一、3种恶性疟原虫红内期抗原基因的测序和序列分析（论文文献综述）
史善美[1]（2021）在《恶性疟原虫A型RIFIN的基因多态性和体液免疫特性研究》文中研究表明目的:为进一步了解恶性疟原虫A型RIFIN的基因多态性和体液免疫特性,本研究观察分析与重症恶性疟以及免疫逃避相关的A型rif基因的选择和宿主的差异关系;鉴定野生型、突变型A-RIFIN多肽与宿主体液免疫（IgG）的反应情况;初步探索A-RIFIN多肽与抑制性受体LILRB1结合的关键片段及结合的关键位点,为研究恶性疟原虫A-RIFIN的分子和免疫学功能提供数据依据。方法:首先,对加纳输入中国的恶性疟病例的全血样本经提取基因DNA后进行PCR确认样本是否为单一恶性疟原虫感染,将符合要求的样本用Covaris S2仪将样本基因组DNA打碎成500bp的小片段,构建文库,用Illumina X-10测序仪对所有文库进行全基因组重测序,同时从PlasmoDB中下载恶性疟原虫3D7的参考序列,从pf3k中下载2013年的92个加纳本地恶性疟原虫样本全基因组的单核苷酸多样性（single nucleotide polymorphism,SNP）数据,构建参考数据集。将质量评估较好的样本用数据分析技术根据测序结果计算其PCA、STRUCTURE等进行遗传结构的分析,并分别计算不同群体的核苷酸多态性（π）及两个种群间的群体遗传差异（FST）,计算Tajima’s D、FST、iHS、XP-EHH统计值分析恶性疟原虫全基因组受自然选择情况,鉴定出其中受强选择的基因,并观察在此样本中A型rif基因在两个人群中受选择情况的区别,判断A型rif的选择与宿主差异的关系。将病例样本的全基因组数据组合后,筛选出几种A型rif的编码序列信息,参考目的基因序列（3D7）,合并数据后用MEGA6软件、DNAsp软件进行单基因多态性分析,找出野生型和突变型A-RIFIN序列,合成多肽,通过间接ELISA法检测多肽与恶性疟病人全血的体液免疫反应（IgG）,再将野生型和突变型A-RIFIN多肽免疫新西兰兔,通过ELISA实验分析野生型和突变型A-RIFIN多肽的免疫原性和免疫反应性差异。运用ELISA方法研究野生型和突变型A-RIFIN多肽与抑制性受体LILRB1的分子互作,根据反应结果设计单一位点基因突变的突变型多肽,再次实验观察其与抑制性受体的结合情况,判断A-RIFIN多肽和LILRB1抑制性受体结合的关键位点。结果:通过分子检测和评估,共筛选出9个由加纳输入中国的恶性疟单一感染病例样本进行全基因组测序、分析。用PCA对两个种群的多样性差异进行分析,结果显示在种群结构中恶性疟原虫样本一般按地理来源聚类,且加纳输入中国的样本可视为加纳本地种群的一部分。加纳输入中国和加纳本地样本的π均值分别为0.0013和0.0017,与加纳本地样本的参考序列相比有较低的遗传多样性,但在红细胞入侵和免疫相关的基因方面,加纳输入中国样本的遗传多样性高于加纳本地样本,如rif（0.0116）、var（0.012）和stevor（0.013）。FsT均值为0.13,只有少数VSAs基因（54个rif,7个stevor,没有var）为高FST值,rif家族的两个亚组在FST检验中表现出显着性差异（P=0.038,z检验）。在基因自然选择上,加纳输入中国的样本和加纳本地样本的Tajima’s D平均值分别为-0.66和-1.58,加纳输入中国的样本显着高于加纳本地样本（P<0.0001,配对z检验）,而在受强选择的基因差异方面,VSAs基因家族的Tajima’s D值在两个不同地区样本中的差异非常小,没有表现出强选择性。但从XP-EHH的检验结果可知两个样本的VSAs家族中都有部分基因显示出强选择性,不过这些选择特征是分散在不同的单个基因中,例如通过iHS统计,在输入性样本中,我们发现前1%的强选择SNP涉及329个基因,包括66个rif、46个var、5个msp和12个stevor。通过全基因组结果和本课题组之前的研究分析A-RIFIN突变位点,合成多肽,具体分别是从PF3D71254800序列中挑选出从234到254位置的三条多肽,即野生型1-RIFIN 和突变型 2-RIFIN、3-RIFIN,从 PF3D71100400 序列中挑选出从 252 到 272位置的两条多肽,即野生型4-RIFIN和突变型5-RIFIN,从PF3D70900200序列中挑选出从182到205位置的两条多肽,即野生型6-RIFIN和突变型7-RIFIN,以及从243到267位置的两条多肽,即野生型8-RIFIN和突变型9-RIFIN。在这9条多肽中,4-RIFIN、5-RIFIN、8-RIFIN、9-RIFIN的实验结果表明这四条多肽在与恶性疟病人和正常人血液样本的反应中有显着差异性（P值分别为0.0010、0.0076、<0.0001、0.0006）,在同型多肽的野生型和突变型之间只有野生型8-RIFIN与突变型9-RIFIN与恶性疟病人全血IgG反应有显着差异性（P<0.0001）。在与相应兔多抗的反应中,野生型8-RIFIN与突变型9-RIFIN都有较好的免疫原性和免疫反应性,但野生型8-RIFIN多肽与突变型9-RIFIN免疫的兔多抗反应较弱。在与宿主抑制性受体LILRB1的分子互作研究中显示,在9个多肽中,只有A-RIFIN蛋白PF3D70900200的野生型多肽8-RIFIN与LILRB1受体有结合反应,而其突变型多肽9-RIFIN以及单一位点突变型多肽10-RIFIN均与LILRB1受体不反应。结论:通过对加纳输入中国以及加纳本地恶性疟原虫样本全基因组测序分析发现,在恶性疟原虫来自同一个国家的背景下,A型rf基因在这两个不同种群中存在明显的选择差异,并且认为该差异的来源主要是宿主免疫或地区传播水平的不同。对A型rif基因等VSAs家族的选择是分散在不同的单个基因中。根据FST检验结果可知很多A型rif基因的FST值达到0.25以上,说明该基因家族在加纳输入中国和加纳本地样本间呈现出很大的遗传分化;根据对A型rif单基因分析结果及结合前期的研究,本研究在PF3D71254800、PF3D71100400和PF3D70900200这三个基因对应的A-RIFIN中筛选合成了4条野生型多肽和5条突变型多肽,通过与恶性疟病人血液样本的免疫反应性实验结果提示A-RIFIN蛋白的编码基因多态性对宿主的体液免疫（IgG）应答水平有影响,其中从PF3D70900200中挑选的野生型多肽（8-RIFIN）与突变型（9-RIFIN）免疫反应性差异较显着（P<0.0001）。结合野生型多肽（8-RIFIN）与突变型多肽（9-RIFIN）的免疫多抗交叉结合反应提示PF3D70900200中243到267位置突变会引起宿主疫反应水平下降。在与宿主抑制性受体LILRB1 的分子互作研究发现,A-RIFIN蛋白PF3D70900200的野生型多肽8-RIFIN与LILRB1受体有较强的结合能力,突变会影响与抑制性受体的结合,而且通过多肽序列比对发现该多肽Y243到G267位置与已有的A-RIFIN（PF3D71254800）-LILRB1复合体的晶体结构关键作用片段一致,同时确定了该蛋白中此多肽与抑制性受体LILRB1结合的关键性位点F264R。本研究从基因多态性、免疫特性以及分子互作等多个层面探索了 A-RIFIN蛋白参与机体免疫应答及调控的初步机制,发现A型rif基因在不同宿主人群中具有显着差异性,并且基因突变影响了 A型RIFIN多肽的免疫反应性和结合LILRB1抑制性受体的能力,为进一步开展A型RIFIN蛋白的分子和免疫学功能研究提供了基础。
刘紫玲[2]（2020）在《缅甸流行区无症状疟疾感染流行病学调查》文中进行了进一步梳理目的:世界卫生组织近三年来的疟疾报告显示全世界感染疟疾的临床确诊病例数略有增加（2016年2.16亿、2017年2.19亿、2018年2.28亿）,并且每年都有40万以上的患者死于疟疾感染。2016年,东南亚地区的疟疾确诊病例和死亡人数分别占全球的7%和6%。湄公河次区域（中国,缅甸,泰国,老挝,越南,柬埔寨）已将2030年消除疟疾作为区域性的抗疟目标。降低疟疾感染区域的感染率及感染范围并保持住疟疾传播中断地区的无疟疾状态,是实现这一目标的关键。在湄公河次区域,疟疾负担最重的缅甸毗邻多国,疟疾传播在大多数国际边境地区持续存在,这对周边国家产生了严重的危害,严重阻碍了区域性的疟疾消除计划。通常情况下,疟疾流行地区的大多数疟疾感染是无症状的,而确诊的急性疟疾病例只是“冰山一角”。虽然无症状疟疾感染很少导致急性疾病,但这类无症状的携带者能够感染蚊子,从而成为疟疾持续传播的潜在宿主。由于无症状感染和复杂的传播模式可能导致疟疾的持续,无症状感染中普遍存在的抗疟耐药株可能是耐药性迅速传播的基础。缅甸治疗恶性疟原虫感染使用的多种一线治疗药物均出现了杀虫效果减弱的清除延迟现象,耐药株的出现和传播威胁着本地消除疟疾的目标。恶性疟原虫的抗疟耐药性往往出现在感染率低的地区,特别是在东南亚和南美洲,然后扩展到撒哈拉以南非洲的高感染率地区。目前,无症状感染的耐药性数据还很有限。对无症状疟疾流行的可靠估计,监测抗疟耐药性的传播对维持疟疾控制的最新进展和实现区域消除疟疾的目标至关重要。本研究收集了缅甸分散在不同地区的数个城镇的人群滤纸血片,以分析无症状疟原虫的感染率以及恶性疟原虫感染中抗疟耐药性基因的突变。这些结果将提供关于缅甸多个地区无症状疟原虫的感染和恶性疟原虫疟疾耐药性状况的最新信息,对制定在该国消除恶性疟原虫感染的战略非常重要。研究方法:第一部分感染率的研究在2017年雨季对缅甸4个疟疾年发病率不同的乡镇（Bilin、Thabeikkyin、Banmauk和Paletwa）进行了横断面调查。共从当地村庄招募1991名志愿者,通过光学显微镜（LM）、快速诊断试验（RDTs）和nested PCR（nPCR）对疟原虫亚临床感染率进行评估。