丁晓蓉[1]2003年在《针刺对快速老化小鼠SAMP10海马、皮层衰老相关基因表达谱影响的实验研究》文中研究说明本课题采用cDNA Array技术，以快速老化模型小鼠(SAMP10)为实验对象，以正常老化小鼠(SAMR1)为对照，观察了8月龄R1皮层海马、P10皮层海马、P10皮层海马“益气调血、扶本培元”针法组和P10海马非穴位刺激组等七组之间588个基因表达的变化，以探讨衰老对SAMP10皮层海马的影响以及针刺对衰老相关基因的作用，分析“益气调血、扶本培元”针法改善学习记忆障碍的机理。结果显示如下： (1)伴随快速老化，P10皮层共有9类17个基因的表达发生了变化，其中15个基因的表达下调，2个基因的表达上调；P10海马，共有7类10个基因的表达发生变化，其中8个基因的表达下调，2个基因的表达上调。皮层和海马均表现为下调基因占优势，说明衰老时基因表达以下调为主，涉及转录调节因子、细胞内转录／效应／调节因子、应激反应蛋白、DNA合成重组修复相关基因、细胞骨架／动力蛋白、细胞凋亡相关基因、细胞周期基因、细胞信号／细胞外联系蛋白、细胞受体等方面，这一结果充分体现了衰老机制的复杂性。 (2)P10皮层“益气调血、扶本培元”针法组与P10皮层对照组相比，共有9类20个基因的表达发生变化，其中15个基因的表达上调，5个基因的表达下调；P10海马“益气调血、扶本培元”针法组与P10海马对照组相比，共有9类16个基因的表达发生变化，其中10个基因的表达上调，6个基因的表达下调。涉及转录调节因子、细胞内转录／效应／调节因子、应激反应蛋白、DNA合成重组修复相关基因、细胞骨架／动力蛋白、细胞凋亡相关基因、细胞周期基因、细胞信号／细胞外联系蛋白、细胞受体和DNA结合和染色质蛋白等方面。针刺调节基因表达趋向于正常老化组，说明“益气调血，扶本培元”针法能够通过多方位、多层次的整体调节来延缓脑老化。 (3)P10海马非穴位刺激组与P10海马对照组相比，共有3类6个基因的表达发生变化，其中5个基因的调节方向与“益气调血、扶本培元”针法组相同，1个方向相反，涉及转录调节因子、细胞周期基因和细胞信号／细胞外联系蛋白等方面。还有一些基因在SAMP10小鼠脑衰老中没有出现变化，而针刺后其表达发生了变化。由此提出了针刺治疗效应和应激效应的假说。
于涛[2]2002年在《针刺对脑衰老相关基因表达谱影响的实验研究》文中进行了进一步梳理随着人类寿命的延长，人口老龄化问题已引起全社会的关注。衰老及相关疾病给老人及其亲属乃至社会都带来沉重的负担，其中脑衰老更是影响老年人生活质量的首要因素。因而探讨脑衰老的机理，寻找合理的防治方法成为医学界亟待解决的问题。目前，现代医学对脑衰老机理的认识尚处于争论之中，治疗方面亦未找到有效方法。祖国医学对脑衰老的认识有其特色。导师韩景献教授针对脑衰老的肾精亏损、脾胃虚衰、瘀血停着、痰浊阻滞的病机特点确立了“益气调血、扶本培元”针法，其主穴为：膻中、中脘、气海、血海和足叁里。该针法可以明显改善SAMP10老化鼠学习记忆能力，但其作用机制尚需进一步阐明。本实验采用cDNA Array技术，以快速老化模型小鼠(SAMP10)为实验对象，以正常老化小鼠(SAMR1)为对照，观察了SAMR1 7月龄对照组、SAMP10 7月龄对照组、SAMP107月龄“益气调血、扶本培元”针法组等叁组之间588个基因表达的变化，以探讨SAMP10脑衰老的机制及“益气调血、扶本培元”针法改善脑衰老症状的机理。结果显示： 1．SAMP10对照组和同源正常老化SAMR1对照组相比，基因表达谱有明显差异。两组之间共有53个基因的表达发生了变化。SAMP10较正常老化有16个基因表达上调，37个基因表达下调，共涉及十二类基因。