湖南省肿瘤医院·中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院 湖南长沙 410000
【摘 要】目的 探讨直肠癌患者中KRAS，BRAF和PIK3CA基因突变频率，并分析这些基因突变作为直肠癌患者预后和/或预测因素的价值。方法 回顾性分析了自2016年5月至2017年9月间连续手术的98例患者临床和病理学资料。主要关注在我院放疗后接受手术并且能够获得肿瘤样本的患者。结果 98例直肠癌患者中，中位随访时间为28.3个月（4 - 74月）。98例患者中8例（8%）患者经历局部复发和17 / 98（17%）远处转移。KRAS、BRAF和PIK3CA突变分别在23例（23.5%），2例（2%）和4例（4%）患者鉴定出来。局部复发患者没有显示出KRAS和PIK3CA突变和1例患者（12.5%）的BRAF基因突变。在17例（17%）远处转移的患者中，5例（29%）出现KRAS基因突变，1例（5%）BRAF基因突变和1例（5%）PIK3CA基因突变。PIK3CA，KRAS和BRAF基因突变和局部或远处复发没有相关性。结论 KRAS，BRAF和PIK3CA的基因突变频率均低于结直肠癌报道的平均频率，并且局部/远处复发与KRAS，BRAF和PIK3CA基因突变无显著相关性。
背景
在过去的十年间，结直肠癌（CRC）治疗手段的发展速度快于任何其他胃肠道肿瘤[ 1 ]。特别是在转移性疾病的治疗手段的发展，除了化疗和转移性手术切除，也有引入靶向治疗[2]。随着在III期结肠癌的引入基于奥沙利铂的化疗方案，辅助治疗也得到了改进[ 3 ]。而在治疗直肠癌方面取得了进展较少。基于5-氟尿嘧啶化疗方案，随后实施全直肠系膜切除术（TME）是局部晚期直肠癌的最佳联合治疗（定义为T3和/或N+疾病）。相较于放疗和手术，新辅助放化疗已被证明可以减少局部复发，提高病理完全缓解与[4]。由于术前物理治疗能显著降低局部复发率，提高保肛率及减少毒性，已成为术后的首选疗法[5]。试图增加放化疗获益的努力已经在尝试，尤其是随着基于卡培他滨额外增加奥沙利铂为的引入，但是，最终放化疗仍然是局部晚期的直肠癌患者的标准治疗方案。决定使用新辅助放化疗是基于预处理的肿瘤分期确定的T和N分期与盆腔MRI和直肠腔内超声检查。通过手术标本的病理学检查来评估肿瘤响应。众所周知，放化疗后降级已被显示预测较少的复发率和较好的预后。然而，决定使用新辅助放化疗是复杂的。首先，肿瘤响应只有在病理检查后可被评估。其次，尽管局部复发率较低，但是最初始的局部直肠癌患者由于二次转移（15-35%）仍然有高死亡率。另一方面，有些患者可能过度放化疗。因此，许多学者试图找出预测放化疗响应的预测因素。目前，用以研究改善直肠癌预后的最好的方法包括利用磁共振成像对肿瘤响应进行准确的早期评估并且鉴别出肿瘤异常的预测分子。
KRAS、BRAF和PIK3CA的突变常见于结直肠癌中。KRAS和BRAF基因具有致癌性突变能够产生蛋白的组成性激活，分别在约30–50%和10–15%结直肠肿瘤的发现。研究已经表明CRC中的KRAS基因突变在转移性条件下与EGFR的不良响应相关。此外，BRAF基因突变也被作为转移性结直肠癌预后不良因素。然而，KRAS和BRAF突变对局部晚期的CRC患者的临床预后的影响是未知的。最近大型队列对于PIK3CA的研究表明，PIK3CA突变与切除的I-III期结肠癌患者的不良预后有关。另一个结肠癌的大型队列研究表明，结肠癌提示PI3K/AKT或由至少一个的三个基因突变的患者预后不良的预测由这个基因中的至少1个基因突变导致的PI3K/AKT激活或RAS-RAF-MAPK途径激活能够预测患者的不良预后，但是单独的PIK3CA的突变效应没有讨论。先前的另一个研究结直肠癌的小型队列报道了，PIK3CA突变是糟糕的生存期的预测因素。最近，He等人指出，PIK3CA的突变与非放疗的III期直肠癌患者的高风险的局部复发密切相关。由于他们的研究队列群体在肿瘤分期（I-III）d 异质性，并且都未与物理治疗进行联合应用。我们旨在证实KRAS，BRAF和PIK3CA基因在直肠癌癌中的突变频率，并且建立这些突变在多种方式治疗的直肠癌患者中是否可以作为预后和/或预测因素。本项研究是首次在新辅助化疗和手术的局部晚期的直肠癌（不是结直肠癌）患者中观察这3基因突变。
