( 沈阳医学院口腔医学院；辽宁沈阳110034)
口腔癌为世界范围内第六大常见之恶性肿瘤，口腔癌手术切除后容易局部复发和转移。葡萄糖调节蛋白78(Grp78)，Grp78可以激活易位到细胞其他部位，获得调控信号通路、细胞增殖、侵袭和转移、细胞凋亡、炎症和免疫等新的功能[1]。有研究显示，Grp78在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用，本文应用siRNA技术和重组质粒转染特异性调节Grp78的表达，研究其对口腔癌的侵袭能力的影响。
【关键词】葡萄糖调节蛋白78；口腔癌；侵袭和转移
1 材料和方法
1.1 材料
细胞OSCC（上海细胞研究所）。siRNA- Grp78（上海吉凯基因化学技术有限公司）；抗GRP78、FAK单克隆抗体（鼠源）山羊源磷酸化FAK单克隆抗体，碱性磷酸酶标记的二抗（北京中杉公司）；Transwell（Costar）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 将OSCC细胞培养于RPMI-1640培养基中，放置在37℃、相对湿度90%、5%CO2的培养箱中培养，于次日进行培养基的更换后，继续培养。待细胞生长至培养瓶的80-90%，用0.25%胰蛋白酶进行消化传代。实验中采用对数生长期的细胞进行，倒置显微镜下观察。
1.2.2 质粒构建和转染 pcDNA3.1(+)-Grp78重组质粒的构建，通过将2kb人GRP78cDNA片段导入到pcDNA3.1(+)的HindIII和XhoL酶切位点。转染的前一天，细胞用0.25%的胰蛋白酶进行消化, 然后在不含抗生素的培养基中将细胞接种至六孔培养板中,次日细胞长成为单层时进行转染。对照组在相同条件下，将空载体转染到细胞。采用免疫荧光技术检测转染效率。
1.2.3 siRNA技术 选择、设计及合成Grp78 siRNA靶序列。细胞转染：采用Trans-MessengerTM将siRNA转染到OSCC细胞。加入RPMI-1640无血清培养基分别稀释2μgsiRNA和4μL转染试剂，再将两溶液轻轻混合，于室温下静置孵育20min。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆将混合物滴加入六孔培养板中，轻摇培养板以便充分混匀，然后置于37℃、5% CO2的培养箱中孵育5h。去除上述溶液复合物, 并加入完全培养液置于培养箱中继续培养72h。免疫荧光检测GRP78的表达情况，观察转染效率。
1.2.4 细胞划痕实验
如上所述，OSCC细胞经过siRNA及质粒转染的处理。在单层细胞中央做划痕，尽量保证各划痕宽度一致。于显微镜下拍照。
2 结果
Grp78表达水平的变化可以有效影响口腔癌细胞的侵袭能力。划痕法实验结果表明，在24h后与对照组相比，Grp78-siRNA转染的OSCC细胞创口愈合程度明显较慢，而经pcDNA3.1（+）-Grp78转染后，Grp78表达升高的OSCC细胞，愈合程度则明显较快，分析结果显示差异具有统计学意义(P ＜ 0.05)。这一结果表明，siRNA干扰后下调Grp78的表达水平，可以有效地抑制口腔癌细胞的转移能力，而Grp78过表达则可以提高口腔癌的转移能力。
3 讨论
Grp78是一种-应激诱导的ER分子伴侣， Grp78的表达上调与肿瘤的演进及不良预后等具有相关性[2,3]。最近许多研究证实，Grp78的表达与不同类型的肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关[4,5]。但目前为止，关于Grp78对口腔癌的侵袭和转移的影响及机制报道甚少。为探究Grp78是否参与到口腔癌的侵袭过程，本次实验通过小干扰RNA和质粒转染技术分别降低和增加Grp78的表达水平，实验结果显示，下调Grp78的表达抑制口腔癌的侵袭，而增加Grp78的表达可以促进口腔癌的侵袭。这表明，Grp78的表达水平在口腔癌的侵袭过程中发挥调节性作用。
参考文献：
1.Ramos Gde O, B.L., Lauxen I,et al., Fibronectin Modulates Cell Adhesion and Signaling to Promote Single Cell Migration of Highly Invasive Oral Squamous Cell Carcinoma. PLoS One,, 2016,. 11(3): p. e0151338.
2.Ni M, Z.Y., Lee AS, Beyond the endoplasmic reticulum: atypical GRP78 in cell viability, signalling and therapeutic targeting. Biochem J, 2011. 434(2): p. 181-8.
3.Gonzalez-Gronow M, S.M., Papalas J,et al, GRP78: a multifunctional receptor on the cell surface. Antioxid Redox Signal., 2009. 11(9): p. 2299-306.
4.Sato M, Y.V., Arap W,et al, GRP78 signaling hub a receptor for targeted tumor therapy. Adv Genet, 2010. 69: p. 97-114.
5.Gray PC, V.W., Cripto/GRP78 modulation of the TGF-beta pathway in development and oncogenesis. FEBS Lett, 2012. 586(14): p. 1836-45
※通讯作者：尚德志 沈阳医学院口腔医学院教授 110034
本项目得到辽宁省教育厅科学技术研究项目支持L2014415和辽宁省大学生创业计划支持201310164006
论文作者:张霄华,尚德志※,林风娇 赵作栋
论文发表刊物:《医师在线》2017年12月下第24期
论文发表时间:2018/3/16
标签：转染论文; 细胞论文; 质粒论文; 口腔癌论文; 培养基论文; 划痕论文; 医学院论文; 《医师在线》2017年12月下第24期论文;