其中，(1)应激反应蛋白中细胞色素P450 1A1表达下调，谷胱甘肽S转移酶、成纤维细胞生长因子8、NF-kappa-B转录因子p65亚单位、热休克蛋白86表达上调；(2)DNA合成、重组、修复相关基因中DNA外切修复蛋白ERCC5、重组激活蛋白1表达下调，DNA修复蛋白RAD51、DNA修复蛋白RAD52表达上调；(3)神经营养因子及受体中胰岛素样生长因子Ⅱ前体、胰岛素样生长因子ⅠA、生长激素受体、雌激素受体表达下调， Ⅰ型胰岛素样生长因子受体α亚单位表达上调；(4)凋亡相关蛋白中BAX膜同功型α、蛋白激酶B、淋巴毒素受体表达下调，长型FLICE样抑制蛋白、载脂蛋白J表达上调；(5)突触相关蛋白中视磺酸受体β-2、ERBB-2受体、神经钙粘蛋白前体和突触相关蛋白90A表达下调，Ⅰ型cAMP依赖性蛋白激酶β调节链、14-3-3蛋白 eta表达上调：（6）细胞粘联受体蛋白中 Cd14、细胞表面糖蛋白。ac－IQ亚单位、整合素 Q 4表达下调，白细胞粘联糖蛋白 LFA－IQ 链表达上调；（7）细胞受体中卜羟色胺IB受体、巨噬细胞集落刺激因子1受体表达下调，白介素一7受体口表达上调；田）细胞信号传导相关基因中骨形态生成蛋白 咖4前体、血管生成素、血管内皮生长因子前体、转化生长因子pZ前体表达下调；（9）细胞表面抗原中CD3抗原zeta表达下调。QO）细胞骨架蛋白中1 ＠型细胞骨架角蛋白 IS表达下调；01）蛋白更新相关基因中巨噬细胞纤溶酶原激活剂抑制因子2、基质金属蛋白酶14前体表达下调，纤溶酶原激活剂抑制因子、金属蛋白酶抑制因子2前体表达上调；肥 转录调节因子中Neu，。n。lhellx一1。。p一hhx pr。tehNEX一1． 干扰素诱导蛋白1、干扰素调节因子2、Brn－3．2 POU、Engralled protein（En－2）homolog、Gbx 2、Homeobox protein D4、PAX－8、CACCC Box－binding protein BKLF、红细胞转录因子 NF－EZ表达下调，脑因子 1表达上调。结果提示 SAMP的脑萎缩、学习记忆障碍等老化症状可能与下列因素有关：氧化应激水平升高；DNA修复机制紊乱；胰岛素样生长因子系统、生长激素受体、雌激素受体等神经营养因子及受体的夫调；凋亡调控机制紊乱；这些机制可能会导致神经元异常凋亡增加。此外，SA）IP10脑中尚可能存在解毒功能紊乱，长时程增强及长时程压抑调节突触传递效率失衡，突触结构异常、传递障碍及神经递质合成异常，抗炎症、免疫吞噬等多种免疫功能障碍，5－HT受体表达下调，巨噬细胞集落刺激回子受体介导的巨噬细胞集落刺激回子神经保护功能降低，血管生成障碍及血脑屏障的功能失常等，从而使神经系统的功能异常。这一结果充分体现了衰老机制的复杂性。2．SAMP“益气调血、扶本培元”针法组与 SAM门 0对照组相比，有 56个基因的表达不同，其中18个基因表达下调，38个基因表达上调，共涉及十二类基因。我们发现，该针法对大多数与 SAMplo快速脑老化有关的基＠因的表达都具有良性调整作用，即可上调由于脑衰老所造成的低表达的基因，下调由于脑衰老所造成的高表达的基因。此外，某些基因如应激反应蛋白中的热休克蛋白 84、凋亡相关蛋白中的 BAD蛋白、突触相关蛋白中的 台早期生长反应蛋白 1和转录调节因子中的 AT mot i厂一结合因子 1等的表达 348虽未表现出与SAMI，10快速脑老化有关，但是这些基因的表达爱针刺的影响，可能参与了针刺改善SANP10脑老化症状的作用。由此我们推测：“益气调血、扶本培元”针法改善 SAMI，的学习记忆障碍等老化症状是多途径、多层次、多靶点的整体调整作用的结果。其机制主要包括：降低 SAMP的氧化
贾文睿[3]2017年在《针刺对应激性高血压前期大鼠心脏基因表达谱的影响》文中指出高血压作为最常见的慢性病,是心脑血管疾病最主要的独立危险因素,在全球范围内广泛存在并严重危害着人类健康。高血压的发病机制与环境因素密切相关,长期的应激刺激可导致高血压疾病的发生。动物或人长期处于应激状态下会出现心率增快、血压升高等心血管功能亢进的反应,并能逐渐发展为应激性高血压。伴随现代社会生活压力的增加,长期从事精神紧张工作人群的应激性高血压患病率显着升高。临床上高血压的发生大多会经历一个从正常血压(120 mmHg/80 mmHg)向一期高血压(≥140 mmHg/90 mmHg)发展的缓慢过程,即高血压前期阶段。