1研究对象与方法
1.1 患者和肿瘤样本
2016年5月到2017年9月这一期间的所有连续治疗局部晚期直肠癌患者（临床T3或T4或淋巴结阳性）的临床记录进行了审查。这项研究是由湖南省肿瘤医院伦理委员会批准。所有患者签署知情同意书。
入组标准是确诊为直肠癌并可获得肿瘤样本。所有患者对本项研究签署知情同意书。诊断是建立在组织学特征的基础上，并通过免疫组织化学染色进一步证实。病理过程标准化和进行质量控制。接受治疗前，所有患者完成病史和体检，全血计数（CBCS），肝功能肌酸酐，血清癌胚抗原评估。所有患者在治疗前进行了刚性直肠镜和全结肠镜检查。利用盆腔MRI和/或直肠内超声对肿瘤和淋巴结分期进行评价。转移性延伸利用胸-腹部-骨盆计算机断层扫描进行消除。临床肿瘤分期最后用“i”（MRI）或“U”（超声波）对肿瘤淋巴结转移（TNM）分类进行定义。放疗期间，每周1次临床检查和CBCs。放化疗结束4周，临床肿瘤分期采用盆腔MRI和CT进行重新评估。手术后的前2年，患者每3个月进行评估，术后3-5年，每6个月进行评估。
患者接受新辅助放化疗和TME手术治疗。放疗包括在25分1.8-2Gy的45?50Gy并同步静脉注射5FU或卡培他滨。放疗的第一1天每天2次口服卡培他滨800mg/m2，放疗期间给予每周5天。从周一到周五输注剂量为350mg/m2/天的5U和剂量为20ng/m2/天甲酰四氢叶酸。手术计划在术前放化疗结束的6周后根据标准化技术进行全系膜切除。
1.2 DNA的提取和突变分析
DNA的扩增是利用位于外显子的突变“热点”的特异引物对DNA进行的。利用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒（Qiagen，Hilden的，Germany ）从FFPE原发性肿瘤样品提取DNA。KRAS基因（外显子2和3），PIK3CA基因（外显子9和外显子20），BRAF基因（外显子15）的突变状态，通过PCR扩增，随后用ABI3730自动测序仪（life Technologies ）直接进行测序分析。用于分析的寡核苷酸序列的引物可根据要求获取。
1.3 统计分析
所有的统计分析均采用SPSS统计软件（Windows 15.0版，SPSS公司）来完成。χ2检验和Fisher精确检验被用来进行对比。复发和生存分析采用Kaplan-Meier法，从进入收入的时间开始计算。组间对比采用对数秩。
2结果
2.1 患者特征
2016年5月至和2017年9月期间，共98例晚期直肠癌患者符合入组标准。采用疾病盆腔MRI和/或直肠内超声检查的方法将局部晚期直肠癌界定为T3和/或N +期。中位随访时间为28.3个月（4-73月）。
2.2 病理特征
我们将KRAS，BRAF和PIK3CA基因型与CRC临床病理特征，包括原发肿瘤部位，病理检查结果和转移部位进行关联分析。突变与临床病理特征，包括年龄，性别，肿瘤部位，切除型，环周切缘（CRM），分化程度，淋巴结及TNM分期没有相关性。我们还调查了KRAS，BRAF或PIK3CA基因突变是否可以赋予抗辐射，减少对CRT的响应。由肿瘤降级评估的残余肿瘤状态或对放化疗的响应与突变状态无关。
2.3 突变分析
突变的KRAS，BRAF和PIK3CA分别在23（23.5％），2（2％）和4（4％）的患者鉴别出来。KRAS基因最常见的突变是G13D，占KRAS突变的43％（10/23）。密码子12突变有G12D（5/23），G12V（4/23），G12S（2/23），G12R（1/23）和G12C（1/23）。1例（50％）患者出现BRAF V600E突变。突变结果总结在表1，突变的分布位置如图1所示。正如先前研究所述，KRAS和BRAF的突变是相互排斥的。
图1 直肠癌患者中三种基因突变情况
