王琳[1]2008年在《mM-CSF在白血病细胞中的作用及其介导的反向信号研究》文中提出细胞问通讯是多细胞生物生存及功能的基础,其异常与疾病密切相关,因此该领域成为当前生命科学研究的热点之一。基于单向信号传递的经典机制研究已很深入,双向信号传递机制虽已提出,但反向信号研究明显滞后。mM-CSF是巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的一种选择性剪接产物,为膜结合型细胞因子;我们前期的研究证实了它具有粘附分子样作用并可通过并置性作用机制部分替代M-CSF的功能,且在白血病和淋巴瘤中高表达,提示它在造血系统恶性肿瘤中有重要意义。本论文在我室多年研究的基础上,对mM-CSF在血液系统恶性肿瘤中的作用及其介导的反向信号传导机制、作用进行了探讨。构建了mM-CSF真核表达载体,并转染Namalwa和Ramos细胞,获得了稳定表达细胞株(Namalwa-M和Ramos-M);RT-PCR、Westem blot和免疫荧光法证实上述细胞株构建成功。体外实验发现Namalwa-M和Ramos-M细胞增殖能力减弱,而裸鼠成瘤实验表明二者形成的瘤块体积显著大于对照细胞,M-CSF单克隆抗体瘤内注射可显著降低瘤块体积。二者形成的瘤组织中均有大量的巨噬细胞浸润和明显的血管新生,实时定量PCR方法证明瘤组织中鼠源性促血管新生因子表达水平升高,提示巨噬细胞在其中发挥重要的作用。体外共培养实验进一步证明巨噬细胞促进Namalwa-M和Ramos-M细胞的增殖,而且活化ERK MAPK信号途径。上述结果提示,表达mM-CSF的血液系统恶性细胞异常活化募集到周围的巨噬细胞,后者通过促进细胞增殖、血管新生在肿瘤发展中起促进作用。以表达内源性mM-CSF的K562细胞、稳定表达野生型及胞内截短30个氨基酸的突变型mM-CSF的Namalwa和Ramos细胞株为模型,研究mM-CSF介导的反向信号及其生物学功能。可溶性受体作用可引起胞内分子量约为45kD和30kD的蛋白酪氨酸磷酸化水平明显升高,免疫共沉淀实验进一步证实ERKMAPK信号途径参与该反向信号传递。裸鼠成瘤实验表明,该反向信号在巨噬细胞的促肿瘤机制中发挥一定的作用。为进一步探讨mM-CSF介导的反向信号机制,还分别构建了胞内区截短10个、20个氨基酸残基的截短突变型以及针对胞内两个丝、苏氨酸残基的单点突变和双点突变型mM-CSF真核表达载体,转染Namalwa细胞获得了稳定表达细胞株,初步对其性质进行了研究。综上所述,本文深入研究了mM-CSF在白血病细胞中的作用,首次发现了mM-CSF通过异常活化巨噬细胞在血液系统恶性肿瘤的发展中起促进作用;首次实验证实了mM-CSF介导反向信号传递,且该反向信号与肿瘤发展相关:构建了截短突变型及一系列点突变型mM-CSF的真核表达载体和稳定表达细胞株,为深入研究mM-CSF介导的反向信号机制奠定了基础。
许琳琳[2]2010年在《高表达mM-CSF的血液肿瘤细胞对巨噬细胞功能性极化的作用》文中研究表明巨噬细胞是免疫系统中重要的效应细胞,其表型和功能具有极强的可塑性。不同的微环境下,巨噬细胞可发生表型及功能极化从而呈现出不同的功能。肿瘤组织中巨噬细胞的功能具有两面性,是肿瘤发展过程中的一把“双刃剑”。巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)是一个多功能的细胞因子,其异常表达和功能与多种疾病的发生和进程密切相关。膜结合M-CSF (mM-CSF)是它的一种选择性剪接产物,在血液系统恶性肿瘤中可检出其高表达,具有粘附分子样作用,可以通过并置性作用机制部分代替M-CSF的功能。基于mM-CSF高表达常发生于造血系统恶性肿瘤中,提示它在这些恶性疾病中具有重要的生物学意义。本论文是在我室前期研究的基础上,对高表达mM-CSF的血液肿瘤细胞对巨噬细胞功能性极化的影响进行了初步探索。采用裸鼠皮下成瘤实验,将高表达mM-CSF的血液肿瘤细胞接种裸鼠。免疫荧光法观察瘤组织中巨噬细胞的分布及表型特征。发现瘤组织中有大量的巨噬细胞浸润,且巨噬细胞表达选择性活化巨噬细胞表面标记CD206。