杨光[1]2001年在《烟草与TMV互作过程中的信号转导初探》文中认为系统获得抗性是植物针对多种入侵病原物而产生的常见抗性反应。许多实验结果已经阐述或验证了这一现象。然而，到目前为止，对系统获得抗性中的抗病信号转导途径仍不清楚。本课题以烟草与TMV的互作体系为基础，研究抗病信号转导途径中的信号分子和它们在信号转导途径的位置和作用。以不同抗性的烟草为研究材料，比较抗感品种上反应体系的差异。试验结果表明：烟草受TMV侵染后，SOD、POD、CAT、LOX活性均有所增加，不过在抗感品种中增加的速度和时间有所差异；O_2~-在抗病品种中形成两个峰，但在感病品种中出现第一个峰值后即开始迅速下降至接种前水平；H_2O_2在抗病品种Xanthi-NN处理叶中的平均水平明显高于感病品种Xanthi-nn和K346，并且保持了一定时间。表明超氧阴离子（O_2~-）和过氧化氢（H_2O_2）参与了抗病信号的转导，而且这些信号分子必须积累到一定强度，并在某一时段内保持相对较高水平，才能使信号向下转导； 用0.01％的水杨酸（SA）喷雾处理抗、感品种的中部叶片后2d接种TMV，以观察SA对植株体内活性氧水平和相关酶系的影响。结果表明：SA对抗、感品种均具有明显的诱导抗性，但对抗性品种的影响没有对感病品种的影响显着，感病品种经SA处理后，发病程度比对照降低了45％。SA处理Xanthi-nn后，H_2O_2和SOD均比对照有所上升，而O_2~-和CAT均比对照低；K346经SA处理后，O_2~-形成峰值的时间和水平都有所降低（比对照降低了38．5％＼ 却促进了HZOZ的提高。PR蛋白电泳结果显示，受SA诱导后，XanthiNN烟草处理叶中出现叁种新的蛋白条带，非处理叶中96h以后也开始出现新的蛋白条带；而K346中尽管没有出现新的蛋白条带，但蛋白浓度有所增强。 用 0，lmM的百草枯和 0．ZmM的甘露醇处理抗病品种 Xanthi－NN和感病品种K346以改变植物体内的活性氧水平，id后再接种TMV，研究其对整个信号转导途径的影响。结果表明：外源施加的物质对处理叶的影响比对非处理叶的影响大，处理叶中的OZ”·、HZOZ水平的变化幅度远远大于非处理叶。百草枯处理后，XanthiNN植株中活性氧水平迅速增加，并一直保持较高水平；百草枯处理对SOD、CAT和脂质过氧化也有不同程度的促进作用，而SA含量仅仅略有上升；K346植株经过处理后活性氧水平有所提高，但没有造成明显的过敏反应；甘露醇处理后，抑制了植株体内的活性氧积累，但Xanthi－NN在接种TMV后，仍表现过敏反应；而K346出现症状比CK早，且发病程度比CK重。
王凤德[2]2009年在《牛蒡低聚果糖诱导植物抗病的分子机制研究》文中进行了进一步梳理作物产量受到多种因素的影响,其中病害是造成作物减产的一个重要因素。目前,人们对植物病害的防治主要依赖化学合成农药。但化学合成农药的滥用对环境和农产品安全造成了严重的影响。因此,筛选、研制对人畜安全、环境友好的生物农药已成为人们关注的热点。当遭受病原体侵染时,植物自身可产生多种抗性响应,包括活性氧爆发、植保素合成、抗病相关蛋白基因表达等。这种抗性响应同样可被一类称为激发子(elicitor)的物质所诱导。其中寡糖分子作为一种激发子可激发多种抗性响应。牛蒡低聚果糖(BFO)是本课题组从牛蒡根中分离得到的一种聚合度为13的果糖低聚糖。前期的研究表明,该糖可诱导植物提高对多种病害的抗性。然而,对BFO诱导提高植物系统抗性的分子机制仍不清楚。本文利用分子生物学以及生物化学的手段对BFO诱导提高植物抗性的分子机制进行了系统的研究,以期为BFO作为抗病激发子的应用提供科学依据。此外,本文还以烟草为植物材料,研究了不同叶龄叶片对烟草花叶病毒(TMV)和BFO的抗性响应,以期为研究植物抗TMV机制提供理论依据。主要结果如下:1.壳寡糖(CO)作为一种激发子已经被广泛研究,结果表明其可诱导提高对多种植物病害的抗性。本研究以CO为阳性对照,以蒸馏水(DW)为阴性对照研究了BFO对采后番茄抗病性的影响及其影响机制。结果表明BFO具有与CO类似的激发子功能,可有效提高番茄果实对自然病害的抗性以及对接种灰霉病的抗性。在处理后5天时,自然感病率和感病指数分别是DW处理的53.9%和45.2%,并且在处理后的15天内其自然感病率和感病指数都小于DW处理。接种灰霉病4天时BFO处理番茄的感病率和感病指数分别是DW处理的62.4%和48.1%。对其抗病机制进行初步的研究表明,BFO可快速诱导酸性PR蛋白(PR-1a、PR-2a、PR-3a)、碱性PR蛋白(PR-2b、PR-3b)以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的表达。另外BFO还可诱导过氧化物酶(POD)活性提高以及酚类物质累积,但BFO对多酚氧化酶(PPO)活性无显着影响。本研究还发现BFO和CO都不能诱导POD和PPO出现新的同工酶谱带,但BFO可诱导提高POD和PPO同工酶酶谱的强度,而CO仅诱导提高POD同工酶酶谱的强度,对PPO同工酶酶谱无明显影响。这些结果表明BFO可有效提高采后番茄的抗病性,其机制可能与其诱导抗病相关基因的表达、提高POD的活性以及诱导酚类物质在体内的累积有关。2.以烟草为植物材料,利用分子生物学以及生物化学的方法研究了BFO对烟草TMV抗性的影响及其影响机制。结果表明,BFO处理可显着抑制TMV在烟草中的增殖,接种TMV 24h时DW处理叶片的TMV含量是BFO处理的7.0倍。此外,接种TMV 5天时DW处理叶片已出现明显的花斑症状,而BFO处理叶片仍表现正常,从而表明BFO处理增强了烟草对TMV的抗性。对其抗病机制进行初步的研究表明,BFO不仅可快速诱导酸性PR蛋白(包括PR-1a、PR-2、PR-3、PR-4以及PR-5)基因,还可诱导碱性PR-1蛋白基因以及抗病相关酶PAL和倍半萜环化酶(EAS)基因在烟草局部叶和系统叶中转录表达。