山东省脐带血造血干细胞库 山东济南 250102
摘要 目的：探讨脐带血CD34+、CFU-GM（粒-巨噬细胞集落）与TNC（有核细胞数）之间是否存在线性关系。方法：收集山东脐血库供者合格筛选标准的脐带血1985例，分别进行细胞计数，CD34+检测与细胞菌落培养后，统计每例脐血的TNC、CD34+和CFU-GM 数值，最后进行线性分析。结果：1985例脐血TNC平均为（15.10±5.20）×108个，其生成的CFU-GM集落为（0.76±0.46）×106个，测得的CD34+细胞数为（3.97±2.89）×105个；CD34+细胞数、CFU-GM总数与TNC呈明显正相关（P<0.01）。结论：可以通过CD34+和CFU-GM快速预测脐带血中造血干细胞的总数，TNC总数越高，脐带血中所含的造血干细胞数就越多，这为脐血的临床应用提供了重要的实验依据。
关键词：脐带血；CD34+；CFU-GM；TNC
中图分类号：Q2-33；R-33 文献标识码：A
Abstract Objective: To investigate whether there is a linear relationship between umbilical cord blood CD34+, CFU-GM(granulocyte macrophage colony) and TNC(total number of nuclear cells). Methods: 1985 Umbilical cord blood (UCB) units were suitable if the Shandong cord blood bank donor selection criteria strictly were fulfilled. The nucleated cell ( NC) number was counted by cell counter，CD34+ cells were measured by flow cytometry, and clonogenic assay was conducted at day 14 of culture．Finally, the linear relationship between umbilical cord blood CD34+, CFU-GM and TNC was assessed. Results: The average TNC of 1985 umbilical cord bloods was (15.10 ± 5.20) × 108, the CFU-GM was (0.76 ± 0.46) × 106, and the number of CD34+ cells was(3.97 ± 2.89) × 106: The number of CD34+ cells and the total number of CFU-GM were positively correlated with TNC(P <0.01). Conclusion: The total number of hematopoietic stem cells in umbilical cord blood can be rapidly predicted by CD34+ and CFU-GM. The higher the total number of TNC, the more hematopoietic stem cells contained in the umbilical cord blood. This provides an important experimental basis for the clinical application of umbilical cord blood.
Key words：Cord Blood；CD34+；CFU-GM；TNC
作为造血干/祖细胞(hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells, HSCs/HPCs)的另一来源，脐带血已经越来越来的应用于临床治疗于治疗白血病，再生障碍性贫血，遗传性疾病、异常血红蛋白和肿瘤等多种恶性和良性血液疾病[1-4]。与骨髓和动员外周血来源的造血干、祖细胞相比有容易获得、移植成活率高、移植后移植物抗宿主病(graft-versus-host disease ,GVHD)的发病率相对较低等优势[5-6]，这让其在临床应用方面具有更广阔的前景。近几年，国家卫计委与国家食品药品监管总局更是规定干细胞制剂制备以药品生产标准进行管理，以促进干细胞临床研究健康开展。