采用流式细胞术分选瘤组织中的巨噬细胞,对其表型和功能进行进一步探索。虽然能获得一定数量的巨噬细胞,但巨噬细胞易贴壁,回收率不高。故选取小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7与高表达mM-CSF的血液肿瘤细胞体外共培养,流式细胞术检测共培养巨噬细胞表面分子CD206(选择性活化巨噬细胞表面标记)和细胞因子IL-10,IL-12,IL-6,TNFα的蛋白水平表达情况。实时定量PCR检测高表达mM-CSF的血液肿瘤细胞对巨噬细胞基因表达的影响。吞噬实验检测巨噬细胞功能的变化。结果显示,高表达mM-CSF的血液肿瘤细胞显著上调巨噬细胞表面选择性活化巨噬细胞表面标记CD206的表达强度；上调细胞因子IL-10,TNFα的表达水平,下调IL-12,IL-6的表达水平；基因表达水平上,下调IL-18,上调ARG1、VEGFA、CXCL4、MMP9、uPA的表达水平；功能上,高表达mM-CSF的血液肿瘤细胞使巨噬细胞的吞噬能力明显增强。以上结果表明,mM-CSF对巨噬细胞的功能性极化具有重要影响,高表达mM-CSF的血液肿瘤细胞使巨噬细胞异常活化为具有IL-10 high,IL-12 low,IL-6 low, TNFαhigh的巨噬细胞类群,该种免疫表型的巨噬细胞在血液恶性肿瘤的发生发展中可能具有重要的作用。
佚名[3]2001年在《《第三军医大学学报》2001年第23卷主题词索引》文中研究表明(根据《医学主题词注释字顺表》标引主题词,按主题词汉语拼音顺序排列)外文字母、数字1 6Ｓ 2 3ＳｒＤＮＡ基因间区ＰＣＲ ＳＳＣＰ分析Ｑ热立克次体中国分离株 1 6Ｓ 2 3ＳｒＤＮＡ基因间区 (胡廷徽等 ) 2 3( 1 1 ) :1 31 2 -1
申月明[4]2012年在《Pim-1信号在小鼠溃疡性结肠炎发病机制中的免疫调节作用研究》文中进行了进一步梳理研究背景炎症性肠病(IBD)是一组反复发作非特异性的肠道炎症性疾病,发病机制至今尚未完全阐明,但免疫因素在IBD中重要作用已被广大学者所公认。Pim-1基因最初是在鼠白血病病毒(MuLV)诱导的T-细胞淋巴瘤中发现的,目前研究表明Pim-1激酶在细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤发生等许多生理病理过程中起重要作用,近年来Pim-1在免疫系统的作用逐渐受到重视,参与控制T淋巴细胞的增殖与凋亡,但是目前关于Pim-1信号是否能调节IBD肠粘膜固有及适应性免疫细胞功能的研究国内外尚未见报道。本课题利用DSS诱导急性小鼠溃疡性结肠炎模型,以观察Pim-1表达与肠道炎症程度关系为切入点,进一步使用Pim-1抑制剂,观察对小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用,并探讨对Th1/Th2、Treg/Th17细胞分化的影响,同时探讨Pim-1信号在巨噬细胞激活方面的作用,本课题从动物、细胞、分子水平多方面来探讨Pim-1信号通路对小鼠溃疡性结肠炎肠粘膜固有及适应性免疫细胞功能的调节作用,以阐明Pim-1信号与肠道异常免疫反应的关系,为溃疡性结肠炎的治疗提供新的靶点、为深入Pim-1信号的药理研发提供理论基础。第一章Pim-1在小鼠急性溃疡性结肠炎模型中的表达目的：观察Pim-1在溃疡性结肠炎发病过程中的动态表达,并观察其与炎症程度的相关性。方法：BALB/c小鼠饮用5%DSS溶液建立急性溃疡性结肠炎模型,分别在第0、1、4、7天取结肠标本,利用real time PCR、Western Blot及免疫组化动态观察Pim-1表达,分析Pim-1的表达和DAI、组织学炎症评分的相关性。结果：①饮用5%DSS7天后成功建立小鼠急性溃疡性结肠炎动物模型,②real time PCR、Western Blot结果显示在饮用5%DSS第4、7天后Pim-1表达较正常组及第1天均明显升高,P<0.05,免疫组化显示Pim-1主要在淋巴细胞、中性粒细胞等炎症细胞表达。③Pearman相关分析表明,结肠组织中Pim-1蛋白与DAI呈正相关(R=0.868,P<0.01),与组织病理学评分亦呈正相关(R=0.851,P<0.01)。