美国高血压预防、诊断、评价与治疗联合委员会的第7次报告中首次正式提出了"高血压前期"的概念,是指收缩压在120-139 mmHg之间和或舒张压在80-89mmHg之间的阶段。大量流行病学证据表明,高血压前期在某些国家的发生比例高达30%-50%。应激性高血压的发病过程经历了一个从生理向病理演变的高血压前期阶段,即应激性高血压前期(stress-induced prehypertension,SIPH)。高血压前期常合并传统心血管疾病危险因素,并且与心血管疾病的发病密切相关。有研究指出在SIPH阶段出现了亚临床靶器官的损害以及相应基因和蛋白表达的改变。因此对SIPH及时进行预防性干预,将能有效遏制高血压的发生,并可保护靶器官、降低心脑血管疾病的发病率。而针刺作为一种替代药物的治疗方法,具有便捷、安全、少不良反应等突出优势,已用于治疗包括高血压在内的多种心血管疾病。高血压是一种受大量基因调控的多基因疾病,心脏是高血压病最容易累及的靶器官,针刺可通过调控特定基因的表达从而起到降压和心脏保护作用。本课题组既往研究发现SIPH模型大鼠出现血管内皮功能异常、心肌损害等现象,针刺可有效调控SIPH模型大鼠的血压,对血管内皮因子一氧化氮、乙酰胆碱、神经肽Y等均有影响,对血管内皮功能具有保护作用。本实验采用基因芯片技术观察针刺对SIPH大鼠心脏基因表达谱的影响,以探究针刺对SIPH的降压以及心脏保护作用机制。研究目的:探究针刺对SIPH大鼠心脏基因表达谱的影响效应,寻找针刺调控SIPH的干预靶点,以揭示针刺对SIPH的降压以及心脏保护作用机制。研究方法:实验一:针刺对SIPH大鼠血压及心肌组织形态学的影响将36只雄性Wistar大鼠随机分为空白组,模型组和模型+针刺组,每组各12只。运用足底电击结合噪声的复合刺激方法对模型组与模型+针刺组大鼠进行为期11天的造模,制备SIPH大鼠模型,并在造模过程中对模型+针刺组进行针刺干预。分别在造模前1天以及造模第3、5、7、9、11天测量大鼠收缩压(Systolic pressure,SP),并于造模结束后第二天进行取材,运用HE染色法观察各组大鼠心肌组织形态学变化。实验二:针刺对SIPH大鼠心肌基因表达谱的影响采用Rat Gene 2.0 Array技术观察叁组大鼠心肌基因表达谱的改变,以(P<0.05,Fold Changes>1.5 or Fold Changes<-1.5)为标准筛选差异表达基因。运用GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析对致病相关差异基因以及针刺治疗后的反应基因进行相关生物学功能与通路分析,以期揭示针刺调控SIPH的干预效应机制,为高血压病的防治提供科学依据。实验叁:针刺对S1PH大鼠心肌组织中HbA1c、Igfbp-3、Pik3ca、Car4 mRNA表达的调控通过检索 National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库以及查阅文献资料,从叁个组的共同差异表达基因中筛选出与SIPH发病及针刺治疗均密切相关的基因HbA1c、Igfbp-3、Pik3ca、Car4作为关键基因,运用荧光定量PCR技术(quantitative real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)对其 mRNA 表达量进行验证。通过观察造模后及针刺治疗后SIPH大鼠心肌HbA1c、Igfbp-3、Pik3ca、Car4 mRNA的表达变化,探讨针刺改善SIPH的分子生物学机制。研究结果:实验一:血压结果显示从造模开始直至造模第11天结束,模型组大鼠SP持续升高并一直保持在高血压前期水平,与空白组大鼠SP相比,均具有极显着性差异(all,P<0.01)。造模过程中,大鼠出现了明显的体征及行为学改变,出现情绪紧张、易激惹、眼睛充血外凸等现象。