脐带血造血干细胞是一种十分原始的细胞，具有高度自我更新和定向分化的特点，它之所以能够应用于临床治疗多种疾病，与其含有丰富的 HSCs/HPCs 直接相关[7]。但是目前还没有方法能够直接检测脐带血造血干细胞，有文献已经表明，CD34+可以作为骨髓、外周血以及脐带血造血干细胞的标志物，而脐血中的CD34+细胞占有核细胞总数的1~3%[8-9]，因此可以通过CD34+细胞的数量间接的估计造血干细胞的含量。CFU-GM（粒细胞巨噬细胞集落形成单位）是评价造血干细胞增殖分化能力的重要指标之一[10]，脐血移植的成功率和安全性取决于脐带血的质量，因此，集落培养结果是评价脐血干细胞质量的一个重要指标。
虽然与骨髓移植相比，脐带血移植具有一系列的优势，但是存在的主要问题就是单份脐带血中HSCs数量有限[7]，这就在一定程度上限制了脐带血的临床应用。本实验旨在通过对CD34+、CFU-GM与TNC的线性分析，试图可以快速推算脐带血中大体的HSCs，为临床医生提供一定的参考数据，以此提高脐带血的利用率。
1.材料和方法
1.1材料：三联采血袋（威高，国产）、H4534甲基纤维素培养基（STEM SELL，美国）、二氧化碳培养箱（Thermo，美国）、流式细胞仪（BD，美国）、血球计数仪（SYSTEM，日本）、倒置显微镜（Olympus，美国）
1.2方法：
1.2.1脐带血的采集，应用内含28 mL CPDA 抗凝剂200 mL 三联采血袋，产妇分娩时，剪断脐带后，夹闭断端，断端上5 cm 局部消毒，采用脐静脉穿刺采血，采集过程中注意脐血与抗凝剂混匀，采集结束后，夹闭采血管，拔针。
1.2.2利用三分类血球计数仪对脐血进行细胞计数。
1.2.3利用H4534甲基纤维素培养对脐血进行粒细胞巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）实验。每个样本接种三个孔，每孔接种10000个细胞，在二氧化碳培养箱中培养10-14天后，进行集落观察。
1.2.4通过倒置显微镜进行集落观察计数。细胞数大于40计为一个集落。
1.2.5利用流式细胞仪光学系统对脐血进行CD34+检测。
1.3 统计学分析
利用SPSS19.0软件包对结果进行分析。相关回归分析采用Pearson分析，计量数据采用均数±标准差（X±S），P<0.05有显著性意义。
2.结果：
2.1 将1985例脐血所测得的数据进行汇总分析，得到表1数据。由表1数据可知，所选取的1985例样本均符合我库脐血储存标准，无异常脐血样本。
2.2 CD34+、CFU-GM总数与TNC的Pearson分析
得到的三者的相关系数见表2。由表中可以看出CD34+、CFU-GM与TNC的相关系数分别是0.574和0.712，且P<0.01，说明CD34+、CFU-GM与TNC之间显著性相关。并且从还可以发现，CD34+与CFU-GM总数之间也存在显著性相关，这与以往的文献中报道的脐血 CFU-GM细胞数与CD34+细胞数呈显著正相关相符[11]。
2.3 CD34+、CFU-GM总数与TNC线性分析
分别制作CD34+、CFU-GM总数与TNC的散点图，见图1与图2。由图中可以可出CD34+、CFU-GM总数与TNC均存在线性相关，且都是正相关。通过R2可以看出，CFU-GM与TNC的相关性要好于CD34+，表明通过TNC对CFU-GM值的影响更大一点。
讨论
自1974年人类第一次认识到脐带血中含有造血干细胞，到1988年进行了全世界首例脐带血移植，且成功治愈了一位范可尼贫血患者[12]，再到现在报道的越来越多临床案例，期带血的治疗效果已经逐渐得到医学界的认可。然而，脐带血移植应用于临床最大的局限就是脐带血中可提取到的总的TNC数量过少。因造血干细胞没有特异的形态学特点无法辩认，目前，仍无直接鉴定造血干、祖细胞的方法。故在实际检测中常用CD34+总数和CFU-GM集落总数来间接预测造血干祖细胞的质量水平，从本实验也可以看出体外培养条件下生长的造血干细胞的CFU-GM，可能更能说明造血干细胞的质量水平通过比较样本分析发现，CD34+和CFU-GM总数与TNC呈正相关，说明可以通过TNC快速预测脐血的CD34+总数和CFU-GM总数。
TNC是脐血移植的关键，在脐血造血干细胞移植过程中，若脐血的细胞数量不足延缓干细胞植入就会造成移植失败，因此正确的评估细胞活性、造血细胞的数量可以及时确定移植的造血干细胞的数量[13]本实验也说明了通过CD34+、CFU-GM总数和TNC三者可以快速的评价脐血质量，从而为临床移植提供更充分的依据。
近年来，许多科学家致力于研究如何提高脐带血移植的成功率，而研究最多的就是用细胞因子或弱激光来提高脐带血的体外扩增。脐带血的扩增能够使CFU-GM数量增加，其数量高于骨髓和外周血，且脐带血扩增的能力也要优于骨髓和外周血[14-15]。相信随着技术的迅速进步，造血干/祖细胞的体外扩增技术在解决脐带血的数量问题上将有重大的发展前景。
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论文作者:刘瑞1 王凯2(通讯作者) 雒猛3 姜东峰4
论文发表刊物:《临床医学教育》2018年12期
论文发表时间:2018/12/11
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