结论：在溃疡性结肠炎起病过程中Pim-1的表达与肠道炎症程度呈正相关,Pim-1信号参与肠道炎症反应。第二章Pim-1信号对Th细胞分化、及巨噬细胞激活的影响目的：用PIM-Inh阻断Pim-1信号,观察对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用,同时研究PIM-Inh对肠粘膜中Th细胞分化及巨噬细胞激活的影响。方法：①应用PIM-Inh阻断Pim-1信号,治疗7天后,观察对DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用,②ELISA检测Th细胞因子(IL4, TGF-β, IFN-γ, IL17),③real time PCR、 Western Blot检测Th细胞转录因子的表达(GATA3, T-bet, Foxp3, RORrt),④Western Blot检测肠道组织巨噬细胞激活标记物NF-κB,iNOS的表达。结果：①PIM-Inh治疗组小鼠血便、腹泻症状、DAI评分、病理组织学评分较DSS模型组均好转,②与DSS模型组比较,PIM-Inh治疗组肠组织中IFNγ、IL17表达下降,P<0.05,差别具有统计学意义,其中高剂量治疗组下降更加明显；PIM-Inh治疗组肠组织中TGFβ的表达较模型组升高,其高剂量组升高较明显,P<0.05,而低剂量治疗组与模型组比较,P>0.05,差别无统计学意义；PIM-Inh治疗组肠组织中IL4的表达较DSS模型组稍下降,但P>0.05,差别无统计学意义,③real time PCR. Western Blot结果显示：PIM-Inh治疗组肠组织中T-bet, ROR-γt较DSS模型组明显下降,而FOXP3的表达比模型组明显升高,P<0.05,差别无统计学意义,但是对GATA-3的表达无明显影响,④PIM-Inh治疗组肠组织中p-NF-κB P65, iNOS的表达较DSS模型组明显下降,P<0.05。结论：阻断Pim-1信号可抑制巨噬细胞活化、抑制Thl、Thl7为主的炎症反应,促进向Treg细胞分化,从而对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎具有治疗作用。第三章Pim-1对TLR4/NF-KB信号通路的调节目的：观察LPS对Pim-1表达的影响,阻断Pim-1对TLR4/NF-KB信号通路的影响方法：①不同剂量LPS作用于RAW264.7巨噬细胞,分别在12h、24h后用real timePCR及Western Blot检测Pim-1的表达,②在LPS刺激前给予Pim-1特异性抑制齐(PIM-Inh), Western Blot检测pNF-kB P65的表达,ELISA测定TNF-α的表达。结果：①与正常对照比较,100ng/ml,1ug/ml的LPS均可以促进Pim-1的表达,其中1ug/ml更加明显,P<0.05,差别具有统计学意义；同一浓度LPS作用12h后比24h后Pim-1升高更加明显,P<0.05,差别具有统计学意义②用10umol/L,100umol/L PIM-Inh预处理后,NF-κBp65、TNFa蛋白的表达下降,且呈剂量依赖性,即浓度100umol/L时最为明显,P<0.05,差别具有统计学意义；而1umol/L PIM-Inh预处理后对NF-κBp65蛋白表达无明显影响,P>0.05,差别无统计学意义。结论：LPS可以诱导Pim-1的表达,阻断Pim-1可以抑制TLR4/NF-κB信号转导。