nPCR分析采用改进的混合池策略（pooling strategy）进行,该策略根据感染率的初步估计进行优化。数据处理方法包括:数据采用SPSS v.22.0进行分析。疟疾感染率通过交叉试验计算。Logistics回归分析计算二元变量的比值比（OR）,适当时使用卡方检验或Fisher’s精确检验。P<0.05为差异有统计学意义。以LM或嵌套PCR为金标准,通过交叉试验,计算uRDT（超灵敏快速检测试验）和cRDT（传统快速检测试验）对本研究人群中镜检玻片和nPCR呈阳性恶性疟原虫感染检测的敏感性和特异性。第二部分的研究主要通过nPCR和测序,在缅甸地理分散的三个乡镇:Laiza、Banmauk和Paletwa进行横断面研究,测定恶性疟原虫耐药标记的遗传变异,耐药标记基因为:双氢叶酸还原酶（pfdhfr）、双氢蝶呤合成酶（pfdhps）、氯喹耐药转运蛋白（pfcrt）、多药耐药蛋白1（pfmdr1）、多药耐药相关蛋白1（pfmrp1）、Kelch蛋白13（k13）。数据处理方法包括:序列比对采用MEGA7.0.26,核苷酸和氨基酸位置按3D7参考序列编号。采用Microsoft Soft Excel 2007和SPSS 22.0软件对不同基因的SNP数据进行分析。采用皮尔逊卡方检验或Fisher’s精确检验确定差异有统计学意义（P<0.05）。采用中值连接算法（the median joining algorithm）,由DnaSP 6和Network software 5.01.0构建单体型网络。结果:第一部分:基于所有方法的疟疾总体感染率为13.9%（277/1991）,各乡镇之间的感染率差别很大,西部边境的Paletwa感染率最高（22.9%）,缅甸中部的Thabeikkyin感染率最低（3.9%）。nPCR方法较显微镜镜检（LM）和快速检测试验（RDTs）方法敏感,发现226人（11.4%）有疟原虫感染。在疟原虫种类中,间日疟原虫是所有地区最普遍的,而值得提出的是恶性疟原虫占西部城镇Paletwa感染的32%。两个基于hrp2抗原检测的RDTs共检测到103例恶性疟原虫感染,而uRDT检测到的恶性疟原虫感染比cRDT多20%。相比之下,LM只检出14例疟原虫感染,漏检了大部分亚临床感染。第二部分:pfdhfr、pfdhps、pfcrt、pfmdr1、pfmrp1和k13分别有92.5,97.6,84.0,98.7,68.3和61.4%的恶性疟原虫发生突变。pfcrt K76T、pfmdr1 N86Y、pfmdr1 I185K和pfmrp1 I876V分别有82.7%、2.5%、87.5%和59.8%的突变。pfdhfr、pfdhps、pfcrt、pfmdr1最常见的单体型分别为51I/59R/108N/164L、436A/437G/540E/581A、74I/75E/76T/220S/271E/326N/356T/371I、86N/130E/184Y/185K/1225V。此外,57株分离株在k13基因中有3种不同的点突变（K191T、F446I和P574L）和3种N端插入（N、NN、NNN）。共鉴定出43种不同的潜在与多药耐药相关的单体型。结论:1.横断面调查发现,在缅甸流行区人群中存在很高数量的无症状疟原虫感染,间日疟原虫成为主要的寄生虫种类。基于混合池策略的nPCR为大规模寄生虫流行病学研究提供了一种更实用的策略。对无症状的恶性疟原虫感染中耐药分子标记的分析显示,缅甸地区与耐药性相关的突变非常普遍,这些地区的恶性疟原虫对磺胺多辛乙胺嘧啶疗法和氯喹药物具有严重耐药性,恶性疟原虫治疗应该首选青蒿素联合疗法。对抗疟药物耐药性的分子监测可能有助于制定和更新在缅甸使用抗疟药物的指南。
李伟志[3]（2018）在《恶性疟原虫对小分子化合物库（Malaria Box）和双氢青蒿素的筛选及抗药性机制研究》文中进行了进一步梳理疟疾是由真球虫目,疟原虫科,疟原虫属的疟原虫是引发的寄生虫病,目前常见感染人类的疟原虫有4种,分别是恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）,间日疟原虫（Plasmodium vivax）,卵形疟原虫（Plasmodium ovale）和三日疟原虫（Plasmodium malariae）。2017年WHO报道,疟疾仍然在91个国家和地区发生和流行,有2.16亿疟疾感染病例,42.9万人因疟疾而死亡,其中70%的死亡病例为五岁以下儿童。由于没有有效的疟疾疫苗,药物治疗仍是目前防治疟疾的重要手段,但是疟原虫抗药性的出现和传播,导致目前有效的抗疟药物的力不从心,督促着新型抗疟药物的开发和抗药机制的研究。基于上述问题,本研究主要进行了以下两方面的工作。第一部分临床恶性疟原虫株对小分子化合物库的筛选和潜在抗药性分析本实验室前期从中国和缅甸边境病人样本中分离出67株临床恶性疟原虫虫株,使用常用的抗疟药物筛选后,发现8株疟原虫出现了抗药性,体现在半数致死量(IC50)增加或虫体生存率的提高。本研究利用这8株临床抗药性恶性疟原虫虫株,对新型抗疟试剂盒Malaria Box中的356种化合物进行了筛选,这些化合物对所有虫株的平均IC50位于7.76699.7 nM。进一步选出其中抑制效果较好的前15%共54种化合物,其平均IC50范围是7.7269.1 nM,这些化合物具有发展成为新型抗疟药物的可能。ChemMine tools分析这54种化合物的化学结构关系,共分为48个组别,显示出化合物构架的多样性,暗示出药物作用途径的丰富性。对比临床虫株与无特定抗药性虫株3D7的IC50差异倍数,定义5倍以上差异为相异化合物表型（DCPs）,具有DCPs的化合物意味着在临床疟原虫出现抗药性。本研究结果发现临床虫株对17种化合物敏感性下降,显示了临床虫株对新型抗疟化合物的潜在抗药性。进一步对比已知多种药物抗性虫株Dd2,临床虫株也显示对11种化合物敏感性减弱,说明临床虫株抗药性的多样性。全基因组测序所用恶性疟原虫株,共发现11690单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms,SNPs）,将所得的各株的SNPs合成一条假序列,进化分析显现了各虫株间亲缘关系。与已知抗药性Dd2相比,临床虫株在56个基因的SNP与之不同,进一步的统计学分析得到21种基因的SNP与8种化合物敏感性相关。值得关注的有1号染色体的ATP依赖性RNA解旋酶（PF3D70103600）,14号染色体的plasmepsin I（PF3D71407900）和易位子组件PTEX150（PF3D71436300）基因位点等。另外定义了48种基因上的113个拷贝数的变异（copy-number variation,CNV）,发现了11种基因的CNV与4种化合物敏感性相关。其中值得关注有8号染色体的热休克蛋白70（PF3D70818900）和10号染色体的肝阶段抗原-1（PF3D71036400）。在本研究中,一方面我们鉴定出Malaria Box中抑虫效果良好的新型化合物,另一方面检测到临床虫株对部分新型抗疟化合物的潜在抗药性,进而对其抗性机制进行研究。本研究不仅对新型抗疟药物的研发和使用具有指导意义,也为抗药性机制提供了新的线索。第二部分体外诱导双氢青蒿素抗药性恶性疟原虫株的抗药性机制研究世界卫生组织推荐青蒿素联合疗法作为治疗疟疾的首选方案。然而在东南亚的一些地区,对青蒿素有抗药性的恶性疟原虫的兴起和传播,严重威胁着全球疟疾的防治。恶性疟原虫抗ART药物机制一直是研究的重要方向,在科学家的不懈努力下,通过实验室筛选或者GWAS分析发现了一些重要抗药性机理,但尚未完全阐明。本研究经过759天双氢青蒿素（DHA）药物体外诱导筛选,获得了抗性较高的恶性疟原虫克隆虫株。抗药性虫株的半数致死量(IC50)为母本虫株Dd2的21倍。环状体（RSA）和滋养体（TSA）存活率大幅上升,抗药性虫株可耐受20μM的DHA短时间处理。分析发现TSA与IC50相关性更大,一定程度上解释了经典IC50表型测定方法不适用于鉴定ART类药物抗性的原因。另外,抗药性虫株对其他ART衍生物（青蒿琥酯,蒿甲醚）分别表现出8和10倍的增长,说明了化合物特性结构诱导的抗药性的不同;同时其对氯喹和甲氟喹药物抗药性的增加证实了共同抗药机制的存在。进一步观察DHA抗药性虫株红内期生长方式和生长周期,发现抗性虫株延长了环状体时期,导致整个生长周期增长。全基因组范围内对比分析抗性虫株与母本虫株Dd2的差别,共得到分布于35种基因的190个SNPs。其中一部分结果验证了之前鉴定的抗性位点如pfATG18（PF3D71012900）,蛋白激酶7（PF3D70213400）和保守的疟原虫膜蛋白（PF3D71464500）等,证明了这些基因位点的重要性。另一部分新出现的基因位点,如DNA修复和重组蛋白54（PF3D70803400）,甲酸盐-亚硝酸盐转运蛋白（PF3D70316600）和双链断裂修复蛋白（PF3D70107800）等,为ART抗药性机制的研究提供了新思路。另外,本研究发现了26个基因CNVs变化,全部为拷贝数增加,值得关注的是九个抗氧化途径的基因;六个线粒体蛋白;两个热休克蛋白;三个离子转运蛋白;泛素蛋白连接酶E3。它们分别在氧化还原、氧化供能途径和泛素化等方面,发挥对抗药物的作用。研究结果为恶性疟原虫抗DHA机制的研究提供了新的线索。恶性疟原虫抗DHA药物机制是一个多分子参与的过程,不可能仅仅通过几个基因位点的SNP或者CNV来完全阐明,本研究进一步完善了恶性疟原虫抗DHA药物的分子机制,为全面揭示抗药性机制打下了基础。