造模结束时模型大鼠出现心肌细胞排列紊乱、松散,细胞核变大或溶解等一系列组织病理学改变。提示造模成功。与模型组相比,模型+针刺组大鼠SP在针刺第5、第7天明显降低,有极显着性差异(all,P<0.01),针刺第9、第11天,有显着性差异(all,P<0.05)。说明针刺太冲、曲池穴对SIPH有明显的降压作用。模型+针刺组大鼠的大部分心肌细胞结构正常,部分细胞核形态发生改变,损伤程度轻于模型组大鼠,说明针刺可改善高血压靶器官心脏的损害,具有心保护作用。实验二:基因芯片结果显示,模型组与空白组相比有192个差异表达基因,其中126个下调,66个上调;模型+针刺组与模型组相比,有169个差异表达基因,其中39个下调,130个上调。有49个基因是叁个组的共同差异表达基因,其在模型制备以及针刺干预后均发生显着的表达差异,通过检索NCBI数据库以及查阅大量文献,从中筛选出与SIPH发病及针刺治疗均密切相关的基因HbA1c、Igfbp-3、Pik3ca、Car4,把它们作为关键基因。GO功能富集分析结果显示模型组与空白组的差异表达基因主要功能是节律过程(rhythmic process)、生理节律(Circadian rhythm)、平移伸长(translational elongation)、核糖体(ribosome)等,模型+针刺组与模型组的差异表达基因主要功能是胞质核糖体(cytosolic ribosome)、核糖体亚基单位(ribosomal subunit)、翻译延伸等(translational elongation)、胞质成分(cytosolic part)。KEGG 通路分析显示有 6 条通路既是与模型组VS空白组差异表达基因相关的通路,同时也是与模型+针刺组VS模型组差异表达基因相关的通路。其中rno03010:Ribosome是富集度最高的通路,与SIPH的发病及针刺治疗SIPH均密切相关。通过检索GenomeNet、KEGG PATHWAY Database数据库以及查阅文献资料,发现rno04115:p53信号通路与高血压及心脏病的发病密切相关。由此推测rno03010:Ribosome与rno04115:p53信号通路是针刺调控SIPH的关键通路。实验叁:与空白组相比,模型组基因HbA1c、Car4的表达均显着升高(P<0.01),Igfbp-3、Pik3ca的表达显着下降(P<0.01,P<0.05)。与模型组相比,模型+针刺组HbA1c、Car4的表达显着下降(P<0.01,P<0.05),Igfbp-3、Pik3ca的表达显着升高(P<0.01,P<0.05)。PCR结果与芯片结果相一致。提示:针刺调节SIPH大鼠血压的机制可能与调控高血压相关基因HbA1c、Igfbp-3、Pik3ca和Car4的表达有关。结论:1.针刺太冲、曲池穴对SIPH大鼠具有明显的降压效应并且对大鼠心肌损伤具有一定程度的保护作用。2.针刺太冲、曲池穴可对SIPH大鼠心肌基因表达谱产生影响。3.SIPH大鼠心肌关键基因HbA1c、Igfbp-3、Pik3ca、Car4的mRNA异常表达可能是SIPH发病的重要分子生物学机制,而针刺太冲、曲池穴降压及心保护作用可能是通过调控关键基因的表达及其信号转导通路实现。
樊小农[4]2003年在《用基因表达谱芯片筛选老年痴呆异常表达基因及针刺对其主效基因的影响》文中研究指明老年性痴呆是多基因协同(拮抗)作用的生命过程，发病率逐年上升，尚未找到确切病因。本研究利用小鼠基因表达谱芯片，应用AD替代研究模型SAM，筛选老年痴呆异常表达基因，探讨其在老年痴呆病生理机制中的作用；用Northern杂交研究周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子P15和钙调神经磷酸酶CaN mRNA表达水平的增龄性变化，了解不同针刺穴区对其表达的影响。 得到如下主要结论： 1．选择2月龄SAMP8作10月龄SAMP8的实验对照组，筛选到差异表达基因234个，其中下调表达的基因有146个，59个基因能在GenBank中登陆；上调表达的基因有88个，87个基因能在GenBank中登陆。 