H_2O_2和水杨酸(SA)是植物体内重要的信号分子,参与调控系统获得抗性(SAR)的发生,在本研究中BFO同样可快速诱导H_2O_2在烟草体内累积以及诱导SA和水杨酸葡萄糖苷(SAG)在烟草局部叶和系统叶中的生物合成。由于PR基因的表达常被作为诱导SAR发生的标记。因此,综合以上结果可以看出BFO提高烟草对TMV抗性的机制可能在于BFO通过H_2O_2以及SA介导了SAR的发生。3.以烟草为植物材料,研究了不同叶龄叶片对TMV的抗性反应。结果表明,接种TMV48h时,老叶中TMV含量最高,大约是成熟叶和幼叶的8,1倍和35.1倍,从而说明幼叶对TMV的抗性最强,其次为成熟叶,老叶的抗性最弱。但是通过检测抗病相关蛋白(PR-1a、PR-2、PR-3、PR-4、PR-5、PAL)基因表达对TMV的响应发现,上述抗病相关蛋白基因在老叶中表达量最高,幼叶中表达量最弱。此外,烟草不同叶龄叶片经BFO或者DW处理后再接种TMV,发现BFO处理可以抑制TMV在不同叶龄烟草叶片中的增殖,并且接种TMV 48h时DW处理幼叶、成熟叶和老叶的TMV含量分别是BFO处理的1.4倍、1.9倍和11.0倍,即BFO处理对老叶的抑制效果最好,幼叶的抑制效果最弱。但接种TMV后上述抗病相关蛋白基因在BFO处理烟草叶片中的表达量低于DW处理叶片,从而都表现出TMV含量越高抗病相关蛋白表达量越高的现象。另外,我们的研究发现,BFO与TMV对烟草具有不同的抗性诱导效应,即BFO处理后上述抗病相关蛋白基因在幼叶中的表达量最高,在老叶中的表达量最低;而TMV处理后上述抗病相关蛋白基因在老叶中的表达量最高,在幼叶中的表达量最低。因此,综合以上结果可以看出,不同叶龄叶片对TMV具有不同的抗性,即幼叶的TMV抗性最强,老叶的抗性最弱;BFO处理可以抑制不同叶龄烟草叶片中TMV的增殖,但BFO对老叶的TMV抑制效果最好,幼叶最弱,并且BFO对烟草的诱导效应不同于TMV对烟草的诱导效应。
秦利军[3]2015年在《烟草CN基因调控植株抗TMV机理研究》文中研究说明烟草普通花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)是Togaviridae科Tobamovirus组的单链RNA(signal strand RNA,ssRNA)病毒,可侵染包括茄科植物在内的350多种植物。烟草是茄科植物中具有特殊地位的经济作物,敏感烟草感染TMV后可引起30-50%损失,严重的甚至绝收。据统计,全世界每年仅因TMV危害造成的损失就高达1亿美元,而TMV在我国吉林、河南、山东、贵州、云南等省的烟草种植区均有发生,田间发病率一般在5-20%。贵州作为全国的第二大烤烟种植大省,广泛种植有南江3号、贵烟4号、云烟87、K326、云烟97等重要的烤烟品种。其中,仅K326品种在2012年的种植面积就近1.22万公顷,占贵州烤烟总种植面积的33.8%,但该品种易感TMV,可造成极大的损失,据统计贵州每年因TMV造成的损失就高达0.32亿元。利用TMV抗性基因(resistance gene)进行抗性育种是最为经济、安全、长效的方法之一。本研究以黄花烟(N.rustica L.)来源的抗性CN作为抗源,构建了3个含CN基因的植物表达载体pSH-CN,pGM626-DL-SAF-UCn和pSH737-U4Cn-RcHak并分别对K326进行遗传转化,对筛选获得的转基因植株进行人工接种TMV,分析转基因植株应答TMV侵染后的表现和探讨CN基因介导的抗病机理。主要获得如下结果:1.转CN基因烟草接种TMV后引起了接种叶片产生超敏反应(hypersensitive,HR),降低了脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量,延缓了由于TMV繁殖扩散所引起的花叶斑形成和叶绿素含量下降,表明CN基因的导入可诱导机体产生HR,在接种叶片形成坏死斑(necrosis spots),从而限制病毒的扩散,延缓病毒引起的植株系统感染;同时,转基因植株应答TMV感染时,可显着降低MDA含量,更好地保护植物细胞免遭质膜过氧化产物的损害,提高植株细胞对病原菌的防御能力;另外,CN基因的导入引起了植株产生了系统超敏反应(systemic hypersensitive,SHR),SHR的发生亦可提高植株对其它入侵病原菌的系统抗性;2.接种TMV后,转基因植株中的抗氧化酶(antioxidant enzymes,AOEs),包括超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod),过氧化物酶(peroxidase,pod)和过氧化酶(catalase)的酶活性均显着增加,说明转基因植株在防卫tmv侵染时可通过显着提高aoes活性来实现自身对入侵病毒的抵抗力。aoes活性高低一般认为与机体内活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)的含量正相关,植物体受到生物或非生物胁迫时通常可引起其体内ros的迅速增加,而高ros含量会严重导致细胞受损。因此,转基因植株接种tmv后一方面通过提高aoes活性使植物细胞免遭ros的氧化损伤,保护其完整性,提高植物组织对病原菌的防卫能力,一方面高的aoes活性对于调节以抗性基因介导的抗病应答通路启动也十分重要;3.转基因植株在接种tmv后引起了植物体内过氧化氢(hydrogenperoxide)和水杨酸(salicylicacid,sa)含量的显着增加,两者在抗性基因(resistancegene,r)介导的抗病应答信号通路中作为信号分子调控或激活下游抗病基因的表达。