余胜超[4]（2016）在《恶性疟原虫exosome-like催化亚基的鉴定与降解特性分析》文中提出真核生物外切体是一种进化保守的多亚基核酸外切酶复合体,一般由10-11个不同的蛋白亚基组成。它是真核生物中重要的3’→5’核糖核酸外切酶之一,参与了生物体内多种RNA分子的3’端加工和降解,对于生物体的正常生长发育和调控具有重要作用。恶性疟原虫属于原生生物,是恶性疟疾的病原体,给人类的健康带来极大的危害。然而目前关于恶性疟原虫RNA加工降解机制研究较少,更未见恶性疟原虫外切体的相关研究报道。这可能影响了人们对恶性疟原虫应对复杂生活史和宿主免疫压力的作用机制的全面解析。通过对恶性疟原虫3D7株蛋白质组进行生物信息学分析发现,在恶性疟原虫中可能也存在着一种类似外切复合体（exosome-like）,该复合体至少由8个不同的亚基组成。结合功能域分析和其他研究报道筛选出四个催化亚基分别为Pf Rrp4、Pf Rrp41、Pf Dis3、和Pf Rrp6,同时选取Pf Rrp42亚基作为对照。以恶性疟原虫3D7株为研究对象,首先以丝氨酰t RNA合成酶基因作为内参基因,通过荧光定量PCR实验检测各亚基在虫体红内期的转录差异。通过构建重组表达载体,在大肠杆菌表达系统中分别表达纯化His-tag和GST-tag重组蛋白质。其中His-tag重组蛋白质用来免疫新西兰家兔制备多克隆抗体。然后通过Western blot和间接免疫荧光实验对虫体中天然蛋白质的表达和定位进行分析。而纯化得到的GST-tag重组蛋白质则用于各亚基的体外RNA降解特性分析。荧光定量PCR实验表明恶性疟原虫exosome-like催化亚基在红内期转录差异较大,但各亚基在红内期全程转录平稳,这说明各亚基对于虫体的生长发育必不可少。Western blot和间接免疫荧光实验显示各亚基在虫体内均为全长表达,且均表达于虫体的细胞质中,临近于核膜的周围。体外RNA降解实验表明Pf Rrp41、Pf Dis3和Pf Rrp6亚基均具有单链RNA酶活性,而Pf Rr4和Pf Rrp42亚基对单、双链RNA均无降解能力。在降解单链RNA时,Pf Rrp41、Pf Dis3和Pf Rrp6的催化活性均为二价金属离子依赖性,且在一定金属离子浓度范围内,其降解活性与离子浓度成反比。不同的是,Pf Rrp41亚基在降解单链RNA时不需要钾离子的参与,而Pf Dis3和Pf Rrp6的催化活性还具有钾离子依赖性,且在100 m M钾离子浓度时达到活性高峰。通过本研究表明,在恶性疟原虫中也存在一种exosome-like多亚基复合体,参与虫体RNA的加工和降解。该复合体的Pf Rrp41、Pf Dis3和Pf Rrp6三个亚基为催化亚基,具有单链RNA酶活性,且均表达于虫体细胞质中。这将为进一步解析虫体外切体的结构和功能奠定基础,为解析虫体内RNA分子的加工降解机制提供新的视野。
郝萧[5]（2016）在《红内期恶性疟原虫3D7中等长度ncRNA（RUF6-15）的功能研究》文中提出疟疾是一种十分严重的热带病,在感染人的4中疟原虫中恶性疟原虫的毒性最强,死亡率极高。疟原虫的生活史复杂,需要两种类型的宿主-雌性按蚊和人。在人体内有红外期和红内期两个发育阶段,但是其主要临床症状发生在红内期阶段。全基因组测序的完成及后继的芯片技术、高通量测序技术的快速发展,恶性疟原虫中的非编码RNA （ncRNA）也越来越引起人们的关注。ncRNA从长度上可以分为3类：小于50 nt的小片段ncRNA; 50 nt到500 nt的中等长度ncRNA;大于500 nt的长链ncRNA （Long non-coding RNA, lncRNA）。通过数据库数据比较基因组学分析,在恶性疟原虫中没有找到Dicer、Piwi、PAZ或RdRp的同源区域,因此认为恶性疟原虫中没有内源性小RNAs的存在。因此,中等长度的ncRNA引起了广泛关注。对于疟原虫中等长度组成型ncRNA的研究比较成熟,如tRNA、rRNA这些RNA不被翻译成蛋白质,但是参与蛋白质的翻译过程：此外还有snRNA、 snoRNA等参与RNA剪接和RNA修饰。Chakrabarti等鉴定出6个新的未知功能的RNA （RNAs of unknown function,简称RUFs）,其中RUF5、6仅在恶性疟原虫与里氏疟原虫中存在,RUF6包括15条高度同源的序列,长度在144-160 nt,这些同源序列位于RIFIN或VAR的基因间区。恶性疟原虫变异抗原基因（Var基因）家族编码的恶性疟原虫红细胞膜蛋白1（PfEMP1）是介导恶性疟原虫抗原变异和红细胞粘附微血管的媒介。PfEMP1由恶性疟原虫分泌产生,然后转移到感染的红细胞膜上,并在红细胞表面蓄积而形成结节,PfEMP1介导的细胞粘附和恶性疟原虫的致病性密切相关。这些RUFs是否参与了Var基因的调控以及调节疟原虫红细胞内期的发育分化及其内在调节机制仍不清楚。本研究通过Northern blot、FISH、转染、RNA-Seq、qRT-PCR、双荧光素酶实验等实验首次揭示了RUF6中第15条同源簇（RUF6-15）的生物学功能。在野生型3D7虫株每一个生活周期中RUF6-15中的转录水平是随着生长发育时间的延长越来越多,转录后位于细胞核内参与调控作用。转染过表达RUF6-15的虫株与对照株相比生长速度更快,敲低RUF6-15的虫株与对照株相比生长速度变慢。通过过表达RUF6-15后转录本水平的高通量测序结果及实验室验证结果显示,RUF6-15的靶基因为var基因家族。进一步通过双荧光素酶实验验证了RUF6-15是通过结合Var基因5’UTR区来调控var的表达。粘附实验表明过表达RUF6-15的虫株粘附能力有明显的提升,RUF6-15敲低的虫株粘附能力有所降低。本研究首次揭示了RUF6-15的生物学功能及作用机制,对深入认识疟疾的发病机制和制定新的防治措施均意义重大。
仰梦佳[6]（2014）在《恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL1和MSPDBL2的表达和分析》文中指出第一部分麦胚无细胞蛋白合成系统表达恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白目的：采用麦胚无细胞蛋白合成系统表达具有生物活性的恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL1和MSPDBL2。方法：恶性疟原虫实验室培养标准株3D7提取的基因组DNA为模板，采用In-Fusion克隆技术快速连接目的片段和质粒载体pEU-His。转化大肠杆菌DH5α株，获得含有目的基因的表达质粒。通过双酶切和DNA测序分析鉴定重组质粒。中提重组质粒后，用麦胚无细胞蛋白合成系统进行表达，对表达产物进行纯化和分析。结果：PCR成功扩增6个目的基因片段，MSPDBL1（2043bp），MSPDBL2（2200bp），DBL1（933bp），DBL2（921bp），SPAM1（465bp），SAPM2（576bp），并成功构建了6个用于麦胚无细胞蛋白合成系统的重组质粒，该6个重组质粒在麦胚无细胞蛋白合成系统中成功地表达出了6个重组恶性疟原虫蛋白rMSPDBL1（Mr74kDa），rMSPDBL2（Mr84kDa），rDBL1（Mr34kDa），rDBL2（Mr34kDa），rSPAM1（Mr17kDa），rSAPM2（Mr21kDa），经western blotting鉴定，表达产物的可溶性为100%，并成功纯化出重组蛋rSPAM1。结论：麦胚无细胞蛋白合成系统可以提高重组蛋白的可溶性。关于麦胚无细胞蛋白合成系统表达的重组蛋白质的纯化问题，需要进一步的研究。第二部分恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL2-DBL2结构域的原核表达和抗原性分析目的：克隆、表达恶性疟原虫疫苗候选分子裂殖子表膜蛋白MSPDBL2（PF100355）的DBL2结构域，并研究其抗原性。方法：提取恶性疟原虫实验室培养标准株3D7的基因组DNA为模板进行PCR扩增，采用In-Fusion克隆技术快速连接目的片段和质粒载体，构建重组表达质粒pET28a-DBL2，转化大肠埃希菌BL2l（DE3），异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并经亲和层析获得纯化的重组蛋白rDBL2。分别以恶性疟病人血清、正常人血清、对照混合血清作为一抗，蛋白质印迹（western blotting）分析该重组蛋白的抗原性。结果：PCR扩增获得长约950bp片段，菌落PCR和测序结果显示，重组质粒pET28a-DBL2构建成功，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示，经IPTG诱导并经亲和层析纯化后获得相对分子质量（Mr）约为34kDa的包涵体蛋白。经变性条件纯化得到rDBL2，western blotting分析结果显示，该重组表达蛋白rDBL2被恶性疟病人血清识别，有较好的抗原性。结论：成功克隆和表达纯化了恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL2的DBL2结构域，重组蛋白rDBL2有良好的抗原性。第三部分中缅边境恶性疟原虫Pfmspdbl2基因多态性分析目的：探讨中缅边境恶性疟原虫Pfmspdbl2基因多态性特点。方法：中缅边境恶性疟病人血滤纸片提取恶性疟原虫基因组DNA，根据恶性疟原虫基因Pfmspdbl2（PF100355）为目的扩增片段设计特异性引物，进行聚合酶链反应（PCR）扩增，以恶性疟原虫标准株3D7作为参照，利对所获得的基因序列进行测序分析，评估序列多态性。结果：80份恶性疟原虫基因组DNA，PCR扩增并测序成功16个Pfmspdbl2基因片段。测序结果显示，Pfmspdbl2基因16样本中，野生型占87.5%（14/16），突变型占12.5%（2/16）。结论：中缅边境恶性疟原虫Pfmspdbl2基因具有多态性。中缅边境恶性疟原虫Pfmspdbl2有阳性选择趋势，可能与人的抗虫免疫的有关。