2．选择10月龄SAMR1作10月龄SAMP8的实验对照组，筛选到差异表达基因有242个，其中下调表达的基因有173个，62个基因能在GenBank中登陆；上调表达的基因有69个，68个基因能在GenBank中登陆。 3．选择2月龄SAMP8和10月龄SAMR1同时作10月龄SAMP8的实验对照组，筛选到差异表达基因110个，其中下调表达的基因有79个，30个基因能在GenBank中登陆；上调表达的基因有31个，并全部能在GenBank中登陆。下调涉及突触囊泡释放、信号传导、细胞骨架、能量代谢等；上调涉及细胞周期，离子通道，蛋白质合成，炎症反应等病生理功能。 4．与主导衰老的P16属同一家族基因，P15 mRNA的表达上调使细胞周期调控异常，推测P15可能是导致老年性痴呆的重要因素；CaN基因表达下调，改变了蛋白磷酸化和去磷酸化的动态平衡，由此可能影响信号传导、基因转录等重要的细胞功能活动和加速NFT的形成，从而促进老年痴呆的发生发展。 5．进一步用Northern杂交研究SAMP10脑P15 mRNA的增龄性变化，发现其在6月龄开始表达上调。两针刺组均有下调8月龄SAMP10脑P15 mRNA表达的趋势，其中滋补肝肾组下调P15 mRNA表达的作用有优于醒脑组的趋势。针刺可能通过抑制P15 mRNA的表达，增强DNA损伤修复能力，减少细胞凋亡，延缓衰老速度。 6．用Northern杂交研究SAMP10脑CaN mRNA的增龄性变化，CaN mRNA在6月龄时表达水平最低。两针刺组均有上调8月龄SAMP10脑CaN mRNA表达的趋势。其中醒脑组上调CaN mRNA表达的作用有优于滋补肝肾组的趋势。针刺可能通过增强CaN mRNA的表达，改善了蛋白磷酸化-去磷酸化的平衡状态和水平，影响离子通道天津中医学院博士研究生毕业(学位)论文中文摘要开关的调控，调节基因转录水平，减少NHF的形成，稳定微管结构。不同针刺穴区对不同基因的调整作用不同。
李洪[5]2009年在《肝郁证模型大鼠海马差异基因表达谱的研究》文中指出一、研究背景辨证论治是中医学的精华和优势,“证”是辨证论治的依据,是疾病处于一定阶段病因、病位、病性和病势的综合,能体现患者的整体性特征。证本质的研究是中医学现代化研究的核心内容。肝郁证是中医肝病的一个基本证型,是许多常见临床证候的基础,广泛存在于临床各系统疾病中。自上世纪50年代以来,肝郁证本质的研究一直是中医研究领域的热点,已初步证实肝郁证具有现代病理生理学基础,并部分地阐释了其中医理论的科学性,取得了阶段性成果,认为和机体神经、内分泌、循环、消化、免疫等多系统密切相关。但是对肝郁证的评价还处于笼统、多指标、不确定状态,有待进一步深入研究,从系统而全面的角度来阐释肝郁证的实质。基因组学在整体上研究基因的功能,这与中医学的“整体观”概念十分相似。基因芯片是随着人类基因组研究的深入而迅速发展起来的一项重要的生物学技术,它的特点是高通量、快速、并行化采集生物信息。作为后基因组时代一项举足轻重的技术,基因芯片使生命科学与医学用全方位的整体新思维方式研究成为可能,因而广泛的应用于医学研究的各个领域。若借助基因芯片这种先进、快速的研究手段,可以尝试从基因水平探讨肝郁证的本质。可以设想,通过对同病异证和异病同证的基因表达谱差异比较中寻找证候的共同性和差异性建立一个“证候-基因表达谱”,揭示基因与证的内在联系,也会使中医辨证论治理论得到全面的检验和应用。二、研究方法目的:采用慢性束缚应激的方法复制与临床接近的、有效的大鼠肝郁证模型;利用基因芯片对肝郁证大鼠的海马组织中的差异表达基因进行分析比较,在动物模型上寻找肝郁证相关的基因,尝试从基因水平对肝郁证的微观辨证进行初步探讨,也为从临床疾病的角度对肝郁证相关基因的研究提供理论支持;比较逍遥散干预大鼠与模型大鼠之间的差异基因表达,一方面从基因转录水平探讨逍遥散对肝郁证的作用机理,另一方面以方测证,方证互参,说明肝郁证的本质。