h2o2的积累与aoes活性增加有关,病原菌的侵入后导致植物体o·2-迅速增加,sod可催化o·2-形成h2o2,进而减小由于o·2-的过剩积累所引起的组织氧化损伤;h2o2可作为pod和cat的底物被进一步代谢,前者主要利用h2o2氧化多种底物,如酚类,乙醇和甲醛等,起到毒害物质(h2o2)脱毒的作用;后者可直接将催化h2o2形成h2o。tmv接种初期,cn基因显着提高了转基因植株中aoes的活性;接种后期,转cn基因植株又显着降低了cat酶活性,cat酶活性的降低引起了h2o2含量增,后者在植物产生hr和系统获得抗性(systemicacquiredresistance,sar)中起到重要作用。tmv接种引起转基因植株sa含量的显着增加,而sa又可作为内源信号分子调控植株的抗病应答机制启动,已有研究表明sa可结合于病程相关蛋白基因pr-1a启动子序列的类as-1调控区,从而启动该基因表达提高植株对病原菌的防御能力;4.tmv接种后,cn基因诱导了抗病应答信号通路中蛋白组分,如cn(n-likeprotein)、rar1(requiredformla12resistance)、stg1(suppressorofg2alleleofskp1)、mek1(mitogen-activatedproteinkinasekinase)、ntf6(mitogen-activatedproteinkinase)、pr-1a(pathogenesis-relatedproteins1a),和转录因子wrky1表达量的显着上调。一般认为,病原菌入侵后其无毒基因(avirulence,avr)编码产物可与植物体内r基因编码的产物以―r-avr‖的方式形成复合物,进而调控下游抗病相关基因的表达的转录激活。转基因植株接种tmv后,引起了cn基因表达量的显着上调,说明tmv入侵诱导tmv-avr-cn复合蛋白的形成,之后蛋白组分RAR1和STG1的表达量也显着增加,表明Avr-CN复合蛋白可进一步与STG1和RAR1结合形成原初―病原菌-宿主‖复合蛋白调控下游抗病基因的表达。在STG1和RAR1表达量上调之后,其他蛋白组分NTF6、MEK1和转录因子的表达量也随之增加,说明该复合蛋白在激酶磷酸化作用经由促分裂原活化蛋白激酶级联途径信号通路(mitogen-activated protein kinase cascades,MAPK cascades)调控下游PRs的表达,从而实现转基因植株对TMV的控制;5.本研究通过植物表达载体pGM626-DL-SAF-UCn对烟草进行遗传转化,分析外源基因,包括筛选报告基因Bar::GUS、重组酶(recombinase)基因FLP和抗病基因CN在转基因烟草植株中的清除情况。随着转基因烟草叶片逐渐衰老成熟,烟叶对除草剂草铵膦(phosphinothricin,PPT)敏感性逐渐增加,对GUS(β-glucuronidase)染色活性逐渐下降,说明转基因烟草植株中―Gene-deletor system‖实现了包括Bar::GUS,FLP和CN在内的所有外源基因的清除。―Gene-deletor‖技术的应用为创制培育无选择标记、抗病烟草新种质提供理论基础;6.利用pSH737-U4Cn-RcHak对烟草K326进行遗传转化不仅通过CN基因介导的抗病应答机制提高转基因烟草植株对TMV的抗性,而且烟草高亲和钾离子转运蛋白(high-affinity potassium transport,HAK)的共同导入增加了转基因植株的叶片厚度,减小了接种叶抗病斑的大小。说明CN和HAK的协同表达不仅提高了转基因植株对TMV的内部防御(CN介导的抗病调控),同时也增强植株对TMV的体外防御(叶片加厚)。同时,转基因烟草中HAK的超量表达还同时提高了植株对盐胁迫(salt stress)的耐受力,而非生物胁迫对会显着降低植株应对生物胁迫的能力,超量表达HAK提高了转基因烟草植株的钾素营养富集能力及增强其光合作用,同时还可增加烟草植株对盐胁迫的抵抗力。以上研究表明,通过分别含2个质粒的2种工程农杆菌介导的共转化法对烟草进行遗传转化可筛选获得无选择标记、富钾能力强且耐盐的抗病烟草新种质提供参考。
张国强[4]2016年在《喀纳斯链霉菌ZX01抗TMV活性物质分离及全局调控基因nsdA阻断研究》文中研究说明植物病毒病发生普遍、防治困难,严重危害着农业生产,并在世界范围内造成了巨大经济损失。微生物是抗植物病毒剂研发的重要资源库,从微生物代谢物中分离与筛选抗植物病毒活性物质一直是国内外学者们的研究热点。喀纳斯链霉菌ZX01 (Streptomyces kanasensis ZXO1,以下简称链霉菌ZX01)是西北农林科技大学无公害农药研究服务中心从新疆喀纳斯湖分离得到的一株放线菌,经过前期试验表明链霉菌ZX01菌株代谢物具有较好的抗植物病毒活性。基于此,本论文以链霉菌ZX01为供试菌株,主要从抗烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)活性成分分离与鉴定、基因组测序与分析、接合转移体系构建、nsdA阻断突变株构建等方面进行研究,得出以下主要研究结果：(1)采用萃取、吸附层析、离子交换层析等分离技术手段,并结合活性追踪,从链霉菌ZX01代谢物中分离得到了一种具有抗TMV活性的糖蛋白GP-1。该糖蛋白的分子量为8479 Da,多糖和蛋白含量分别为40.23%和54.36%；蛋白部分由15种氨基酸组成,其中酸性氨基酸Asp和Glu含量较高(15.15%和12.63%),碱性氨基酸Arg和Lys含量较低(0.62%和4.88%)；多糖部分由6种单糖组成,分别是甘露糖,木糖,阿拉伯糖、葡萄糖、氨基葡萄糖和半乳糖(0.38：0.14：0.40：2.62：0.10：1.00)；GP-1中同时存在N-糖苷键和O-糖苷键；其二级结构包含20.10%p-折迭,21.70%p-转角和58.30%无规则卷曲,无α-螺旋存在。