林英姿[7]（2011）在《新型转基因减毒疟疾疫苗的构建与抗疟机理研究》文中研究说明疟疾是一种古老的寄生虫传染病,严重威胁着人类健康,阻碍着社会发展。据WHO最新公布数字,全球有一半人口受到疟疾的威胁,2008年有2.43亿人感染疟原虫,约86.3万人因患疟疾死亡,大多是5岁以下的儿童。近年来,虽然在疟疾控制方面取得了显着的成绩,但由于疟原虫抗药性以及蚊媒对杀虫剂抗性的产生和扩散,使疟疾防治面临严重困难。当前普遍认为,研制安全、价廉和有效的疫苗是人类控制乃至根除疟疾的重要途径。世界卫生组织、联合国计划开发署、世界银行等已将疟疾疫苗研究项目作为全球优先发展的三大疫苗项目之一。疟疾感染从雌性按蚊叮咬人体,其唾液腺中的成熟疟原虫子孢子随蚊虫的唾液注入宿主血液循环开始,随后子孢子进入肝细胞,在其中行裂体增殖而形成裂殖体。成熟后肝细胞破裂,裂殖子被释放入血液,进入红细胞并在其中行裂体增殖。经过若干增殖周期后致使红细胞破裂,出现临床症状。由此可见,子孢子是疟疾感染人类宿主的上游环节,以子孢子作为疟疾疫苗引起有效的免疫应答可阻断子孢子进入肝细胞从而终止疟疾生活史,达到有效防治疟疾的目的。疟疾疫苗的开发研究已有40多年的历史,经历了全虫疫苗（包括死疫苗和放射减毒活疫苗）、基因工程亚单位疫苗和化学合成的多肽疫苗、核酸及病原载体疫苗等几个时期。但是,所有这些疫苗在人体试验中都没有达到理想的效果,其中疫苗的安全性、诱导的免疫应答特异性和效价不高、免疫力持续时间短等都是其中原因之一。如何兼顾疫苗的安全性及增高疟疾疫苗的免疫反应能力,延长疫苗免疫反应的时间是疟疾研究疫苗研究的重要内容。Mueller等人用基因敲除的方法将疟原虫UIS3基因敲除后,发现缺失了UIS3基因的子孢子具有减毒功能,感染动物模型后疟原虫子孢子停留于肝细胞期而不发展为红细胞期疟疾而终止疟疾生活史,将其作为减毒全虫疫苗,在小鼠疟疾模型中可以诱导产生十分理想的免疫保护作用。本研究利用基因打靶技术敲除伯氏疟原虫的UIS3基因,同时为了获得良好的免疫效果,利用转基因技术将具有免疫增强作用的B淋巴细胞趋化因子（B-lymphocytechemoattractant,BLC）转进基因工程减毒的伯氏疟原虫UIS3基因敲除质粒中再转染疟原虫子孢子,以期获得一种既有减毒,又能够增加免疫功能的新型疟原虫株（UIS3-/BLC+）。BLC是近年新发现的一种特异性趋化B细胞的细胞因子,并能刺激细胞表达趋化因子受体BLR1,参与引导B细胞的游走和归巢,能吸引B细胞和CD4+T细胞趋化到免疫应答部位从而增强特异免疫应答。将BLC基因修饰疟疾疫苗,则可增强针对疟原虫的特异性体液免疫应答及细胞免疫应答。本研究根据基因库提供的小鼠BLC基因序列设计克隆扩增BLC的cDNA基因序列的引物,利用RT-PCR技术获得小鼠BLC cDNA基因,通过限制性内切酶酶切和T4酶连接,将BLC基因cDNA序列插入伯氏疟原虫UIS3基因敲除质粒中,获得重组伯氏疟原虫BLC转基因重组质粒。重组质粒含有息疟定抗性基因和绿色荧光蛋白的报告基因,可在转化子中表达。筛选重组质粒并经酶切和DNA序列测定证实正确性后,体外转染真核细胞。经琼脂糖凝胶电泳发现扩增的小鼠BLC基因cDNA序列分子量大小和预期值相一致,重组质粒酶切结果和预期值相符,DNA序列测定显示重组质粒的目的基因阅读框架准确无误。从mRNA蛋白质表达二个层面证明重组质粒可以在真核细胞中有效表达BLC基因。证明已成功构建了伯氏疟原虫BLC转基因重组质粒（UIS3-/BLC+）。伯氏疟原虫在转化前经体外短期培养,利用密度梯度介质Renografin分离子孢子用于电穿孔转化。将构建的伯氏疟原虫BLC转基因重组质粒经酶切线性化后转染伯氏疟原虫,获得UIS3-/BLC+疟原虫株。将此疟原虫株经尾静脉注入小鼠体内,用息疟定腹腔内注射进行药物筛选,经2轮筛选后,得到了阳性的伯氏疟原虫转化子。在荧光显微镜下观察到经息疟定筛选的原虫呈现绿色荧光；经PCR检测到了重组质粒的存在,说明重组质粒已正确的整合在伯氏疟原虫基因之中。本研究进一步在小鼠伯氏疟疾模型中,采用分子生物学、免疫学和组织学等技术对获得的UIS3-/BLC+疟原虫株进行抗疟机理研究。结果发现UIS3-/BLC+疟原虫株可以在肝细胞期有效生长,但未能有效发育转化为红内期,具备了基因敲除减毒的特性。与UIS3子孢子免疫相比,我们发现,UIS3-/BLC+子孢子免疫的小鼠可以有效产生体液和细胞免疫反应,抗体的水平和持续时间均明显强于UIS3-子孢子,T淋巴细胞特异杀伤疟原虫的能力也明显增强。体内外抗疟疾感染试验结果也表明,UIS3-/BLC+子孢子作为疫苗较UIS3-具有更好的抑制疟原虫生长和转化的作用。本研究结果表明,基因工程敲除并转入免疫增强基因的UIS3-/BLC+疟原虫子孢子是一种很好的疟疾疫苗模式,具有较好的临床应用前景,值得深入研究。
陶志勇[8]（2011）在《间日疟原虫特异性抗原的筛选》文中进行了进一步梳理疟疾是一种由媒介按蚊传播的传染性寄生虫病,全球广泛流行。我国的疟疾流行以间日疟为主,虽然我国已成功启动了消除疟疾行动计划,但本世纪前十年中部地区曾经出现间日疟疫情回升,表明疟疾防治工作仍需加强。间日疟原虫感染者血液中的原虫密度通常较低,由于漏诊病例有可能成为当地传播的潜在传染源,因此,及时有效地发现病例,无论是在疟疾控制阶段,还是疟疾消除进程中,都具有十分重要的意义。显微镜血涂片检查是经典的疟疾实验诊断方法,不但需要器材,操作费时费力,检测结果很大程度上依赖于镜检人员的经验和责任心,在疟疾低流行区漏检率高,已不能满足当前疟疾消除的高要求。近年来,基于免疫层析的疟疾快速诊断技术（Rapid Diagnostic Tests, RDTs）发展较快,因其特异性和敏感性均较高,无需仪器设备,操作简单,结果易判读,实施较为方便,非常适合疟疾现场应用,其有效性在以恶性疟流行为主的国家和地区已经得到证实,WHO也给予了高度重视,更改了RDT用于疟疾诊断的指针,强调只要条件允许,所有疑似病例均应在治疗之前,进行实验室疟疾病原检测。然而,迄今为止,仍无适合间日疟诊断的RDT可用,主要原因在于缺少敏感度高,特异性强的间日疟原虫靶抗原,由于我国以间日疟流行为主,因此,迫切需要研究开发适合现场应用的间日疟快速诊断技术。间日疟原虫（Plasmodium vivax, P. vivax）的体外培养技术尚不成熟,难以提供大量实验材料,从感染者采集的血样,其疟原虫密度低,且含有难以去除的宿主白细胞,因此,高纯度的间日疟原虫样本材料来源困难,已成为探寻间日疟原虫特异性抗原的重要瓶颈之一。通过基因重组表达制备的蛋白纯度高,抗原性和天然蛋白类似,可成为解决缺少间日疟原虫特异性诊断抗原的新途径之一。醛缩酶（Aldolase, ALD）是疟原虫糖酵解过程中的一种关键酶,以其作为检测靶点的RDT,在恶性疟检测中也显示出了较好的效果。间日疟原虫醛缩酶（PvALD）的基因序列已知,体外表达PvALD用于制备单抗,是解决缺乏间日疟特异性快速诊断工具的一条可行的途径。泛种特异性抗疟原虫单抗M26-32,能识别包括间日疟原虫在内的五种疟原虫,对其抗体属性的改造,可使之适于标记和检测,利用已有间日疟原虫cDNA文库和M26-32单抗的研究基础,可筛选其潜在的间日疟原虫靶抗原基因。间日疟原虫基因组的正式发布,也为筛选新的间日疟原虫特异性抗原提供了新思路,蛋白序列中出现高度重复,是恶性疟原虫的重要特征,最早被广泛应用的RDT靶抗原恶性疟原虫富组氨酸蛋白2（PfHRP-2）存在着明显串联重复序列。根据基因组信息,对间日疟原虫全部蛋白序列数据进行挖掘和筛选,是开发潜在新型间日疟原虫特异性抗原的新手段之一。本研究根据我国间日疟流行特点,结合疟疾防治新时期对新型快速诊断技术的实际需求,围绕缺少高敏感性间日疟原虫特异性抗原这一科学问题展开研究。通过采用新的生物信息学手段,挖掘间日疟原虫基因组数据中全部蛋白序列中的重复序列信息,联合使用多参数线性B细胞表位预测方法,筛选间日疟原虫特异性抗原肽。借鉴恶性疟原虫诊断性抗原研究的成功经验,选择与乳酸脱氢酶（pLDH）属性相似的间日疟原虫醛缩酶作为靶标,克隆其基因并表达重组蛋白,用于制备具有间日疟诊断价值的PvALD单抗。在已有泛种特异性单抗M26-32和间日疟原虫cDNA文库的研究基础上,改造其抗体的属性,使之适于标记和检测,并筛选其潜在的间日疟原虫靶抗原基因。结合新材料技术,研制用于处理疟原虫感染血样的新型疟原虫滤器,使之适合纯化间日疟原虫感染红细胞,为快速简便地获取虫体进行抗原研究提供技术支持。第一部分基于蛋白重复序列及线性B细胞表位预测筛选间日疟原虫特异性抗原肽【目的】建立一种从间日疟原虫基因组数据库中挖掘蛋白重复序列的方法,运用线性B细胞表位预测工具分析潜在的间日疟原虫特异性抗原肽,并使用实验动物验证。【方法】从PlasmoDB网站下载V6.0版FASTA格式间日疟原虫蛋白序列文件,去除冗余数据,格式化导入SQL数据库。用Delphi语言编写重复序列查找软件,以一定长度的短肽序列为单位,逐一检索其在全部蛋白序列中的重复次数,并输入到SQL数据表中。经过运算,统计出重复序列较高的1,000个短肽,提交到BcePred网站,联合使用4项参数进行连续B表位预测,再经相似性比较,优选其中具有间日疟原虫特异性的肽进行合成,偶联KLH,免疫BALB/c小鼠。分别使用肽-ELISA法检测免疫鼠血清和自然感染间日疟患者血清中抗合成肽抗体滴度。【结果】PlasmoDB V6.0版间日疟原虫全部蛋白序列为5,432个,经导入SQL数据库,由自编软件分析其中16肽的重复次数,共获得了约300万行数据,经统计筛选出重复序列较高的1,000个序列,逐一由BcePred网站四项参数联合预测线性B细胞表位,以4项参数中3项达到或超过阈值为筛选条件,获得22个候选肽,经聚类分析和相似性比较,优选了6个具有潜在间日疟原虫特异性表位的肽,人工合成并偶联KLH后,免疫BALB/c小鼠。