（1.福建中医药大学 福建福州 350122；2.福建中医药大学附属第二人民医院 福建福州 350003）
摘要：目的 观测泼尼松是否干扰哮喘小鼠CD4+CD25+T 细胞在外周血或肺组织的表达。方法 以卵蛋白建立哮喘模型。随机分为对照组、哮喘模型组、泼尼松干预组。致敏后，三组分别予0.9%Nacl、0.9%Nacl、泼尼松灌胃。分别从小鼠股静脉血、肺泡灌洗液中分离出淋巴细胞，依次用抗体PE-CD4和FITC-CD25标记，检测双抗细胞。结果 哮喘小鼠双抗T细胞无论在外周血，还是在肺组织的表达均被遏制，泼尼松干预后表达均被加强。结论 泼尼松与CD4+CD25+T 细胞的遏制通路或激活通路可能存在某种联系。
关键词：支气管哮喘 泼尼松 CD4+CD25+T cell
随着医学发展，支气管哮喘病死率较20年前有明显下降，但发病率却不降反升，尤其在发展中国家。支气管哮喘的全球防治仍面临巨大挑战，尤其是发病机制不明给预防工作带来困难。以往较多学者认为哮喘与Th1/Th2反应有关，即Th2反应增强从而促进炎症发生。虽然这一观点被广泛接受，但也有一些现象与之不符。继而，“新卫生学假说”[1]在学术界被提出且被不断研究，即认为Toll样受体可能通过某种途径影响CD4+CD25+T细胞的表达，进而参与哮喘发病。笔者旨在通过观察泼尼松将引起哮喘小鼠CD4+CD25+T细胞怎样的变化，以此推断泼尼松是否通过该途径来实现控制哮喘的药理作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
卵清蛋白（OVA），氢氧化铝干粉[Al（OH）3]，PE-CD4抗体（A抗），FITC-CD25抗体（B抗）。
1.2 抗原液制备
A液：用0.9%Nacl（NS）配制成含OVA（0.05 mg/ml）和Al（OH）3（100 mg/ml）的混悬液。
B液：用NS配置成含OVA（10mg/ml）的混悬液。
1.3 分组
将SPF级，6~8周，体重18~22g小鼠，随机分为对照组、哮喘模型组、泼尼松干预组，各12只。
1.4 造模 造模第1天、第7天，在严格无菌条件下行腹腔注射，第一组给予0.2ml NS，后两组给予A液0.2 ml致敏，动态观察；第14~28天，将小鼠置于自制密闭箱内行超声雾化吸入，第一组给予NS，后两组给予B液，30min/天。每次雾化前，前两组喂食0.5ml NS，第三组喂食0.5ml泼尼松（0.182mg/ml）。密切观察小鼠生活习性，若小鼠出现躁动、呼吸深快、不主动进食，甚至仰头喘气、呻吟抽搐，即为成功模型。
1.4 外周血、BALF双抗T细胞检测
取小鼠股静脉血50ul，溶血后离心备用。用10%水合氯醛腔注麻醉小鼠，经口插入双腔气管插管，核实双腔管位置后使两个套囊内充满气体，确保气管插管与支气管腔无间隙以达到完全分隔双侧肺的目的，用PBS液频频行单侧肺灌洗后回收离心备用。顺次沿管壁徐徐加入A抗、B抗，室温避光孵育，频频洗涤离心，冰上重悬，流式细胞仪检测双抗细胞。
1.5 统计学处理
采得数据用SPSS18.0软件包处理，计量资料计以均值±标准差，组间对照用t检验。
2 结果
2.1 各组小鼠外周血、BALF中CD4+CD25+T cell/总T cell（%）对照 模型组低于对照组（P<0.01），干预组高于模型组（P<0.01），如下图。
如图所示，空泡状、囊状的结构完整的薄壁肺泡组织及周围组织不伴有炎症细胞聚集的薄壁支气管管腔在正常小鼠肺组织切片中可被发现；四周不规整乃至被毁坏的塌陷、变形的厚壁肺泡组织，及四周包绕着巨大数量的炎症细胞的厚壁支气管及其狭窄变形的管腔均在哮喘小鼠肺组织中随处可见，另外我们还可以观察到沿着支气管走行的周围血管外壁也被炎症细胞所凝集；泼尼松干预后小鼠的肺泡壁、支气管壁及血管外壁的深染细胞均减少，但较正常小鼠仍可见散在病灶，甚至可见部分肺泡、支气管管腔被破坏。
3 讨论
哮喘的本质是气道慢性炎症。病理切片已展现前期建造的小鼠模型与哮喘相符。泼尼松在一定程度上减少炎症细胞在小鼠肺内支气管及包绕在支气管管腔外的血管外壁的凝聚。
TLR信号介导Th1和Th2反应。一方面，TLR4通过活化核因子κB（NF-κB）等，进一步激活下游效应细胞，释放炎症介质，促发炎症反应；另一方面，TLR4活性下降，Th1反应减弱[2]。同TLR4相似，CD4+CD25+T细胞对Th1、Th2反应均存在调节作用，即表现为非特异性免疫抑制。
无论在人类还是动物模型中，有关哮喘的研究均表明外周血CD4+CD25+T细胞的表达存在相同的现象，即被明显抑制[3，4]。本研究发现不仅外周血，BALF中CD4+CD25+T细胞在哮喘小鼠亦受抑制，说明该细胞可能在哮喘发病中占有重要地位。糖皮质激素强有力的抗炎作用，使得它一直是控制哮喘的首选药物，主要通过抑制NF-κB的活化，遏制或阻断下游炎症因子及介质的分泌与释放，而发挥抗炎作用。本研究还发现泼尼松造成CD4+CD25+T细胞无论在哮喘小鼠外周血、还是BALF中均高表达，说明它可能通过某种途径阻断该细胞的抑制通路或通过某种途径促进其表达。那么TLR4对Th1、Th2反应的双相调节作用与CD4+CD25+T细胞对Th1、Th2反应的非特异调节作用是否相符，两者之间是否通过相同的介质或因子发挥作用，亦或是完全两条不同的通路，泼尼松在其中又扮演了什么样的角色，这也是笔者下一步的研究方向。
参考文献
[1] ELKE CARIO，DANIEL K，and PODOLSKY.Toll-Like receptor signaling and its relevance to intestinal inflammation.Acad.Sci，2006，1072：332-338.
[2]Lun SM，Wong CK，Ko FW，et al.Expression and functional ananlysis of Toll-like receptor of peripheral blood cells in asthmatic patient：implication for immunopathological mechanism in asthma[J].J Clin Immunol，2008，29（3）：330-342.
[3]夏治，汤文，黄成娇，等.支气管哮喘患儿外周血Th17和D4+CD25+调节性T细胞变化及其活动状态相关性分析[J].贵州医药，2016，40（9）：924-926.
[4]黄东晖，吴少丽，王慧贤，等.喘可治注射液通过调节Th17/Treg平衡抑制哮喘模型小鼠气道炎症的实验研究[J].中药材，2014，3（6）：478-481
论文作者:魏萍1，2,王春娥2,张川林2
论文发表刊物:《航空军医》2017年24期
论文发表时间:2018/2/6
标签：小鼠论文; 细胞论文; 哮喘论文; 炎症论文; 泼尼松论文; 支气管论文; 模型论文; 《航空军医》2017年24期论文;