方法:在肝郁证理论指导下,复制慢性束缚应激肝郁证大鼠模型,并通过行为学实验和检测大鼠血清激素水平验证模型的可靠性;并用中药复方逍遥散干预造模动物,验证逍遥散对肝郁证大鼠的治疗作用;采用含有27000个已知基因的大鼠全基因组芯片检测大鼠海马内差异基因表达情况,比较模型大鼠与正常大鼠、逍遥散干预大鼠与模型大鼠的差异表达基因,利用生物分子功能注释系统(MAS)对与疾病相关的基因进行分析;用实时荧光定量PCR技术验证部分与疾病相关的差异表达基因结果的可靠性。1.慢性束缚应激肝郁证大鼠模型的复制情志异常是肝郁证的主要病因,不良生活事件所形成的心理应激则是情志病因的实质;肝郁证是对郁怒、抑郁、焦虑等负性情绪心理应激状态下,以高级神经中枢调节机制紊乱为前提,涉及多系统、多器官的病理改变。基于上述考虑,参照文献报道,从慢性应激的角度出发,将18只同周龄雄性Wistar大鼠随机分3组:肝郁证模型组、逍遥散组、正常对照组,每组各6只,模型组与逍遥散组大鼠单笼饲养,每日将大鼠置于束缚笼内,固定其身体与尾部,使之不能随意活动,每天6小时;逍遥散组大鼠在造模的同时,以逍遥散中药煎液10g/kg.d灌胃;正常对照组不予任何干涉,时间为3周。观察大鼠的一般状况,每周对各组大鼠进行一次液体消耗实验及摄食实验,造模开始与结束时分别对各组大鼠进行一次敞箱实验,并在造模结束后取大鼠血清,检测血清的CRH含量,以验证肝郁证模型的可靠性,并且论证逍遥散对肝郁证的治疗作用。2.利用基因芯片检测模型组与正常组大鼠海马的差异表达基因造模结束后处死所有大鼠,分离海马组织,提取海马总RNA,在检验总RNA的质量与数量合格后,总RNA反转录得到cDNA,体外转录合成生物素标记的cRNA,再与基因芯片进行杂交反应,这里我们选用北京博奥生物公司的含有27000个已知基因的晶芯~(?)大鼠全基因组表达谱芯片(27K Rat Genome Array);用LuxScan 10KA双通道激光扫描仪对基因芯片进行扫描,得到半定量杂交结果后,采用LuxScan 3.0图像分析软件对芯片图像进行分析,把图像信号转化为数字信号,筛选出模型组与正常组大鼠海马的差异表达基因。借助MAS系统,通过搜索NCBI基因组数据库,对检测到的差异表达基因进行查询和确认,获得相关基因的信息并进行生物学注释,分析与疾病相关的基因在肝郁证的发生中可能的机制。3.利用基因芯片检测逍遥散组与模型组大鼠海马的差异表达基因同样采用27K Rat Genome Array芯片筛选出逍遥散组与模型组大鼠海马的差异表达基因,借助MAS系统,通过搜索NCBI基因组数据库,对差异表达基因进行查询和确认,获得相关基因的信息并进行生物学注释,尝试初步探讨逍遥散对肝郁证在基因水平上的作用机理。4.实时荧光定量PCR方法验证部分差异表达基因提取各组大鼠海马的总RNA,反转录得到cDNA,采用SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR方法,检测已有的基因芯片结果中部分与疾病相关的基因在各组大鼠海马中的表达情况,用以验证基因芯片结果。结果:1.成功复制了慢性应激肝郁证大鼠模型。造模3周后,一般状况来看,模型组大鼠主要表现为倦怠少动、喜欢贴壁、叫声尖细、反应迟缓、饮食减少,伴有毛色晦暗发黄、大便颗粒松散甚至呈水样等等肝郁证的表现。液体消耗实验结果发现,模型组大鼠造模后的糖水偏好程度显着低于正常组大鼠(P＜0.01);摄食实验中模型组大鼠的摄食量亦较正常组大鼠有显着性下降(P＜0.05);畅箱实验测得的动物行为学评分来看,造模后模型组大鼠的水平运动得分和垂直运动得分明显低于同时期的正常组大鼠(P＜0.01);此外,模型组大鼠的血清CRH浓度显着高于正常组大鼠(P＜0.01)。说明慢性束缚应激确能造成大鼠的肝郁证,能有效的模拟临床中肝郁证兴趣丧失、快感缺乏等症状。2.大鼠海马样品的总RNA经检验质量合格,顺利进行后续实验。模型组与正常对照组大鼠海马的芯片检测结果为:共有48个差异表达基因,表达上调的基因有15个;表达下调的基因33个。