经四次全程免疫后,肽-ELISA分别检测小鼠血清,6个合成肽的滴度均超过1:9,000。20例间日疟血清检测结果的阳性率从5%40%不等。【结论】建立了从间日疟原虫基因组数据库中挖掘蛋白重复序列的新方法,所获肽序列经线性B细胞表位预测,得到6个间日疟特异性肽,经动物实验证实均能诱导产生高滴度抗体。第二部分间日疟原虫醛缩酶的克隆、表达及单克隆抗体制备【目的】克隆间日疟原虫醛缩酶编码序列,分别用原核和真核两种体系表达重组间日疟原虫醛缩酶,并制备单克隆抗体。【方法】根据间日疟原虫模式株Salvador I的醛缩酶编码区设计带酶切位点的引物,以现场采集间日疟患者血样中DNA为模板,PCR扩增,分别将产物插入到pET32c和pPIC9K载体上,转化大肠杆菌DH5α,获得相应的重组质粒。原核重组质粒转入表达菌BL21（DE3）,诱导表达并经His标签纯化重组蛋白。真核重组质粒线性化后,转入毕赤酵母GS115,诱导表达后纯化重组蛋白。将原核、真核表达的两种重组PvALD作为抗原,交替使用,并采用腹腔和皮下多点不同注射途径,免疫BALB/c小鼠后,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗重组PvALD抗体杂交瘤细胞株,制备抗重组PvALD单抗。【结果】间日疟醛缩酶的PCR产物为1.1 kb,经酶切、连接、转化、筛选,获得相应重组质粒,经双酶切和测序鉴定,成功构建了pET32c-PvALD原核表达质粒和pPIC9K-PvALD真核表达质粒。pET32c-PvALD转化到BL21（DE3）,经IPTG诱导表达,所获包涵体经变性、His标签纯化和复性,其重组蛋白的分子量约60 kD。pPIC9K-PvALD重组质粒线性化后,转入GS115毕赤酵母,经甲醇诱导可溶性表达,其重组蛋白的分子量为40 kD。两种重组蛋白交叉免疫小鼠,取脾细胞与SP2/0融合,经HAT筛选和ELISA三轮筛选,获得11株分泌抗重组PvALD单抗的杂交瘤细胞株,培养上清ELISA结果显示滴度从1:320到1:1,280之间。【结论】克隆了间日疟原虫醛缩酶基因,利用原核表达系统表达并纯化了重组PvALD融合蛋白,利用真核表达系统表达并纯化了重组PvALD蛋白。制备出11株分泌抗重组PvALD单抗的杂交瘤细胞株。第三部分泛种特异性抗疟原虫单克隆抗体M26-32免疫学特性研究【目的】改造天然IgM类M26-32单抗为单体IgM亚单位,胶体金标记天然和改造后两种M26-32用于检测疟原虫抗原。利用M26-32恶性疟原虫靶抗原基因筛选间日疟原虫cDNA文库。【方法】复苏培养M26-32杂交瘤细胞,接种BALB/c小鼠,收集含有单抗的腹水,用商品HiTrap IgM HP柱纯化腹水中的IgM抗体,并用L-半胱氨酸裂解IgM类M26-32单抗成单体IgM亚单位。经间接免疫荧光检定两种抗体的效价,并用胶体金标记,分别检测恶性疟原虫和间日疟原虫可溶性抗原。利用已知M26-32恶性疟原虫靶基因信息,设计引物,扩增红内期间日疟原虫SMART cDNA次级文库,对产物测序鉴定。【结果】接种20只小鼠,共采集约80 ml单抗腹水,经HiTrap IgM HP柱纯化,获得了纯度较高的M26-32单抗。经L-半胱氨酸裂解后,Native电泳显示天然IgM被裂解为单体亚单位,IFA结果显示,亚单位M26-32与天然五聚体IgM滴度无差别。经胶体金标记后,两种金标抗体均分别能检测1:100稀释的恶性疟原虫和1:10稀释的间日疟原虫可溶性抗原。根据M26-32单抗针对的恶性疟原虫靶抗原基因所设计的9对引物,扩增红内期间日疟SMART cDNA次级文库,产物电泳后切胶纯化,经测序得到的5个序列中,4个属于载体序列,1个为间日疟片段,但经3个读码框架翻译,均与M26-32已知表位序列不相符。【结论】建立了L-半胱氨酸裂解IgM类M26-32单抗为单体IgM亚单位及其胶体金标记的方法,为利用M26-32进一步制备相应快速诊断工具打下了基础。初步筛选了间日疟原虫cDNA次级文库,仍需探索更好的方法以用于筛选M26-32间日疟原虫靶抗原基因。第四部分纯化疟原虫感染血样用白细胞滤器的研制及其应用【目的】开发一种适用于处理疟原虫感染血样的白细胞滤器,评估其性能和在疟原虫相关研究中的应用价值【方法】设计相应模具并用注塑工艺制备滤器塑料外壳,接枝改性PBT（Polybutylene Terephthalate,聚对苯二甲酸丁二醇酯）熔喷无纺布裁剪后作为滤芯,组合后制备新型疟原虫滤器,并对其去除血样中白细胞的能力进行测试。当新型疟原虫滤器达到白细胞去除率>99%的要求后,在间日疟流行区现场评估其性能,并与经典CF11纤维素柱法进行比较,分别测定两种方法处理间日疟原虫感染血样的白细胞去除率,红细胞回收率,感染红细胞密度的变化,并进行体外短期培养,观察疟原虫发育情况。采用疟原虫滤器法分别处理恶性疟原虫感染者血样和伯氏疟原虫感染鼠血样,观察过滤处理前后白细胞和疟原虫的变化。【结果】具有3层无纺布滤芯的新型疟原虫滤器的白细胞去除率为99.31%,达到了设计要求,被用于现场评估。15例现场采集间日疟原虫感染血样,分别经新型疟原虫滤器和CF11柱法处理（样品血量各相当于全血5 ml）,滤器法白细胞去除率为99.03%,优于CF11法（98.41%,P<0.01）,滤器法红细胞回收率为95.48%,明显优于CF11法（87.05%,P<0.01）,而两法处理后疟原虫密度无明显变化（t=0.067,P>0.05）。14例体外短期培养结果显示,滤器法去除白细胞后,疟原虫可以正常发育,与CF11注法相比,两者原虫密度、原虫发育期别比例及形态,无明显差别。镜检观察,与过滤前相比,恶性疟和伯氏疟原虫薄血膜涂片感染红细胞密度没有明显下降,原虫的发育期别比例和形态没有明显变化,厚血膜涂片中残留的白细胞大幅减少（<1个/10个油镜视野）。【结论】成功研制了一种适用于处理疟原虫感染血样的新型疟原虫滤器,适合处理间日疟、恶性疟原虫感染者血样,也适合处理伯氏疟原虫感染鼠血样。经现场应用评估,新型疟原虫滤器法白细胞去除率和红细胞回收率均优于CF11柱法。滤器法处理后的间日疟样本,可以为抗原研究提供更纯的研究材料,也适用于体外法短期培养。本法比CF11柱法更加简便快捷,同时适合实验室和现场应用。综上所述,本课题研究采用新的生物信息学方法,从间日疟原虫全基因组蛋白序列中查找重复序列入手,结合连续B细胞表位预测高通量筛选抗原肽,并对筛到的6个间日疟原虫特异性抗原肽进行了验证;采用分子生物学手段,克隆出了间日疟原虫醛缩酶基因,利用原核和真核表达体系分别表达出重组PvALD蛋白,并制备了11株分泌抗重组PvALD单抗的杂交瘤细胞株;应用免疫与分子生物学方法,改造了泛种特异性抗疟原虫单抗M26-32为单体IgM亚单位,使之易于标记和检测,并利用间日疟原虫cDNA文库,对其中潜在的间日疟原虫M26-32靶抗原基因进了初步筛选;利用新材料技术,研发出了适用于疟原虫感染血样处理的新型疟原虫滤器,为获取纯化的疟原虫抗原研究材料提供了更为高效便捷的工具。
曲久鑫[9]（2010）在《第二代恶性疟原虫多表位人工抗原疫苗的构建和筛选》文中指出摘要疟疾是世界上最严重的传染病之一,2008年有2.43亿人感染疟原虫,约86.3万人因患疟疾死亡,而恶性疟原虫是造成严重危害的主要“元凶”。近年来,虽然在“疟疾控制”方面取得了显着的成绩,但对于预防性和治疗性疟疾疫苗的需求仍十分迫切。目前,针对疟原虫生活史复杂,抗原的表达具有阶段特异性、高度变异性等特点,亚单位、多表位嵌合疫苗成为抗恶性疟疫苗的研究热点。前期研究中,本实验室发明了“表位改组”技术,利用其构建了具有极高表位连接多样性的多表位基因文库,并筛选出了高免疫原性和体外抑制疟原虫生长能力的第一代多表位嵌合抗原M.RCAg-1,证实了“表位改组”技术的可行性。但是,由于其N端带有载体来源的43肽以及6×His蛋白标签,虽然能够用肠激酶（EK）切除,但成本过高,限制了M.RCAg-1的研究价值。本研究在前期工作的基础上,进行了一系列改进,包括：选择了12个以恶性疟原虫红内期主要的疫苗候选抗原为主的15个B细胞和Th细胞表位；在表位连接处引入特定的间隔序列；在多表位抗原的N、C端固定引入抗原侧翼序列FN和FC；所有多表位抗原序列均为疟原虫来源,不含任何载体肽和蛋白标签,符合国家《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》的标准规范。构建并筛选得到了第二代多表位嵌合抗原疫苗。与此同时,通过对多表位嵌合抗原序列（表位）组成、二级结构、免疫原性和疟原虫体外生长抑制率（GIA）水平的对比分析,初步探讨了几个参数间的关系。此外,建立了以C端固定肽的特异性多克隆IgY抗体为配基的免疫亲和层析,为文库中多表位嵌合抗原的高效纯化探索了新的途径。主要取得以下进展：1.成功构建并得到具有高免疫原性和表位连接多样性的第二代多表位嵌合基因文库,同时其小鼠免疫血清对培养恶性疟原虫天然蛋白具有识别多样性。2.从基因文库中筛选得到高免疫原性嵌合抗原D10,免疫大白兔后,总IgG和特异性IgG的GIA水平分别为47%和67%,高于阳性对照抗原MSP1抗体的44%。此外,对72份疫区患者血清的筛查发现,对D10抗原的识别率达到67%,且与患者虫血率显着负相关,提示D10可能与恶性疟疾保护有关。表明全序列为疟原虫来源的嵌合抗原D10,具有继续优化开发的价值。3.我们发现多表位嵌合抗原二级结构中的"Coil-Helix-Coil-Helix"结构影响抗原的免疫原性；同时,也发现含有“连续4个Th细胞表位”结构的多表位嵌合抗原具有更高的GIA水平。4.证实了在多表位嵌入肽段抗体中,抑制性和促进性抗体的存在,并推断其以级联或协同的方式影响总抗体的GIA水平。5.通过制备C端融合序列的特异性多克隆IgY抗体,建立了免疫亲和纯化文库多表位嵌合抗原的新途径。6.证实了基于Hydroethidine染料的流式细胞术,可以作为恶性疟原虫虫血率及其生长周期的相对定量分析方法,并将其工作浓度优化为10μg/ml。本研究利用部分改进的“表位改组”技术,构建并筛选得到了具有较大开发价值的多表位嵌合抗原D10。同时,通过大量实验数据证实了N、C端融合片段作为鉴定和免疫亲和纯化内源标签的实际应用性,以及多表位嵌入肽段序列对多表位嵌合抗原免疫原性和其特异性抗体对疟原虫体外生长抑制率的影响。以上实验结果为各类多表位嵌合抗原疫苗的设计提供了有意义的理论依据。