100℃处理1h对GP-1的二级结构影响不大,但对GP-1的抗TMV活性有较大影响,60℃以下活性稳定,80℃以上活性逐渐丧失。经过质谱分析,GP-1是一个结构较为新颖的糖蛋白。利用超滤、亲和层析及HPLC技术建立了糖蛋白GP-1的快速纯化与检测方法。(2)采用活体和离体方法测定了糖蛋白GP-1的抗TMV活性,结果显示GP-1对TMV具有较强的保护效果,能够较好地阻止TMV侵染寄主植物。钝化试验与电镜试验共同表明GP-1对TMV粒子具有破坏效果,使得TMV丧失侵染能力。另外,GP-1还能抑制TMV外壳蛋白在寄主植物体内的积累,从而减轻发病症状。诱导抗性试验结果证明GP-1能够诱导寄主抗病性,并且随着诱导时间的延长,诱导抗病性先增强后减弱。GP-1处理后,烟草体内的防御酶SOD、PPO和PAL活性均急剧升高,而体内的MDA含量整体下降。(3)利用高通量测序技术对链霉菌ZX01基因组进行测序,最终得到ZX01基因组草图序列总长7,026,279 bp,分布于225 contigs中,G+C含量为73.88%。基因预测得到6245个编码基因,其中4176个蛋白具有明确的生物学功能,1997个蛋白与KEGG库中的蛋白同源,3996个蛋白具有COG分类。ZX01基因组中含有7套核糖体RNA操作元和65个tRNA基因。(4)利用antiSMASH v3.0对链霉菌ZX01基因组中次级代谢物生物合成基因簇进行预测,结果发现了21条次级代谢物的生物合成基因簇,分布于19个contigs中。这些基因簇操纵萜类、聚酮类、磷酸酯类、细菌素类等物质的生物合成。聚酮合酶(PKS)或非核糖体肽酶(NRPS)参与的基因簇有Cluster1、9、16、18和20,这5个基因簇与已知的抗生素合成基因簇相似性较低。半定量PCR结果显示,在一般培养条件下Cluster1、9和20能够正常表达、Cluster18不表达、Cluster16部分表达；经过γ-丁内酯诱导后Cluster 1、9、16、18和20均能表达,其中Cluster9和16超量表达。另外,还对糖基化相关基因和全局调控基因进行了预测,找到了多种糖基转移酶基因和全局调控因子。(5)对接合转移体系中的多种条件进行探索与优化,得了适合链霉菌ZX01遗传操作的接合转移最佳条件：孢子50℃热激10 min,然后37℃孵育2-3 h,供体和受体的比例为10：1,在含有10～30 mM MgCl2的高氏一号培养基平板进行接合转移,培养16～18h后覆盖抗生素,此时的转化效率最高。(6)利用Overlap PCR技术构建了基因重组载体质粒pRV5455 (pKC1139::nsdA UD::KanR),结合使用大肠杆菌ET12567 (pUZ8002),成功阻断了链霉菌ZX01中的全局调控基因nsdA,获得了nsdA缺失的ZX01突变株(ZX01△nsdA)。nsdA缺失不仅会影响链霉菌ZX01菌落形态,提高孢子和菌丝生长量,还能提高糖蛋白GP-1的产量。综上所述,链霉菌ZX01具有较强的天然产物合成能力,在植物病害防控方面具有广泛的应用前景。基因组的测序和遗传转化体系的建立,为该菌株的分子遗传、代谢调控和工程菌构建研究提供了丰富的数据资料,更为工程菌的构建以其在农作物病虫害防控方面的实际应用奠定了较为坚实的基础。
张微[5]2010年在《PeaT1诱导烟草系统获得抗病性及其作用机理的研究》文中进行了进一步梳理PeaT1是作者实验室从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中分离出的一种蛋白类激发子。前期研究证明,原核表达的PeaT1具有诱导植物提高抗病性的功能,为了探讨其作用机理,本文以烟草和TMV为研究系统,研究了PeaT1诱导烟草对烟草花叶病毒(TMV)的系统抗性,测定了烟草抗病防御酶活性以及防御物质的相对含量;用实时荧光定量PCR和RT-PCR技术研究了PeaT1诱导烟草后对TMV病毒粒子增殖的影响、PeaT1对TMV的体外钝化作用以及水杨酸信号传导途径中相关基因转录表达的变化,该研究丰富了蛋白激发子与植物互作理论,为进一步阐明PeaT1诱导植物抗病的作用机制提供了理论依据。1.获得了高效原核表达的PeaT1,纯化蛋白PeaT1可以诱导烟草对TMV侵染产生系统获得抗病性,表现为病毒侵染引起的系统症状减轻,与未诱导的植株比较,显症期推迟6 h左右,系统枯斑抑制率可达54.05%,枯斑大小抑制率可达31.3%。2.研究表明PeaT1诱导烟草产生的防卫反应对TMV病毒复制有抑制作用,但对TMV的体外钝化作用并不明显。PeaT1在诱导系统烟5 d后接种TMV,接种5 d后用半叶枯斑法检测枯斑叁生烟(Nicotiana tabacum cv. Samsun-NN)叶片的病毒粒子浓度仅为清水对照的65.87%;实时荧光定量PCR法检测证明,诱导处理的烟草体内TMV-CP基因的蓄积量抑制率可达75.4%,这从另一个角度对半叶枯斑法的测定结果进行了验证;体外钝化试验研究表明PeaT1对TMV无明显的体外钝化作用。3. PeaT1诱导烟草后,木质素积累量增加,防御酶活性增强,系统获得抗性标记基因的转录表达增强。木质素含量在PeaT1处理枯斑叁生烟幼苗5 d后开始明显升高并在6 d时达到峰值,是对照的4倍;多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)酶也均比对照增强,分别比对照提高了267.2 %和77.96 %。PR1a、PR1b基因转录增强且具有时序性转录的特点。4、水杨酸信号传导途径参与了PeaT1诱导烟草产生的系统获得抗病性。实时荧光定量PCR技术检测发现,PeaT1诱导烟草叶片后,系统获得抗病性标志基因PR1a上调23.71倍、PR1b上调19.95倍,水杨酸信号传导途径关键基因NPR1上调9.875倍,水杨酸合成关键酶基因PAL上调8.255倍,而乙烯茉莉酸途径标志基因PDF1.2转录水平并未提高;叶片内水杨酸含量提高,24 h后较对照提高3倍。5. PeaT1不能诱导转NahG基因的烟草提高抗病性,系统获得抗病性的标志基因也没有转录上调。进一步证明,PeaT1通过启动烟草的水杨酸信号传导途径,使烟草产生了抗病防卫反应。