搜索基因组数据库及用MAS系统进行分析,对与疾病相关的基因进行功能分析,结果发现,部分差异表达的基因可以阐释肝郁证模型以及临床病例的某些主要表现。大致分为3类:(1)与神经精神类疾病相关的基因:主要有脑源性神经营养因子(Bdnf)、色氨酸羟化酶1(Tph1)、糖原合成酶激酶-3(Gsk3b)等,它们的表达异常,说明肝郁证中存在神经内分泌系统的紊乱,神经递质的调节上的发挥失常及神经元受损等机制,可能是导致肝郁证患者情绪低落、兴趣丧失、运动迟缓、饮食减少等的原因,也在一定程度上解释了肝郁证与现代医学中抑郁症、焦虑症等疾病的密切联系;(2)与肿瘤相关的基因:中期因子(Mdk)、叶酸受体1(Folr1)、水通道蛋白1(Aqp1)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(Igfbp2)等,此结果提示肝郁证大鼠存在某些肿瘤的易感性,可能与临床上肝郁证患者气滞血瘀,日久成积而引起肿瘤发生有一定的相关,与我们前期肝郁证大鼠蛋白质组学研究结果类似;(3)其他疾病相关基因:如血管紧张素转化酶(Ace)、细胞内氯通道(Clic6)、X联内肽酶同源性的磷酸盐调节基因(Phex)等,这些基因的表达改变与肝郁证的关系有待进一步研究。3.逍遥散干预3周后,逍遥散组大鼠的倦怠少动、饮食减少等症状明显改善;液体消耗实验、摄食实验及畅箱实验结果发现,逍遥散组大鼠的糖水偏好程度、摄食量及行为学评分在第3周时与模型组相比,均有明显改善;与模型组大鼠比较,逍遥散组大鼠血清CRH浓度亦有升高趋势;逍遥散干预组与模型组大鼠海马的芯片检测结果为:共有22个差异表达基因,表达上调的基因有7个;表达下调的基因15个。其中与疾病关系密切的基因有:神经元钙传感器(Ncs-1)、阿片黑素促皮质激素原(Pomc)、色氨酸羟化酶1(Tph1)等,提示逍遥散对肝郁证的治疗作用可能与稳定细胞膜,防止钙超载,提高神经元抗损伤能力,双向调节HPA轴,神经内分泌功能等机制相关。另一方面从方证互参的角度也反证了肝郁证模型的可靠性。4.实时荧光定量PCR方法检测了Bdnf、Tph1、Mdk等3个基因在各组大鼠海马中的表达情况。结果发现,RNA质量完好,PCR反应扩增效果较好,PCR产物纯度较高,目的基因Bdnf、Tph1、Midkine在各组大鼠海马的表达比较与基因芯片检测结果基本一致,验证了芯片部分检测结果的可靠性。结论:1.本次研究采用慢性应激束缚的方法,成功的复制了大鼠的肝郁证模型,模型可靠。2.利用基因芯片检测出的模型组与正常组大鼠海马的差异表达基因中,部分基因的异常表达提示肝郁证可能与神经内分泌系统的紊乱,神经递质调节失常、神经元受损等机制密切相关,同时也提示肝郁证存在一定的肿瘤易感性。3.利用基因芯片检测出的逍遥组与模型组大鼠海马的的差异表达基因中,部分差异基因的表达提示逍遥散可能通过提高神经元对应激损伤的耐受性,调节神经内分泌功能等机制来发挥治疗肝郁证的作用。4.通过实时荧光定量PCR方法检测了部分与疾病相关基因在各组大鼠海马中的表达情况,与基因芯片的检测结果是基本吻合的,验证了部分基因芯片表达结果的可靠性。肝郁证大鼠模型海马差异表达基因的研究,为从基因水平探讨肝郁证实质研究的深入作了有益的尝试。
佚名[6]2004年在《国家自然科学基金委员会生命科学部2004年度资助自由申请科学基金项目一览表》文中研究说明项 目 名 称申请者姓名单 位 名 称1 微生物学学科 (104项)粘细菌的种属分子分类及菌株分子鉴别技术吴志红山东大学野生稻内生固氮菌系统发育及分子遗传研究谭志远华南农业大学中国鸡皮衣科地衣分类学研究赵遵田山东师范大学拟盘多毛孢属及邻近属分子系统学研究
