨地高辛(Digxon)对氯化钴(CoCl2)作用下体外培养SD大鼠视网膜Müller细胞系（rMC-1）ZnT8表达的影响。方法：rMC-1随机分为对照组、氯化钴(200 μM)处理组和地高辛(100 nM))治疗组，q-PCR、WB检测不同处理组ZnT8/ HIF-1α mRNA、蛋白水平的改变。结果：与对照组相比，在氯化钴(200 μM)处理后ZnT8 mRNA、蛋白水平表达显著性降低(p<0.01)，HIF-1α显著性增加(p<0.01)。经地高辛处理后，ZnT8 mRNA、蛋白表达显著性增加(p<0.05)，HIF-1α mRNA、蛋白显著性降低(p<0.01)。结论：地高辛能显著增加ZnT8转录及蛋白水平的表达，抑制HIF-1α表达可能是地高辛调控ZnT8的一个机制。
关键词: 地高辛；锌离子转运体8；低氧
Effect of digxon on hypoxia induced rat Müller cells ZnT8 expression
Kang daohuan, Lu bin
Department of Ophthalmology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 310003
Corresponding author: E-mail: zjulb@zju.edu.cn
Abstract: Objective: To discuss the effect of digxon on cobalt chloride SD cultured rat retinal Müller cell line in vitro (rMC-1) ZnT8 expression. Methods: rMC-1was randomly divided into control group, cobalt chloride (200 μM) treatment group and digxon (100 nM) treatment group. q-PCR、WB were used to detect the changes of ZnT8/ HIF-1α mRNA and protein level in different treatment groups. Results: Compared with the control group, the expression of ZnT8 mRNA and protein levels significantly decreased. (p<0.01) under the treatment of cobalt chloride (200 μM). After treatment with digxon (100 nM), the expression of ZnT8 mRNA and protein increased (p<0.05), whereas HIF-1α expression showed opposite results. Conclusion: Digxon increase the expression of ZnT8 transcriptional and protein levels, Inhibition of HIF-1α expression may be a mechanism for digoxin to regulate ZnT8.
Keywords: Digxon；ZnT8；Hypoxia
锌在人体内含量丰富，并且在许多生物活动中发挥重要作用，如说胰岛素的储存、分泌和生物活性。在细胞内，锌离子主要受ZnT 和ZIP两大家族调节，ZnT的作用为转运细胞质内的锌离子到细胞外或细胞核内，ZIP为转运细胞外的锌离子到细胞质。ZnT8已经报道与增加2型糖尿病有关，并且也是1、2型糖尿病的自身抗原基因。
ZnT8在视网膜外核层、外丛状层、神经节细胞层、和神经纤维层强烈表达。同时ZnT8表达于视网膜色素上皮细胞和Müller 细胞。锌离子在视网膜含量最高，并且在视网膜发挥正常功能中起重要的作用。鉴于锌离子对视网膜重要性，我们检测缺氧是否影响Müller细胞ZnT8的表达。本研究目的是探究缺氧对胶质细胞及视网膜ZnT8表达的影响及地高辛对低氧诱导Müller细胞 ZnT8表达是否具有保护作用。
实验材料及方法
实验材料：细胞培养基(HyClone)，RNAiso PLUS、逆转录试剂盒（TakaRa），胎牛血清(Gibco)，ZnT8、Gapdh抗体(Proteintech)，地高辛够于(aladdi)。
实验器材：细胞培养皿、离心管(Corning)，定量PCR仪、蛋白电泳仪(BIO-RAD)，紫外分光光度计、Nanodrop ND-2000，超净工作台(海尔)，超声粉碎仪(BRANDSON)。
实验方法
RNA提取及Real time RT-PCR检测ZnT8/ HIF-1α mRNA
rMC-1细胞系，平均传到六孔板分组（正常对照组、CoCl2组、CoCl2 +地高辛组），12-24小时后弃培养液，用Trizol提取RNA，再以cDNA作为模板，加入ZnT8/ HIF-1α引物进行PCR扩增。PCR引物序列：ZnT8 Forward：5′- AAGTGGAGACTCTGTGCTGCTTCA-3′, Reverse：5′-GGCCTCGATGACAACCACAAAGAA-3′; HIF-1α Forward：5′- ACTATGTCGCTTTCTTGG -3′, Reverse： 5′- GTTTCTGCTGCCTTGTAT -3′; β-actin Forward:：5-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′, Reverse：5′- GGACTCATCGTACTCCTGCT-3′。
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蛋白提取及Western blot测定ZnT8/ HIF-1α蛋白的表达
收集各组细胞加入组织蛋白抽提液提取蛋白，BCA法测蛋白浓度后电泳，再转膜转至PVDF膜上，脱脂牛奶封闭。ZnT8一抗4℃孵育过夜，根据一抗来源孵相对应的二抗。孵完二抗的蛋白膜显影，得出WB结果。
统计学处理