刘孟洁[6]2016年在《稻瘟菌蛋白激发子MoHrip2结构与功能及互作蛋白研究》文中认为在长期的进化中,植物形成了一套有效的免疫系统应对逆境环境。植物免疫是基于对环境中诱导子的识别,蛋白质激发子是最主要的诱导子之一,已成为植物免疫领域的一个研究热点。蛋白质激发子MoHrip2是从稻瘟菌中分离获得的一种外分泌蛋白,能够诱导烟草免疫系统的激活,提高水稻对白叶枯病和稻瘟病的抗性。然而,MoHrip2作为激发子的作用机理尚不清楚。本研究从蛋白质结构、结构与功能的关系、互作蛋白的筛选与验证以及生物学功能等方面对MoHrip2进行研究,获得了以下研究成果:1、解析获得MoHrip2的叁维结构通过原核表达系统获得了MoHrip2蛋白以及掺入硒原子的蛋白衍生物,对蛋白质结晶条件进行筛选并优化,最终获得MoHrip2蛋白母体及衍生物的高质量单晶;利用X-射线衍射技术获得了MoHrip2蛋白母体及衍生物的衍射数据,分辨率分别可达2?和1.8?;通过硒原子产生的反常散射数据,确定了MoHrip2蛋白晶体的相位,每个不对称单元含有两个单体;利用COOT软件进行模型搭建和精细修改,解析获得了MoHrip2的叁维结构,每个单体形成一个β-桶状结构,包括11个β-折迭片和一个很短的α-螺旋,分子内形成3对二硫键;通过DALI软件进行结构比对,发现MoHrip2与TL-XI蛋白在结构上具有很高的相似度。2、确定了MoHrip2的功能域基于二级结构,对MoHrip2蛋白进行截短并利用原核表达系统表达和纯化,获得了8个截短突变体;对各截短突变体进行诱导烟草HR和抗病性分析,确定位于中间部位的第76-89位共14个氨基酸残基组成的短肽段,是MoHrip2发挥激发子活性的功能域。3、获得MoHrip2在拟南芥中的互作蛋白Mo2BP1以MoHrip2为诱饵蛋白,通过酵母双杂交技术筛选拟南芥cDNA文库,获得了4个候选互作蛋白;通过双分子荧光互补实验进行体内验证,其中一个蛋白能够在烟草细胞中与MoHrip2互作,命名为Mo2BP1;Mo2BP1为一个类奇异果甜-病程相关蛋白,在植物体内参与响应外源刺激;对Mo2BP1进行适应大肠杆菌表达的密码子优化,并重组表达、纯化获得GST-Mo2BP1融合蛋白;通过GST pull-down实验验证两个蛋白在体外能够相互作用。4、Mo2BP1缺失影响MoHrip2的功能在烟草叶片细胞中瞬时表达Mo2BP1-GFP融合蛋白,使用共聚焦激光扫描显微镜观察荧光,确定Mo2BP1在烟草细胞中定位于细胞膜上;购买获得Mo2BP1缺失突变杂合拟南芥,通过培育、筛选获得其纯合突变体;通过分析MoHrip2在野生型和突变体拟南芥中诱导HR和抗病性的不同效果,确定Mo2BP1在MoHrip2诱导拟南芥产生HR和提高抗病性中发挥重要作用。5、MoHrip2在拟南芥中过表达提高抗病性通过农杆菌介导法转化拟南芥,获得MoHrip2稳定遗传表达的转基因植株;分析转基因拟南芥对灰葡萄孢菌的抗性,表明MoHrip2过表达能够提高拟南芥的抗病性。
董娜[7]2008年在《病原诱导的小麦ERF、MYB转录因子基因TaPIEP1和TaPIMP1的分离、特性及功能分析》文中研究说明近年来,小麦纹枯病、赤霉病等病害对我国小麦生产的危害日益严重。小麦纹枯病、赤霉病抗性遗传基础研究薄弱,常规育种徘徊不前,其抗病反应机制亟待研究。本文以在植物防卫反应中起重要调控作用的ERF、MYB转录因子为研究切入点,采用2步法策略(首先鉴定受病原诱导的早期反应基因,然后分析其功能),对病原诱导的2个新的小麦ERF、MYB转录因子编码基因进行了全长序列分离和较系统的研究,旨在为揭示小麦抗纹枯病、赤霉病反应机制,开辟小麦抗纹枯病、赤霉病育种新途径奠定理论和材料基础。本论文取得以下结果:1.分离到2个病原诱导的小麦ERF、MYB转录因子编码基因TaPIEP1和TaPIMP1的全长序列。(1)采用同源克隆策略及RT-PCR和RACE技术,从小麦赤霉菌诱导的抗病小麦品系苏麦3号中,分离到1个小麦ERF转录因子编码基因TaPIEP1全长cDNA序列。源于苏麦3号和中国春的TaPIEP1基因组DNA序列和cDNA序列分析表明,该基因无内含子,编码由280个氨基酸残基组成的ERF转录因子TaPIEP1。TaPIEP1具有AP2/ERF DNA结合域、酸性转录激活域和核定位位点等ERF转录因子典型结构特征。TaPIEP1与其它ERF蛋白的全长序列一致性较低,与OsERF1的一致性最高,仅达36.46%,是植物ERF转录因子家族的一个新成员,属于该转录因子家族的B-3c亚群或IX亚群。(2)采用同源克隆策略及RT-PCR和RACE技术,从小麦赤霉菌诱导的抗病小麦品种苏麦3号中,分离到1个MYB转录因子编码基因TaPIMP1全长序列,编码由323个氨基酸残基组成的小麦MYB转录因子TaPIMP1。序列分析表明,TaPIMP1基因中具有一个内含子,长度为260bp,位于该基因编码区的第233个核苷酸(G)与第234个核苷酸(C)之间。序列比对分析表明,TaPIMP1是一个R2R3 MYB转录因子,与其它MYB蛋白的全长序列一致性较低,即使与一致性最高的OsJAMYB,仅为43.69%,是植物MYB转录因子家族的一个新成员。