鞠文[5]2016年在《β-catenin对单核—巨噬细胞分化的影响及机制研究》文中进行了进一步梳理白血病是一类发生在造血系统,严重危害人类健康的恶性克隆性疾病,也是儿童及青少年发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。近年来,虽然越来越多的学者致力于白血病的病因和发病分子机制的研究,但由于致病机制比较复杂,目前尚不完全明确。随着对白血病发病机制的深入研究,人们发现Wnt/β-catenin信号转导通路的异常激活在骨髓正常或异常造血过程中起着关键作用,与白血病的发生发展和不良预后有密切关系。该信号通路主要由Wnt、FZD膜受体家族成员、Dsh、β-catenin、APC、Axin、GSK3β及细胞核内LEF/TCF家族及下游靶基因组成,能够介导细胞-细胞黏附作用以及转录基因的表达,在调节细胞的凋亡、增殖、分化、移行等过程中起着重要的作用。其中β-catenin是Wnt/β-catenin信号转导通路中的核心分子,是一种多功能的蛋白质。Wnt/β-catenin信号转导通路的激活能够引起细胞质内的β-catenin核移位,从而激活细胞核内的LEF/TCF转录因子及其下游靶基因的转录表达。大量研究表明β-catenin蛋白在多种急性白血病细胞系中高表达,与白血病的不良预后有密切关系,然而β-catenin在白血病发生发展中的致病机理和分子机制目前尚不完全清楚。APC是Wnt/β-catenin信号转导通路的重要负调节因子,APC蛋白的缺失易导致β-catenin在细胞核内聚集,最终引起Wnt/β-catenin信号通路的激活。有研究发现,APC基因敲除小鼠和β-catenin转基因小鼠均能够引起粒-单核系祖细胞(GMPs)及髓细胞的衰减或耗竭,而不影响巨核细胞-红细胞前体细胞(Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors,MEPs),髓细胞系细胞数量的减少与造血干细胞的耗竭有关,但与髓系造血祖细胞的分化抑制是否有关,Wnt/β-catenin能否影响髓细胞白血病细胞的分化功能及其作用机制目前尚不明确。因此,本研究主要以PUER细胞、小鼠骨髓造血干细胞、人急性髓细胞白血病U937为研究对象,研究β-catenin过表达或APC基因敲除对三种细胞单核/巨噬细胞分化的影响及相关分子机制。本课题研究工作主要分为以下三个部分:第一部分β-catenin过表达对PUER细胞和小鼠骨髓间充质干细胞分化功能的影响PUER细胞是体外研究单核/巨噬细胞的理想模型,在4-OHT诱导下,条件性表达PU.1基因及单核/巨噬细胞方向分化。本研究首先以PUER细胞为研究对象,研究β-catenin过表达或敲除APC对其分化功能的影响。将PUER细胞分别稳定转染表达β-catenin或采用RNA干扰技术敲除APC后,采用Western Blot对细胞中β-catenin的表达情况和APC的敲除情况进行分析,构建了能够稳定表达β-catenin的PUER细胞株和APC RNA干扰的PUER细胞株。4-OHT诱导细胞分化后进一步利用流式细胞标记技术、Cytospin细胞甩片涂片和May-Grünwald Giemsa染色技术对PUER细胞的分化情况进行分析。结果表明,高表达β-catenin或敲除APC基因能抑制PUER细胞向单核/巨噬细胞分化。为进一步证实β-catenin过表达对造血干细胞分化功能的影响,本研究体外分离C57BL/6小鼠骨髓造血干细胞,并使β-catenin在该细胞中高表达,研究β-catenin高表达对GM-CSF诱导的小鼠骨髓造血干细胞分化的影响。结果显示,β-catenin高表达能够抑制GM-CSF诱导的小鼠骨髓造血干细胞向单核/巨噬细胞方向分化。第二部分β-catenin过表达对人单核巨噬细胞性白血病细胞U937分化功能的影响本部分主要研究β-catenin在人白血病细胞中高表达后,能否进一步影响白血病细胞的分化功能。课题研究中首先构建β-catenin表达质粒,稳定转染U937细胞使β-catenin在白血病细胞中高表达(Western Blot验证证实),然后加入50ng·m L-1PMA诱导U937细胞分化,选取CD14、CD11b和CSF1R作为PMA诱导U937分化后的表面标志物,用流式细胞染色分析技术和RT-PCR分别分析表面标志物的表达水平。结果显示,β-catenin高表达能抑制U937细胞CD14、CD11b和CSF1R的表达水平。May-Grünwald Giemsa染色结果显示,与对照相比,β-catenin过表达的U937细胞分化为单核/巨噬细胞的形态学改变不明显,说明β-catenin高表达能抑制U937细胞向单核/巨噬细胞方向分化。