应用spss 17.0统计软件进行统计学分析。蛋白的表达量=目的蛋白/内参，基因的表达量用△ct法计算，t检验检测不同样本的表达差异是否有统计学意义，（p<0.05有统计学意义）。
结果
ZnT8 mRNA、WB在CoCl2处理的rMC-1细胞表达显著性下降，并且地高辛治疗后显著性提高
ZnT8 mRNA 和蛋白水平在CoCl2处理后的表达与正常对照组相比分别下降32.25% 和 30.33% ，同时在地高辛治疗后分别上升 18.50% 和 16.67% (图.1 A、B)。
图. 1 ZnT8 mRNA、WB在CoCl2处理的rMC-1细胞表达显著性下降，并且地高辛治疗后显著性提高。
HIF-1α mRNA、WB在CoCl2处理的rMC-1细胞表达显著性升高，并且地高辛治疗后显著性下降
HIF-1α mRNA、蛋白水平在CoCl2处理后的表达与正常对照组相比分别增加54.60% 和 42.03% ，同时在地高辛治疗后分别下降 48.96% 、45.76% (图.2A、B) 。
图. 2 HIF-1α mRNA、WB在CoCl2处理的rMC-1细胞表达显著性增加，并且地高辛治疗后显著性降低。(Co=CoCl2、D=Digoxin，**代表p<0.01，n=4)
讨论
在视网膜中，锌转运蛋白和锌结合蛋白维持细胞内锌离子稳态。ZnT8是广泛分布于视网膜上其作用为转运细胞质内的锌离子到细胞外或细胞核内。锌离子在视网膜生理病理过程中发挥重要作用，细胞内锌离子的不足会对视网膜产生损害。许多研究表明锌离子缺乏会导致很多种超微结构和电生理的眼部改变，如影响暗适应、引起白内障、甚至致盲。Duzguner.V 研究报道，补充锌离子及抗氧化剂对延缓进展型老年黄斑变性的进程有保护作用，并且也能提高视力[1]。然而锌离子在细胞内过多积累也会对细胞产生毒性，Yoo, MH.etal研究表明内源性的锌离子可能会引起视网膜神经缺血坏死[2]。
低氧诱导因子（HIF）是组织适应低氧的转录调节因子，在缺氧条件下HIF-1α的羟基化减弱，这会导致HIF-1α蛋白的稳定和在细胞内的积累。在我们的实验中，CoCl2处理的rMC-1细胞中HIF-1α mRNA和蛋白水平明显升高，此结果与文献报道的结果相一致[3]。在视网膜，由于血管破裂、闭塞等原因发生缺氧而引起各种疾病，如糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变等。作为强心苷的一种，临床上地高辛用于治疗充血性心力衰竭等心律失常，并且已证实地高辛可以抑制缺氧诱导的HIF-1a的表达[4]，这一结果在本研究中也得到验证。
已有研究表明，低浓度的锌离子在视网膜上具有神经保护作用并且静息细胞内游离锌离子浓度为1.07 nM，然而高于或低于这个水平可能会产生对细胞产生毒害作用[5]。因此，细胞内锌离子蓄积可能是有毒性作用的。本研究中，ZnT8 mRNA、蛋白水平在CoCl2处理后的表达与正常对照组相比显著性下降，并且在地高辛治疗后显著性上升(图.1)，同时与HIF-1α mRNA、蛋白水平变化相反(图.2)，提示HIF-1α在ZnT8的调控中其重要作用，地高辛通过抑制HIF-1α的表达来上调ZnT8的表达。
综述，缺氧可能通过富集HIF-1α抑制ZnT8转录及蛋白水平的表达，导致细胞内锌离子蓄积进而可能产生视网膜毒害作用。我们的初步结果表明地高辛通过抑制HIF-1α，进而上调ZnT8表达可能是地高辛调控ZnT8的一个机制。此机制还需动物及其他实验进一步研究验证。
参考文献
[1]DUZGUNER V, KAYA S. Effect of zinc on the lipid peroxidation and the antioxidant defense systems of the alloxan-induced diabetic rabbits[J]. Free radical biology & medicine, 2007,(42):1481-6.
[2]YOO MH, LEE JY, LEE SE et al. Protection by pyruvate of rat retinal cells against zinc toxicity in vitro, and pressure-induced ischemia in vivo[J]. Investigative ophthalmology & visual science, 2004,(45):1523-30.
[3]ROSEN R, VAGAGGINI T, CHEN Y et al. Zeaxanthin Inhibits Hypoxia-Induced VEGF Secretion by RPE Cells through Decreased Protein Levels of Hypoxia-Inducible Factors-1alpha[J]. BioMed research international, 2015,(2015):687386.
[4]WEI D, PENG JJ, GAO H et al. Digoxin downregulates NDRG1 and VEGF through the inhibition of HIF-1alpha under hypoxic conditions in human lung adenocarcinoma A549 cells[J]. International journal of molecular sciences, 2013,(14):7273-85.
[5]COLVIN RA, BUSH AI, VOLITAKIS I et al. Insights into Zn2+ homeostasis in neurons from experimental and modeling studies[J]. American journal of physiology Cell physiology, 2008,(294):C726-42.
论文作者:康道欢 陆斌
论文发表刊物:《医师在线》2018年3月上第5期
论文发表时间:2018/6/27
标签：视网膜论文; 蛋白论文; 离子论文; 细胞论文; 低氧论文; 水平论文; 作用论文; 《医师在线》2018年3月上第5期论文;