进化树分析表明:TaPIMP1与水稻OsJAMYB和拟南芥AtMYB108的关系比较密切,序列一致性分别为43.69%和40.11%,而与小麦中的其它MYB蛋白关系较远,序列一致性仅17.32%～28.48%。2.明确了TaPIEP1基因的表达特性。Q-RT-PCR实验结果表明,TaPIEP1在小麦中的转录表达受小麦纹枯病菌、赤霉病菌和白粉病菌诱导,其中,在抗病小麦品种中的诱导表达比在感病小麦品种中的迅速、强烈,而且对小麦纹枯病菌和赤霉病菌的响应比对白粉病菌的响应明显迅速。推测TaPIEP1可能主要参与对小麦纹枯病菌和赤霉病菌的防卫反应。TaPIEP1在小麦中的诱导表达也受到防卫相关植物激素乙烯(ET)、甲基茉莉酸(MeJA)和水杨酸(SA)诱导,其中,对ET和MeJA的响应比对SA的响应迅速,而且证明ET处理可以加速和增强TaPIEP1对赤霉病菌侵染的响应。推测TaPIEP1可能主要通过ET/JA途径参与对纹枯病菌和赤霉病菌的早期防卫反应,也通过SA途径参与对白粉病菌的防卫反应。3.初步明确了TaPIMP1基因的表达特性。半定量RT-PCR实验结果表明,TaPIMP1基因在小麦中能够被小麦纹枯病菌、赤霉病菌,以及ET和MeJA诱导,初步推测TaPIMP1通过ET/JA的信号传导途径参与小麦对纹枯病和赤霉病的防御反应。4.通过分子、生化分析证明TaPIEP1是能定位在细胞核、与GCC box结合的、激活型的小麦ERF转录因子。亚细胞定位结果表明,TaPIEP1-GFP融合蛋白集中分布在细胞核中,而对照GFP在细胞核和细胞质中均有分布,证明了TaPIEP1具有核定位的特性;凝胶阻滞结果表明,TaPIEP1不与DRE box顺式元件结合,仅与GCC box顺式元件特异性结合,且GCCGCC序列是GCC box的核心序列;酵母单杂交结果证明,TaPIEP1能够在酵母体内与GCC box结合,激活报告基因LacZ的表达。预测的转录激活域缺失后,TaPIEP1的转录激活活性降低大半,表明该预测的转录激活域确实是一个重要的转录激活域,但TaPIEP1中可能还存在另外一个转录激活区。5.初步明确了TaPIEP1和TaPIMP1基因的一些抗病功能。通过基因枪法将TaPIEP1转入推广小麦品种扬麦12号中,对转基因小麦T0、T1代植株进行PCR检测和小麦纹枯病抗性鉴定。结果表明,与未转基因小麦受体(扬麦12号,病情指数为3~4级)相比,转TaPIEP1基因阳性的小麦植株对纹枯病的抗性显着提高(病情指数为0级),说明转TaPIEP1基因能增强小麦对纹枯病的抗性,该基因在小麦抗纹枯病反应中起正向调控作用。通过农杆菌介导法将TaPIMP1转入烟草中,对转基因烟草T0代植株进行PCR检测和烟草青枯病抗性鉴定。结果表明,一些转TaPIMP1基因阳性烟草植株提高了对青枯病的抗性,说明TaPIMP1以正向调控方式参与植物防卫反应。
项争, 蔡兼, 谌殷蕾, 钮俊, 刘雪萍[8]2014年在《毛白杨抗病相关转录因子基因PtWRKY1的表达特性分析》文中研究说明WRKY转录因子作为植物特有的一类重要转录调控因子,广泛参与植物对生物和非生物胁迫的应答反应及形态发育和组织衰老等,已引起人们的关注。本文以前期克隆得到的毛白杨WRKY转录因子基因(命名为PtWRKY1)为研究对象,开展其基因枪介导洋葱表皮细胞瞬时表达、外源信号分子(水杨酸SA,茉莉酸MeJA,脱落酸ABA)诱导表达、转PtWRKY1基因烟草植株的烟草花叶病毒(TMV)接种实验以及抗病相关基因表达的实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析等研究。结果表明,PtWRKY1基因编码蛋白定位于细胞核,SA、ABA及MeJA处理均可诱导PtWRKY1基因表达,但不同诱导因子对PtWRKY1表达量的影响存在一定差异;同时,TMV侵染实验发现外源PtWRKY1表达能增强转基因烟草抗TMV能力,qRT-PCR分析表明PtWRKY1基因及膜保护性酶(POD,SOD,CAT)基因均受TMV诱导而增强表达。本文研究结果可为后续开展毛白杨转录因子PtWRKY1的功能鉴定及应用奠定基础。
宋东辉[9]2004年在《水稻抗病性相关的蛋白激酶基因OsBIMK2和OsBISERK1的克隆鉴定与功能分析》文中提出植物在与病原物的协同进化过程中，逐渐形成了一系列复杂高效的保护机制来抵御病原物的侵染。植物中抗病基因所决定的抗病性是一种高水平的品种对病原菌小种的专化抗性。同时，植物还形成了一套适应性更广的可诱导的抗病机制。由于植物可诱导抗病性是一种非特异的广谱抗病性形式，因而倍受关注。在我们实验室的前期研究中，运用抑制性差减杂交法构建了水稻诱导抗病性相关差别表达cDNA文库，分离鉴定了200多个在诱导抗病性中差别表达的cDNA。其中的2个克隆分别含有可能编码水稻MAPK(mitogen-activated protein kinases)和SERK(somatic embryogenesis receptor kinase)蛋白激酶的基因片段。本文克隆和鉴定了水稻中与苯并噻二唑(benzothiadiazole，BTH)诱导抗病性相关的编码MAPK的OsBIMK2基因和编码SERK的OsBISERK1基因全长cDNA；研究了OsBIMK2基因和OsBISERK1基因在水稻—稻瘟病菌亲和与非亲和互作过程中的表达模式；原核表达了OsBIMK2基因，获得重组OsBIMK2蛋白，并研究了重组OsBIMK2蛋白的生化特性；克隆了OsBIMK2基因的启动子序列，并运用农杆菌介导的瞬间表达系统分析鉴定了启动子中参与基因表达调控的可能顺式元件：将水稻OsBIMK2基因导入烟草，获得过量表达OsBIMK2基因的转基因植株，这些转基因植株中防卫反应基因PR-1组成型表达，并提高了抗病性。 