方强[10]（2010）在《间日疟原虫全长cDNA文库的构建与PvGDH的克隆表达、表位鉴定及单抗研究》文中认为研究背景:疟疾是一种严重危害人类健康的虫媒传染病,也是一个严重影响我国人民健康的重要问题。间日疟虽然病死率低于恶性疟,但流行范围更为广泛,我国的疟疾流行亦以间日疟为主。而且,间日疟的危害一直被低估,相应的研究也落后于恶性疟,有必要加强间日疟防治的研究。疟疾诊断是疟疾防治工作中的一个重要环节,现有的病原学和分子生物学的诊断方法已不适应疟疾现场防治的需要。以检测疟原虫特异性抗原为诊断靶标的快速免疫诊断方法已在疟疾现场防治中得以应用并取得良好效果。但现有的疟疾快速免疫诊断方法尚不能特异性诊断间日疟,间日疟的现场防治中亟需间日疟特异性快速免疫诊断方法。建立cDNA文库,筛选调取功能性基因是一种成熟的发现功能基因（包括诊断靶标、疫苗候选分子等）的策略,目前尚无高质量的我国间日疟原虫红内期全长cDNA文库,因此,建立高质量的我国间日疟原虫红内期全长cDNA文库对筛选调取包括间日疟特异性诊断靶标在内的功能基因,促进我国疟疾防治工作具有重要意义。谷氨酸脱氢酶（GDH）为疟原虫糖酵解中的关键酶,是一个潜在的诊断靶标,已建立的恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶（PfGDH）快速免疫诊断方法已显示了较满意的效果。但间日疟原虫谷氨酸脱氢酶（PvGDH）尚未见报道。因此,克隆表达PvGDH,并制备抗PvGDH特异性单抗,可为进一步研制以PvGDH为诊断靶标的间日疟原虫特异性快速免疫诊断试剂奠定基础,从而为间日疟防治提供有力工具。第一部分红内期间日疟原虫全长cDNA文库的构建与鉴定目的:构建中国红内期间日疟原虫全长cDNA文库。方法:自未经治疗的确诊间日疟患者静脉采血,滤过去除白细胞后浓集含虫红细胞,提取总RNA,RT-PCR法逆转录合成cDNA第一链,LD-PCR合成cDNA第二链及双链cDNA,经蛋白酶K消化、Sfi I酶切、CHROMA SPIN-400柱分离去除小于400 bp的片段后CHROMA SPIN-400柱分离去除小于400 bp的片段后,将cDNA与已经Sfi I酶切的质粒载体连接,转化入DH5α感受态细胞。测定文库的库容和重组率。随机挑选48个菌落,以M13+-引物进行PCR,鉴定插入cDNA片段大小。结果:构建的中国红内期间日疟原虫全长cDNA文库原始库容为1.14×106,重组率为97.2%。重组子插入cDNA片段大小为9002500bp之间。结论:成功构建了中国红内期间日疟原虫全长cDNA文库。第二部分间日疟原虫谷氨酸脱氢酶基因的克隆表达目的:克隆表达间日疟原虫谷氨酸脱氢酶。方法:根据推测的PvGDH编码基因设计特异性引物,采用PCR自构建的中国红内期间日疟原虫全长cDNA文库扩增PvGDH编码基因,将其克隆至pMD18-T载体,经PCR和双酶切鉴定后进行序列测定后,亚克隆至pCOLDⅡ载体进行表达。通过ELISA和Western-blot检测正常人血清、间日疟患者血清、恶性疟患者血清与rPvGDH的免疫反应性;以表达的rPvGDH免疫小鼠制备抗血清,通过ELISA检测抗血清与rPvGDH的免疫反应性;并以Western-blot检测抗血清与间日疟原虫抗原、恶性疟原虫抗原、正常红红细胞抗原的免疫反应性。结果:PCR产物电泳结果显示所克隆的基因约为1450bp,基因测序结果显示克隆的基因为1442bp,与GenBank间日疟原虫Sal-I株基因组测序预测PvGDH编码基因有3个碱基差异,但编码氨基酸无差异,无内含子。经原核表达获得可溶性的PvGDH重组蛋白（rPvGDH）,可为间日疟患者血清和恶性疟患者血清所识别,而不能被正常人血清识别。制备的PvGDH抗血清可以识别rPvGDH、间日疟原虫抗原、恶性疟原虫抗原,而不能识别正常红细胞抗原。结论:成功克隆了PvGDH,并表达了具有免疫学活性的rPvGDH。第三部分间日疟原虫谷氨酸脱氢酶线性B细胞表位的预测与鉴定目的:预测并鉴定PvGDH线性B细胞表位。方法:利用生物信息软件分析PvGDH、PfGDH序列,预测PvGDH、PfGDH线性B细胞表位,并比较分析,预测特异性PvGDH线性B细胞表位;合成预测PvGDH线性B细胞表位肽,免疫小鼠,制备抗血清;通过ELISA和Western-blot检测抗血清与rPvGDH的免疫反应性;通过Western-blot检测抗血清与与间日疟原虫抗原、恶性疟原虫抗原、正常红红细胞抗原的免疫反应性。结果:预测出1个特异性PvGDH线性B细胞表位;该预测表位肽抗血清可以识别rPvGDH和间日疟原虫抗原,而不能识别恶性疟原虫抗原和正常红细胞抗原。结论:预测并鉴定成功1个特异性PvGDH线性B细胞表位。第四部分抗PvGDH单克隆抗体研究目的:分别通过rPvGDH和PvGDH预测表位肽制备抗PvGDH单抗。方法:分别利用rPvGDH和PvGDH预测表位肽作为免疫原免疫小鼠,制备抗PvGDH单克隆抗体,并检测制备的单抗的滴度和抗体亚类;通过ELISA和Western-blot检测制备的单抗与rPvGDH的免疫反应性。结果:通过rPvGDH制备了4株单抗,通过PvGDH预测表位肽制备6株单抗,抗体滴度均大于1:2430;通过PvGDH预测表位肽制备的单抗中有2株抗体亚类为IgG1,其余均为IgG2b。10株单抗均可有效识别rPvGDH。结论:成功地通过rPvGDH和PvGDH预测表位肽2种方法制备得到10株抗PvGDH单抗。
二、3种恶性疟原虫红内期抗原基因的测序和序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、3种恶性疟原虫红内期抗原基因的测序和序列分析（论文提纲范文）
（1）恶性疟原虫A型RIFIN的基因多态性和体液免疫特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 A型rif基因的选择跟宿主差异的关系 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器设备 |
| 2.2 DNA测序样本收集及测序 |
| 2.3 测序质量评估 |
| 2.4 全基因组SNP检测与混合感染评估 |
| 2.5 遗传结构分析 |
| 2.6 全基因自然选择检验 |
| 3 结果 |
| 3.1 样本鉴定 |
| 3.2 二代测序数据质控 |
| 3.3 多样性评估 |
| 3.4 种群遗传结构 |
| 3.5 全基因组选择信号探查 |
| 4 讨论 |
| 4.1 种群的差异来源 |
| 4.2 两个种群的多样性差异 |
| 4.3 受强选择的基因差异 |
| 5 结论 |
| 第二部分 A-RIFIN多肽的体液免疫(IgG)应答 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 序列收集和参考序列下载、进化分析及自然选择检验 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 主要试剂及配制 |
| 2.4 主要仪器设备 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.6 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 3个A型rif基因的多态性、进化分析及A-RIFIN多肽选择 |
| 3.2 野生型和突变的主要基因型A-RIFIN多肽的合成 |
| 3.3 野生型和突变的主要基因型A-RIFIN多肽的抗体反应 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 A-RIFIN多肽和LILRB1抑制性受体的结合研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂及配制 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（2）缅甸流行区无症状疟疾感染流行病学调查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :缅甸无症状疟疾感染流行特点分析 |
| 1前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 调查地点 |
| 2.1.4 研究样本 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 光学显微镜镜检及快速检测实验鉴定无症状疟疾感染 |
| 2.2.2 滤纸血样本的DNA抽提 |
| 2.2.3 基于混合池策略的 nested PCR 鉴定无症状疟疾的感染类型 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 疟疾感染率的地区差异 |
| 3.2 不同方法检测恶性疟原虫感染的比较 |
| 3.3 无症状疟疾感染的危险因素分析 |