杨红亚[7]2010年在《脾肾两虚证双生子脑瘫的生物学基础研究》文中研究说明目的①通过脑瘫双生子病证结合调查,分析脑瘫的高危因素,探讨中医脾虚、肾虚证候在脑瘫中的分布规律。②通过对脾肾两虚证脑瘫患儿的理化指标检测,分析细胞免疫、体液免疫、血清元素与脑瘫的关系,探讨中医脾肾两脏与机体免疫功能的关系。③基于基因表达谱技术筛选4对脾肾两虚证“脑瘫-正常”同卵双生子差异表达基因,从基因表达水平探讨脾肾两虚证脑瘫的分子机制。方法O宏观脑瘫的病证结合研究：利用脑瘫脾肾证候量表对43对脑瘫双生子进行病证结合调查研究,探讨脑瘫的病因及脾虚、肾虚证候分布特征。②理化指标检测：应用免疫浊度技术检测脑瘫组及正常组血清IgG、IgM、IgA、C3和C4含量,流式细胞术比较脑瘫组与正常组外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞百分比,原子吸收光谱法比较血清锌、铁、钙、镁及铜元素含量。③微观特征基因的芯片筛选：借助基因芯片技术,对筛选的4对脾肾两虚证“脑瘫-正常”双生子进行基因表达谱试验,利用GO、KEGG、FatiGO+等数据库筛选脾肾两虚证脑瘫特征基因表达谱。④芯片结果的RT-PCR验证：对基因芯片筛选到的部分差异表达基因进一步采用RT-PCR方法进行验证。结果①43对脑瘫双生子病证结合调查：脾肾两虚证脑瘫患儿的危险因素依次是低出生体重、缺氧窒息、早产、出生后烦躁少食等；79.59%的患儿调查到的危险因素为两种或者两种以上；证候调查结果显示多数患者以脾气虚证和肾精不足证为主导；同卵双生子具有病和证罹患的一致性,但存在着病情轻重程度的差异；筛选到4对“脑瘫-正常”双生子用于基因芯片试验。②51例脑瘫患者理化检测结果：脾肾两虚证脑瘫组外周血CD3+T细胞、CD8+T细胞的百分比显着低于正常对照组(P<0.01)；血清IgG含量显着低于对照组(P<0.05),IgM含量显着高于对照组(P<0.01),C3含量下降显着(P<0.01)；血清锌、铁、钙和铜元素含量均显着低于对照组(P<0.01),镁元素含量差异不显着(P>0.05)。③4对“脑瘫-正常”双生子基因表达谱结果：从4对双生子中分别筛选到2703、20、130、350个差异表达基因,GO、PATHWAY分析结果提示免疫基因的差异表达及免疫通路的异常为四对双生子的共同特征,其中细胞因子-细胞因子受体为4对双生子筛选到的差异表达基因共同注释到的通路。④15个差异表达基因的RT-PCR验证结果：应用RT-PCR对筛选的部分差异表达基因进行验证,发现FIGN基因在脾肾两虚证脑瘫组患者中的表达显着低于正常组(P<0.05),PTGER2基因在脑瘫组患者中表达显着高于正常组(P<0.05),其它13个基因差异表达不稳定。结论①脾气虚证和肾精不足证是脑瘫的基础证。②脑瘫的危险因素多样,绝大多数脑瘫患儿的高危因素在两种以上。③脾肾两虚证脑瘫患儿存在细胞免疫和体液免疫功能异常及血清元素锌、铜、钙、铁水平低下的状态。④脾肾两虚证脑瘫的发生涉及多个基因的异常表达,尤其是参与免疫的GO类别及免疫通路的相关基因,提示脑瘫脾肾两虚证的关键病机之一是免疫紊乱的遗传相关性。⑤应用RT-PCR对筛选的差异基因进行验证,初步论证了FIGN、PTGER2基因的异常表达与脾肾两虚证脑瘫的关系,为该病证的深入研究奠定了基础。
参考文献：
[1]. 针刺对快速老化小鼠SAMP10海马、皮层衰老相关基因表达谱影响的实验研究[D]. 丁晓蓉. 天津中医学院. 2003
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[3]. 针刺对应激性高血压前期大鼠心脏基因表达谱的影响[D]. 贾文睿. 北京中医药大学. 2017
[4]. 用基因表达谱芯片筛选老年痴呆异常表达基因及针刺对其主效基因的影响[D]. 樊小农. 天津中医学院. 2003
[5]. 肝郁证模型大鼠海马差异基因表达谱的研究[D]. 李洪. 南方医科大学. 2009
[6]. 国家自然科学基金委员会生命科学部2004年度资助自由申请科学基金项目一览表[J]. 佚名. 生命科学. 2004
[7]. 脾肾两虚证双生子脑瘫的生物学基础研究[D]. 杨红亚. 成都中医药大学. 2010
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