在运用抑制性差减杂交法分离克隆的与BTH诱发的水稻诱导抗病性相关的差别表达cDNA中，克隆BIHN-n1(BI118686)和BNHN-4w(BI118743)分别含有585 bp和343 bp插入片段，序列搜索表明这两个克隆中的插入片段与植物MAPK和SERK蛋白激酶基因有较高的同源性。运用快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术，以水稻cDNA文库噬菌体DNA为模板，分别扩增了BIHN-n1和BNHN-4w克隆的5’和3’端缺失序列，获得全长cDNA序列信息。根据上述2个克隆的全长cDNA序列，运用PCR扩增获得全长cDNA克隆，分别命名为OsBIMK2(Oryza sativa L.benzothiadiazole-induced MAP kinase 2)浙江大学博_卜学位论文和OsB儿涟RKI(Q矛)za夕riva L.互enzothiadiazole一induced业旦丝1)。 05刀了彻琢卫全长eDNA序列为2132 bp，含有一个1521 bp的oRF区域，5’和3’分别含有205 bp和407bP的非编码区。口，刀刀以兀2 oRF序列预测编码一个506氨基酸组成的MAPK蛋白，含有MAPK蛋白激酶所特有的n个Se叮h;保守结构域以及一个特殊的可磷酸化叁肤模体结构TDY。同源性比对以及系统进化树分析表明，osBIMKZ蛋白与己知的其他植物MAPK蛋白在氨基酸序列水平上有40一71%的同源性，与水稻中己知MAPK蛋白激酶有41 .7%一78.9%的同源性，说明OsBIMKZ可能是一个新MAPK。Southem分析表明，OsBll以KZ以单拷贝形式存在于水稻基因组。原核表达获得重组OsBIMKZ蛋白，而且重组osBIMKZ蛋白在体外具有自我磷酸化活性，表明OsB挤孙佗基因编码一个具有生化活性的MAPK。 由己知序列拼接出的osBisERKI全长cDNA序列为2349bP，含有一个1875bp的ORF区域，5’和3’分别含有104 bp和371 bp的非编码区。OsBISERKI的ORF序列预测编码一个624氨基酸组成的SERK蛋白。预测的osB巧ERKI蛋白与己知的其他植物SERK蛋白在氨基酸水平上有75一85%的同源性。Southern分析表明，OsBISERKI以多拷贝形式存在于水稻基因组。 分析研究了OsB挤办佗基因和口‘刀左汪洁梦刀基因在水稻诱导抗病性以及在水稻一稻瘟病菌(Magnoportho grisea)亲和与非亲和互作中的表达模式。BTH诱发处理和稻瘟病菌侵染6h内均能快速激活水稻口‘刀了材xZ和osBISERKI基因的表达并维持较高表达水平。BTH诱发处理的水稻在与稻瘟病菌非亲和互作的6一12h阶段，就能激活口‘刀扒办口和石污刀左汪次人7基因的快速表达。这些结果表明水稻OsBIMKZ和OsBISERKI基因均在水稻MAPK信号传递链参与的诱导抗性以及抗病基因控制的抗病反应的早期起作用。 根据口扭扒仃口基因序列和水稻基因组序列数据库相应序列，采用PCR方法克隆了3384 bp的口，刀扒办佗的基因组序列和上游2332 bp的启动子序列。osBIj讨人2基因组DNA序列由9个内含子和10个外显子组成，其内含子共有13对正向重复序列和4对反向重复序列，内含子的剪切机制符合植物中最常见的GU一AG形式。分析 OsB扒办佗基因启动子序列，发现起始密码子Al，G上游2.3kb的区域内存在一些与基因表达调控有关的顺式作用元件，如Dof转录因子、ELRE结合序列一浙江人学博卜学位论文GT-1结合序列、WB一box元件和W一box元件等。将OsBIMKZ基因启动子全长区域及其5’一部分缺火构件连接在gus(B一glucuronidase)报道基因编码卜，之前，通过烟草叶片瞬间表达系统发现，克隆的启动子区域中一1071bP或更长的片段在sA诱发处理叶片后都表现出基本的启动子活性。说明在启动子这些区域中存在着受SA诱导的表达口扔了M人卫基因所需的顺式作用元件。 将水稻OsB挤办佗基因导入到烟草，获得过量表达乙七刀从办佗基因的转基因烟草。选用外源花椰菜花叶病毒组成型强表达启动子caMv3，S与载体系统pcAMBIA1381构
李佳[10]2007年在《烟草PR-1a蛋白的表达、制备及其性质、功能研究》文中认为病程相关蛋白(PR蛋白)是由宿主编码的具有种属特异性的植物抗逆蛋白，通常因病毒、真菌或细菌等病原侵染或生理因素、化学因素和物理因素而被诱导表达，它们被认为在防御病原物和抵抗不利环境中具有重要作用。烟草酸性PR-1a蛋白是第一个被纯化和描述的PR蛋白，被作为PR-1蛋白的代表性成员。PR-1蛋白家族是PR蛋白中非常重要的一个家族，通常作为植物系统获得性抗性的标志，但其明确功能和作用机制尚不清楚。为了建立一个高效的PR-1a蛋白原核表达系统及纯化方法来获得重组PR-1a蛋白，本研究将烟草成熟PR-1a蛋白编码区克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-5X-3中，使其与谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase，GST)融合表达(GST-PR1a)。采用设计的两端分别引入BamH1和XhoI酶切位点的引物，以带有烟草PR-1a基因的克隆载体pBluescript SK为模板，成功扩增了烟草成熟PR-1a蛋白的编码序列cDNA(0.43kb)。TA连接，筛选阳性重组子经BamH1和XhoI双酶切后，与同样经BamH1和XhoI双酶切的pGEX-5X-3载体相连并转化E.coli JM109。经双酶切和DNA双向测序，证明成功构建了pGEX-PR1a表达载体。首次将烟草PR-1a蛋白在异源系统中重组表达。