| 3.4 混合池策略在分析流行病学检测中的效率 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :缅甸无症状恶性疟原虫感染中与耐药性相关的遗传变异 |
| 1前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 研究地点和样本 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 恶性疟原虫无症状感染的诊断 |
| 2.2.2 耐药基因的选择、扩增和测序 |
| 2.2.3 序列分析与统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 横断面调查的血液样本中的无症状感染 |
| 3.2 与 SP 耐药相关的的 Pfdhfr 和 pfdhps 突变 |
| 3.3 与氯喹耐药相关的pfcrt和 pfmdr1 突变 |
| 3.4 Pfmrp1突变 |
| 3.5 K13突变 |
| 3.6 单体型网络的构建 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）恶性疟原虫对小分子化合物库（Malaria Box）和双氢青蒿素的筛选及抗药性机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 疟原虫研究简介 |
| 1 恶性疟原虫的生活史及入侵细胞研究简介 |
| 2 疟疾诊断方法的研究进展 |
| 3 疟疾疫苗的研究进展 |
| 4 小结 |
| 第2章 恶性疟原虫的药物研发进展 |
| 1 初期抗疟药物 |
| 2 青蒿素的诞生 |
| 3 当代抗疟药物抗性研究进展 |
| 4 小结 |
| 第3章 恶性疟原虫抗药性研究进展 |
| 1 早期基因组分析技术研究恶性疟原虫抗药位点 |
| 2 全基因组相关联分析(GWAS)抗药基因位点 |
| 3 恶性疟原虫的非基因抗性机制的研究进展 |
| 4 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 临床恶性疟原对小分子化合物库(MalariaBox)的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第2章 临床恶性疟原虫潜在抗药性机制分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第3章 体外筛选双氢青蒿素抗药性恶性疟原虫虫株及表型分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第4章 恶性疟原虫抗双氢青蒿素药物机制的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）恶性疟原虫exosome-like催化亚基的鉴定与降解特性分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 真核生物外切体概述 |
| 1 真核生物外切体的组成与结构 |
| 1.1 外切体核心结构Exo9 |
| 1.2 RRP44/Dis3亚基 |
| 1.3 RRP6亚基 |
| 1.4 真核生物外切体的亚基同系物及其存在形式 |
| 2 真核生物外切体的功能 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 生物信息学分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 荧光定量PCR检测目的催化亚基在恶性疟原虫 3D7株红内期的转录差异 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 恶性疟原虫exosome-like催化亚基重组蛋白质的原核表达、纯化以及多克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 目的亚基的天然蛋白质鉴定与亚细胞定位分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 恶性疟原虫exosome-like催化亚基的体外RNA降解特性分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）红内期恶性疟原虫3D7中等长度ncRNA（RUF6-15）的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 一、前言 |
| 1. 疟疾及疟原虫简介 |
| 2. 非编码RNA研究简介 |
| 3. 粘附调节机制 |
| 4. 本课题前期工作 |
| 二、实验材料 |
| 1. 化学试剂及实验材料 |
| 2. 工具酶、分子量标准及试剂盒 |
| 3. 培养基 |
| 4. 恶性疟原虫 |
| 5. 探针及引物合成 |
| 6. 质粒载体 |
| 7. 菌株和细胞株 |
| 8. 本实验所用主要仪器 |
| 9. 分析软件 |
| 三、实验方法 |
| 1. 红内期恶性疟原虫体外培养、冻存与复苏 |
| 1.1 P.falciparum 3D7的体外培养 |
| 1.2 细胞冻存 |
| 1.3 细胞复苏 |
| 1.4 细胞计数 |
| 2. 红内期恶性疟原虫3D7的同步化与虫体提取 |
| 2.1 恶性疟原虫环期同步化培养 |
| 2.2 裂解感染红细胞、收集虫体 |
| 3. 总RNA的提取与鉴定 |
| 3.1 总RNA的提取 |
| 3.2 小片段RNA的提取 |
| 3.3 RNA样品的凝胶电泳 |
| 3.4 体外转录合成DIG标记的RNA探针 |
| 3.5 RNA印记实验(Northern blot) |
| 4. RUF6-15过表达载体的构建、转染与鉴定 |
| 4.1 RUF6-15过表达载体的构建 |
| 4.2 质粒转染 |
| 4.3 抗性虫株的相关鉴定 |
| 4.4 生长曲线的制作 |
| 4.5 粘附实验 |
| 5. 对照株与过表达株转录水平的高通量测序、分析及鉴定 |
| 5.1 建库测序 |
| 5.2 生物信息分析流程 |
| 5.3 高通量结果的鉴定 |
| 6. RUF6-15 Knockdown虫株的建立 |
| 6.1 RUF6-15的Antisense的合成 |
| 6.2 Antisense转染 |
| 7. FISH(fluorescence in situ hybridization) |
| 7.1 相关试剂的配制 |
| 7.2 实验步骤 |
| 8. 荧光素酶实验 |
| 8.1 预测RUF6-15分别与靶基因的结合位点 |
| 8.2 重组表达荧光素酶的pcDNA3.1-Luc质粒 |
| 8.3 293ET细胞的转染 |
| 8.4 荧光素酶实验(Dual-Luciferase Reporter Assay) |
| 9. 流式检测转染效率 |
| 10. Biotin pulldown实验 |
| 10.1 T7/SP6体外转录 |
| 10.2 Biotin Pull-down |
| 10.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白样品 |
| 10.4 银染 |
| 四、实验结果 |
| 本研究基本思路 |
| 1. RUF6-15在红内期恶性疟原虫3D7中的表达特性 |
| 1.1 RNA探针的体外转录 |
| 1.2 不同时间点RUF6-15的转录特性 |
| 1.3 RUF6-15在恶性疟原虫3D7中的定位 |
| 2. RUF6-15过表达株的建立及鉴定 |
| 2.1 RUF6-15过表达株的建立 |
| 2.2 RUF6-15过表达株的鉴定 |
| 3. 转录本水平的高通量测序及验证 |
| 3.1 RNA-Seq |
| 3.2 数据分析 |
| 3.3 差异基因的验证 |
| 4. RUF6-15敲低株的建立及相关基因鉴定 |
| 4.1 RUF6-15敲低株的建立 |
| 4.2 RUF6-15敲低株的鉴定 |
| 4.3 RUF6-15敲低株相关靶基因的检测 |
| 5. RUF6-15与靶基因的作用关系 |
| 五、讨论 |
| 六、小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述：CRISPR系统介导的基因组编辑在恶性疟原虫研究中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ：NH141103_pfa_ref转录组生物信息分析结题报告 |
| 附录Ⅱ：博士期间发表的文章和参加的会议 |
| 致谢 |
（6）恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL1和MSPDBL2的表达和分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 麦胚无细胞蛋白合成系统表达恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白 MSPDBL1和 MSPDBL24 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分 恶性疟原虫 MSPDBL2-DBL2 结构域的原核表达和抗原性分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分 中缅边境恶性疟原虫 PFMSPDBL2 基因多态性分析 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 1. 疟原虫入侵红细胞和红细胞黏附的相关过程 |