本研究进一步采用基因干扰技术敲除APC基因(APC sh RNA#1和#2),采用Western Blot测定β-catenin的表达情况及APC基因敲除对U937分化功能的影响。结果显示,U937细胞敲除APC基因后β-catenin表达增加,且CD14和CD11b的表达水平较对照组下降,说明APC基因敲除能够上调下游β-catenin的表达水平,进而抑制U937细胞向单核/巨噬细胞方向分化。第三部分β-catenin对单核/巨噬细胞分化功能影响的机制研究为研究β-catenin拮抗PU.1基因,抑制单核/巨噬细胞分化的机制,本部分首先将β-catenin在PUER细胞内过表达后,研究PUER分化前后(PU.1基因未诱导表达及诱导表达24h)全基因表达谱的变化,利用cluster 3.0聚类分析和signification analysis of microarray(SAM)R程序等方法研究差异基因的表达,从中筛选出与单核/巨噬细胞分化相关的重要差异表达蛋白进行进一步研究。本研究发现PU.1基因表达过程中,上调的基因有505个,下调的基因有390个。其中505个基因中有219个基因的表达是能够被β-catenin抑制的,390个下调的基因中有72个是能够被β-catenin又上调的。在这些差异表达基因中,Egr2是一种重要的转录因子,与单核巨噬细胞分化有关,在单核巨噬细胞分化过程中表达水平明显增高。本研究采用RT-PCR的方法发现β-catenin过表达能够显著抑制Egr2的表达,抑制单核巨噬细胞的分化;而Egr2高表达后又促进PUER细胞或U937细胞向单核巨噬细胞分化,该结果在PUER细胞以及白血病细胞U937中均得到验证,表明Egr2能够抑制β-catenin的表达,在促进单核巨噬细胞分化中起着非常重要的作用。进一步采用染色质免疫共沉淀(Ch IP)法和荧光素酶报告基因系统验证?-catenin与Egr2启动子区转录结合位点及结合活性。Ch IP结果显示,β-catenin和TCF4复合物均在Egr2启动子区存在结合位点,荧光素酶报告基因检测结果显示,随着转染质粒β-catenin的增加,荧光素酶荧光强度显著降低。上述两个结果表明β-catenin能够抑制Egr2启动子活性。综上,在PUER及U937细胞中证明β-catenin能够通过抑制PU.1靶基因Egr2的表达,抑制造血细胞单核/巨噬细胞方向的分化潜能,Egr2过表达能够逆转β-catenin引起的分化抑制。本研究为白血病的发生发展提供新的分子机制,进而为白血病的诊断和治疗提供新的靶点,也为研究外源化合物引起血液系统恶性病变的致病机理奠定一定的理论基础。
李明萱, 罗淑萍, 赵荣兰, 彭效祥[6]2019年在《P2X7受体与白血病关系的研究进展》文中进行了进一步梳理嘌呤能离子通道型7(P2X7)受体是2型嘌呤能受体家族(P2)成员之一,广泛表达于各种免疫细胞,其激活后参与多种生理和病理过程。近年研究发现,P2X7受体参与白血病的发生发展过程,P2X7受体激活后可通过促进白血病细胞增殖、抑制白血病细胞凋亡、导致P2X7受体基因多态性变化等,在白血病免疫反应中发挥重要作用。P2X7受体介导的嘌呤能信号通路是治疗白血病的潜在药物靶点。
参考文献：
[1]. mM-CSF在白血病细胞中的作用及其介导的反向信号研究[D]. 王琳. 中国协和医科大学. 2008
[2]. 高表达mM-CSF的血液肿瘤细胞对巨噬细胞功能性极化的作用[D]. 许琳琳. 中国协和医科大学. 2010
[3]. 《第三军医大学学报》2001年第23卷主题词索引[J]. 佚名. 第三军医大学学报. 2001
[4]. Pim-1信号在小鼠溃疡性结肠炎发病机制中的免疫调节作用研究[D]. 申月明. 中南大学. 2012
[5]. β-catenin对单核—巨噬细胞分化的影响及机制研究[D]. 鞠文. 吉林大学. 2016
[6]. P2X7受体与白血病关系的研究进展[J]. 李明萱, 罗淑萍, 赵荣兰, 彭效祥. 山东医药. 2019
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