选择表达量最高的单菌落为后续实验的表达菌种，优化诱导条件为IPTG终浓度1.0mM，29℃诱导表达4h。GST-PR1a融合蛋白主要存在于上清中，溶解性较好，可能高表达、易溶的谷胱甘肽S-转移酶促进了烟草PR-1a的表达及溶解。诱导表达菌体经超声波破菌，离心，回收上清。由于GST-PR1a融合蛋白含有GST标签，可以通过Glutathione-Sepharose 4B亲和介质层析一步纯化，得到分子量为42 kDa电泳纯的融合蛋白。1L发酵液可获得大约6mg纯化重组蛋白，收率为1.47％。重组蛋白可作为配体用于结合实验和亲和层析，以证明并分离PR-1a蛋白的受体，来研究PR-1a蛋白与其它蛋白质之间的相互作用。用Factor Xa酶切融合蛋白去除GST标签，通过Xarrest~(TM)琼脂糖将Factor Xa移除，纯化得到分子量为15 kDa的PR-1a蛋白。PR-1a是发现最早的PR蛋白及PR-1家族的代表性成员，但其叁维结构以及活性位点的相关信息仍未见报道，而蛋白质的叁维结构在很大程度上决定了蛋白质的功能。本研究利用同源模建和分子动力学模拟方法搭建了烟草病程相关蛋白PR-1a的叁维结构，以PR-1a序列为探针，搜索得到了同源性为58.7％的病程相关蛋白P14a，由Modeler自动模建程序构建得到的初始模型，经过能量最小化和分子动力学模拟后，得到了PR-1a的最佳构象，选择500皮秒时的构象作为最终构象。优化后得到的叁维结构模型用Profile—3D进行了氨基酸残基的兼容性考察，Prostat用来检查所模拟的结构的几何特征，检验结果表明所得理论模型是合理可信的。利用PR-1蛋白家族中一段高度保守的序列GHYTQVVW，使用Binding-Site模块在此基础上分析预测出2个可能的活性位点。从序列分析和几何形状角度分析，推断出位点1(分别是Leu44，His46，His48，Trp72，Asn84，Cys86，His94，Thr96，Gln97，Trp100，Asn129，Tyr130，Pro135，Tyr136)是比位点2更可能的活性位点。获得PR-1a的叁维结构信息对深入探讨PR-1a的抗病作用是很有意义的，对病程相关蛋白家族催化机理的深入研究提供了重要的参考信息。对GST-PR1a蛋白和切标签后得到的PR-1a蛋白随温度变化(20℃～100℃保温30min)的荧光发射光谱进行了研究，结果表明，GST-PR1a和切标签后得到的PR-1a分别在20℃～90℃和20℃～60℃处理时的荧光强度与天然状态时相比变化较小，说明分别在以上温度范围中GST-PR1a和PR-1a的构象与天然状态时比较接近。证明PR-1a蛋白稳定性较好，能够抵抗60℃的高温，而且GST标签的加入使稳定性进一步提高。用纯化的GST-PR1a蛋白免疫新西兰大白兔，获得了对GST蛋白和GST-PR1a蛋白效价分别为1：64和1：32的兔抗GST-PR1a抗血清。免疫双扩散和western免疫印迹分析均说明制备得到的pGEX-PR1a抗血清具有较好的特异性。制得的兔抗GST-PR1a抗血清不仅能与GST-PR1a和GST蛋白进行免疫印迹，还能和从天然烟草提取的酸性病程相关蛋白PR-1a、-1b、-1c进行免疫印迹。说明重组GST-PR1a融合蛋白与天然烟草酸性PR-1蛋白(PR-1a、-1b和-1c)具有一致的免疫化学特性。本研究所获得的GST-PR1a融合蛋白和相应抗血清可用于以后GST pull-down分析来探测PR-1a蛋白与其靶蛋白之间的相互作用，为了解PR-1a与其它蛋白质的相互关系提供线索。对GST-PR1a融合蛋白和切标签后得到的PR-1a蛋白进行了体外抗真菌活性初步研究。体外实验结果表明GST-PR1a和切标签后得到的PR-1a蛋白都对烟草疫霉菌丝体的生长没有抑制作用。通过对马铃薯致病疫霉孢子萌发的抑制实验，证明所得到的重组蛋白与天然烟草PR-1蛋白有一致的体外抑菌活性。当GST-PR1a蛋白浓度为600μg／mL时，孢子萌发部分被抑制，芽管长度也有所减短。当切去GST标签即PR-1a浓度在250μg／mL时就几乎能完全阻止孢子的萌发。根据实验数据绘制了GST-PR1a蛋白和切去标签后即PR-1a蛋白对马铃薯致病疫霉的孢子萌发抑制率—蛋白质浓度曲线。PR-1a蛋白的IC_(50)和IC_(90)值分别是100μg／mL和250μg／mL。GST-PR1a融合蛋白对马铃薯疫霉孢子萌发的抑制活性比切去标签后得到的PR-1a蛋白低的多，当GST-PR1a蛋白浓度为600μg／mL时，对孢子萌发抑制率还不到50％。这说明融合蛋白中的GST-tag可能对PR-1a的抗真菌活性有干扰。然而PR-1a蛋白的N-末端有GST-tag时仍然对马铃薯致病疫霉有弱的抑制作用，同时也说明在其抗真菌机制中，PR-1a的N-末端游离并不是必须的。
参考文献：
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[5]. PeaT1诱导烟草系统获得抗病性及其作用机理的研究[D]. 张微. 中国农业科学院. 2010
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[7]. 病原诱导的小麦ERF、MYB转录因子基因TaPIEP1和TaPIMP1的分离、特性及功能分析[D]. 董娜. 中国农业科学院. 2008
[8]. 毛白杨抗病相关转录因子基因PtWRKY1的表达特性分析[J]. 项争, 蔡兼, 谌殷蕾, 钮俊, 刘雪萍. 基因组学与应用生物学. 2014
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[10]. 烟草PR-1a蛋白的表达、制备及其性质、功能研究[D]. 李佳. 四川大学. 2007