| 2. 恶性疟原虫中的 DBL（Duffy binding-like）结构域超家族 |
| 3. 展望 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 硕士在读期间研究成果 |
| 致谢 |
（7）新型转基因减毒疟疾疫苗的构建与抗疟机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 序言 |
| 1.1 疟原虫 |
| 1.1.1 疟原虫分类学地位及亚种 |
| 1.1.2 疟原虫的生活史 |
| 1.1.2.1 疟原虫在人体内的发育 |
| 1.1.2.2 疟原虫在按蚊体内的发育 |
| 1.1.3 疟原虫的致病性 |
| 1.1.4 疟疾防治 |
| 1.1.4.1 蚊媒防治 |
| 1.1.4.2 化学药物防治 |
| 1.1.4.3 疟疾疫苗防治 |
| 1.2 疟疾疫苗 |
| 1.2.1 疟疾疫苗的主要类别 |
| 1.2.2 疟疾疫苗研究进展 |
| 1.2.2.1 抗红前期原虫疫苗 |
| 1.2.2.2 抗红内期原虫疫苗 |
| 1.2.2.3 传播阻断疫苗 |
| 1.2.2.4 复合多价亚单位疫苗 |
| 1.2.2.5 疟疾核酸疫苗 |
| 1.2.3 疟疾疫苗研发面临的困难 |
| 1.2.3.1 疟原虫抗原变异及多途径入侵 |
| 1.2.3.2 疟原虫候选抗原多,保护性不强,免疫原性复杂 |
| 1.2.3.3 难以产生足够的高水平抗体和缺乏持久的免疫力 |
| 1.2.3.4 缺乏有效的动物模型和佐剂 |
| 1.2.4 疟疾疫苗研发未来展望 |
| 1.3 本课题研究的基本思路 |
| 1.4 本课题研究的技术路线 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒载体、菌种、细胞和疟原虫株 |
| 2.1.2 实验动物和媒介昆虫 |
| 2.1.3 试剂、材料及试剂盒 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.1.5 实验仪器和设备 |
| 2.1.6 分析软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 伯氏疟原虫BLC转基因重组打靶质粒的构建 |
| 2.2.1.1 质粒载体的选择 |
| 2.2.1.2 小鼠目的基因序列及引物设计 |
| 2.2.1.3 BALB/c小鼠脾脏组织中提取总RNA |
| 2.2.1.4 目的基因片段的体外RT-PCR扩增和产物鉴定 |
| 2.2.1.5 RT-PCR产物cDNA的纯化 |
| 2.2.1.6 cDNA片段的回收 |
| 2.2.1.7 质粒的提取 |
| 2.2.1.8 质粒载体的去磷酸化 |
| 2.2.1.9 感受态细胞的制备(Cacl_2法) |
| 2.2.1.10 质粒转化大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.2.1.11 双酶切和连接反应构建BLC转基因重组质粒 |
| 2.2.1.12 重组打靶转基因质粒的鉴定 |
| 2.2.1.13 重组pUIS3~-/BLC~+质粒真核(COS-1细胞株)表达BLC及其功能鉴定 |
| 2.2.2 伯氏疟原虫培养和疟原虫子孢子提取 |
| 2.2.2.1 伯氏疟原虫短期培养 |
| 2.2.2.2 伯氏疟原虫子孢子的分离 |
| 2.2.2.3 疟原虫感染的检测 |
| 2.2.2.4 伯氏疟原虫冻存保种和接种 |
| 2.2.2.5 按蚊常规饲养及传代 |
| 2.2.3 基因打靶UIS3~-/BLC~+全虫疫苗的构建、筛选和鉴定 |
| 2.2.3.1 重组转染质粒的线性化 |
| 2.2.3.2 伯氏疟原虫电穿孔转化 |
| 2.2.3.3 伯氏疟原虫转化子的药物筛选 |
| 2.2.3.4 伯氏疟原虫转化子鉴定 |
| 2.2.4 UIS3~-/BLC~+全虫疫苗抗疟机理分析 |
| 2.2.4.1 基因敲除疟原虫的表型及活性测定 |
| 2.2.4.2 动物实验检测免疫反应类型和水平 |
| 3 结果 |
| 3.1 RT-PCR扩增BLC基因CDNA序列结果 |
| 3.2 重组质粒的构建、鉴定及序列分析 |
| 3.3 重组pUIS3~-/BLC~+质粒真核表达BLC及其功能鉴定 |
| 3.4 重组pUIS3~-/BLC~+质粒真核表达BLC蛋白鉴定 |
| 3.5 BLC趋化活性检测 |
| 3.6 伯氏疟原虫培养和疟原虫子孢子提取技术平台的建立 |
| 3.7 基因打靶并筛选获得阳性基因敲除疟原虫株 |
| 3.8 对筛选到的阳性疟原虫株进行表型及活性测定 |
| 3.9 动物实验检测免疫反应类型和水平 |
| 3.10 动物实验检测细胞免疫反应水平 |
| 3.11 体内抗疟原虫攻击实验 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者在读期间科研成果简介 |
| 附件 |
| 致谢 |
（8）间日疟原虫特异性抗原的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 序言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 基于蛋白重复序列及线性B 细胞表位预测筛选间日疟原虫特异性抗原肽 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 间日疟原虫醛缩酶的克隆、表达及单克隆抗体制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 泛种特异性抗疟原虫单克隆抗体M26-32 免疫学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 纯化疟原虫感染血样用白细胞滤器的研制及其应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 本文使用的缩略词表 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士研究生期间撰写的文章和获得的研究资助 |
| 致谢 |
（9）第二代恶性疟原虫多表位人工抗原疫苗的构建和筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第一部分:多表位随机嵌合基因文库的构建及其免疫原性评价 |
| 第二部分:多表位嵌合抗原疫苗的筛选及其功能性分析 |
| 第三部分:应用免疫亲和层析柱对多表位嵌合抗原的纯化通用性的探索 |
| 第四部分:Hydroethidine-流式细胞术法相对定量分析恶性疟原虫虫血率及其生长周期 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）间日疟原虫全长cDNA文库的构建与PvGDH的克隆表达、表位鉴定及单抗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 红内期间日疟原虫全长cDNA 文库的构建与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 间日疟原虫谷氨酸脱氢酶基因的克隆表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 间日疟原虫谷氨酸脱氢酶线性B 细胞表位的预测与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 抗PvGDH 单克隆抗体研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 本文使用的缩略词表 |
| 综述 |
| 攻读博士研究生期间撰写的文章和获得的研究资助 |
| 致谢 |
四、3种恶性疟原虫红内期抗原基因的测序和序列分析（论文参考文献）
- [1]恶性疟原虫A型RIFIN的基因多态性和体液免疫特性研究[D]. 史善美. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [2]缅甸流行区无症状疟疾感染流行病学调查[D]. 刘紫玲. 中国医科大学, 2020(01)
- [3]恶性疟原虫对小分子化合物库（Malaria Box）和双氢青蒿素的筛选及抗药性机制研究[D]. 李伟志. 吉林大学, 2018(12)
- [4]恶性疟原虫exosome-like催化亚基的鉴定与降解特性分析[D]. 余胜超. 吉林大学, 2016(09)
- [5]红内期恶性疟原虫3D7中等长度ncRNA（RUF6-15）的功能研究[D]. 郝萧. 北京协和医学院, 2016(01)
- [6]恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL1和MSPDBL2的表达和分析[D]. 仰梦佳. 苏州大学, 2014(05)
- [7]新型转基因减毒疟疾疫苗的构建与抗疟机理研究[D]. 林英姿. 海南大学, 2011(09)
- [8]间日疟原虫特异性抗原的筛选[D]. 陶志勇. 苏州大学, 2011(06)
- [9]第二代恶性疟原虫多表位人工抗原疫苗的构建和筛选[D]. 曲久鑫. 中国协和医科大学, 2010(09)
- [10]间日疟原虫全长cDNA文库的构建与PvGDH的克隆表达、表位鉴定及单抗研究[D]. 方强. 苏州大学, 2010(10)