2.3 与局部和转移复发的关系
中位随访期为28.3个月（4 - 74月），8例（8%）患者经历了局部复发和17（17%）例患者出现远处转移。局部复发患者未表现出KRAS和PIK3CA突变，1例病人携带BRAF基因突变（12.5%）。在17例（17%）远处转移患者中，有5例（29%）患者携有KRAS基因突变，1例（5%）BRAF突变和1例（5%）KRAS基因突变。生存分析比较了每个突变的患者，3个基因突变至少有1个突变与那些没有突变患者进行比较。PIK3CA，KRAS和BRAF基因突变与局部或远处复发以及总生存期没有相关性（P值均＜0.01）
3.讨论
尽管在过去的几年里，转移性结直肠癌（MCRC）的治疗取得了最新进展，但是这一疾病仍是世界上主要的公众健康问题[ 1 ]。虽然其预后得到了改善，但复发仍然是一个临床挑战。局部复发是直肠癌的的一个关键问题，并且多个肿瘤特征与局部复发相关，包括肿瘤浸润肠壁的深度，具有肿瘤细胞淋巴结数目、静脉外壁浸润，涉及到肿瘤位置距肛缘10 cm以内的环周切缘（CRM）。这些因素可能被用作决定（新）的辅助治疗治疗的因素。然而，具有相似临床病理特征的患者预后仍然具有显著的差异，这表明肿瘤的生物学特征可能是导致了差异。对那些受益于（新）的辅助治疗或仅仅是经受一些副作用的患者的选择可能通过生物预测标记物的检测得到改善。MAPK信号通路在高达30%的CRC的细胞增殖中起着重要的作用[ 6 ]。KRAS和BRAF是该信号通路的成员，并能够通过致癌突变而被激活。在19-48%的直肠癌患者中被报道KRAS基因突变[ 7 ]，而仅在0-12%的直肠癌患者中发现了BRAF基因突变[8]。
在我们的研究中，我们发现PIK3CA基因突变发生率为4%，低于结肠癌报道的10%-30%。在结直肠癌研究中，首次报道了PIK3CA突变与不良预后显著相关[ 9 ]。他们进一步发现PIK3CA基因突变可作为 II-III期无复发生存期患者的唯一的独立的预后因子。然而，只有18例PIK3CA突变的肿瘤，且死亡人数也没有报道。另一项基于大型结肠癌样本的研究表明，在PIK3CA，BRAF和KRAS这3个基因中至少有1个突变的存在能预测糟糕的生存期。然而，在不依赖于临床和其他分子的预测情况下，PIK3CA基因突变对生存的影响并没有进行描述。在最近的研究中，Ogino 等人在450例例根治性切除的结肠癌患者中检测了PIK3CA突变的预后意义。他们发现PIK3CA基因突变与生存率下降相关。PIK3CA突变的“预后差”的患者后果似乎与大多数临床和肿瘤的预测因子相一致，但这种效应似乎仅限于KRAS野生型肿瘤患者。此外，这些突变的研究并没有区分直肠和结肠癌之间的区别。最近的一项针对240例放疗的可切除的I-III期直肠癌患者的Dutch TME 研究确定了PIK3CA突变预后价值。PIK3CA基因突变在19例（7.9%）患者中被鉴定出来，发现其与局部复发率增加密切相关。此外，在PIK3CA突变的肿瘤显示出术后局部复发的趋势更加迅速。He等关注了在全直肠系膜切除术（TME）试验中放疗后果。在这一人群中，他们调查了PIK3CA突变的患者是否能够从术前放疗中获益。虽然差异无统计学意义，但提示了PIK3CA突变的患者在防止局部复发中似乎能够从放疗获益[ 10 ]。
总之，我们的回顾性研究未能证实KRAS，BRAF或PIK3CA基因突变作为预测因子与术前RT/CT后的局部或远处复发具有显著的相关性。KRAS，BRAF和PIK3CA基因突变的确切影响需要大型队列来进一步证实，这是因为复发事件的数量是非常小的，可能仅仅是代表一个样本偏差。最后，随访时间可能太短而不能得出明确的结论。
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论文作者:周慧俊,殷先利
论文发表刊物:《中国结合医学杂志》2018年5期
论文发表时间:2018/9/27
标签：突变论文; 患者论文; 直肠癌论文; 肿瘤论文; 基因突变论文; 局部论文; 病理论文; 《中国结合医学杂志》2018年5期论文;