谢英[1]2002年在《水牛卵泡卵母细胞体外成熟及体外受精研究》文中研究说明世界范围内，水牛的繁殖能力低下是阻碍水牛奶、肉生产性能提高的主要原因之一。尽管在环境恶劣的热带地区，水牛有黄牛和肉牛无法比拟的优点，水牛的发展仍然一度被忽视。近年来体外受精(in vitro fertilization，IVF)和胚胎移植技术(embryo transplant，ET)的发展，使来自优秀水牛的后代数量快速增加成为可能。但是，将牛体外受精和胚胎移植技术应用于水牛并取得成功的报道非常有限。鉴于此，本研究参照牛卵母细胞的体外受精技术，对水牛卵母细胞体外成熟和体外受精进行了较为详细、系统的研究，并首次对采用水牛的附睾尾精子进行体外受精的可行性进行了探讨，以期为进一步建立和完善水牛体外受精技术、加速我国水牛品种改良提供理论依据和实践参考。 试验研究表明，在体外成熟(in vitro manturation，IVM)培养液中含有3μg/ml促卵泡素(follicle-stimulating hormone，FSH)时，随着促黄体素(luteinizing hormone，LH)添加量的增加，第一极体(polar body Ⅰ，PBl)排放率和成熟率逐渐提高：添加30μg/ml LH水牛卵母细胞的第一极体排放率(26.67％ vs 2.86％，7.50％)和体外成熟率(40.00％ vs14.29％，17.50％)均显着(p＜0.05)提高。在含有30μg/ml LH的IVM液中进一步将FSH增加为30μg/ml，水牛卵母细胞的第一极体排放率(24.24％)和体外成熟率(45.45％)没有提高；在含有激素的成熟培养液中添加10％的卵泡液(bovine follicular fluid，BFF)，水牛卵母细胞的第一极体排放率(52.33％)和成熟率(66.28％)均进一步显着(p＜O.05)提高；添加发情当天的牛血清(oestrous cow scru，OCS)，水牛卵母细胞的第一极体排放率和成熟率(48.1％，59.04％)均高于胎牛血清(fetal calf serum，FCS)(37.39％，52.87％)，但无统计学差异；颗粒细胞单层共培养对水牛卵母细胞的第一极体排放率(49.21％)和成熟率(65.08％)有提高，但差异不显着。在本实验室条件下，综合以上成熟培养条件可获得60.61％的第一极体率和72.73％的成熟率。 本试验采用添加肝素的BO液和TALP液分别对水牛精子进行获能和受精处理。用BO液和TALP液处理，卵裂率分别为51.85％和55.04％；就发育率而言，相对于培养卵数发育率分别为27.19％和26.36％；相对于卵裂数达48.21％和47.89％。两种处理，水牛精子体外受精效果差异不显着，说明BO液和TALP液均可用于水牛体外受精。 本试验首次对采用水牛的附睾尾精子进行体外受精的可行性进行了探讨。水牛附睾尾精子的受精率为60.71％，卵裂率为50.39％，相对于培养卵数发育率达24.41％，相对于卵裂数发育率达48.44％；与来自广西品种改良站的细管冷冻精液(64.00％，54.31％，26.72％，49.21％)相比，它们的受精能力差异不显着。分别用BO液和TALP液处理水牛附睾尾精子，受精后的卵裂率分别为46.67％和53.73％；发育率分别为21.67％和26.87％；受精效果差异也不显着，与冻精的相应指标相比差异也不显着。 附睾尾精子的活率与采集附睾的方法有关，用保温干储的方法可获得活率好、存活 水牛妞榕吸母纫屉洋办屈撤戾赵丹笋菏研穷时间长的附睾尾精子：形态学观察及染色结果表明：水牛附宰尾精子解高，原生质滴率也高。附睾尾精子受精能力可能与原生质滴率有关。试验结果表明，将水牛附睾尾精子用于水牛体外受精研究和体外受精胚的生产是可行的。
郭振伟[2]2016年在《褪黑素对水牛卵母细胞体外成熟的影响及其机制的探究》文中研究表明褪黑素是松果腺分泌的一种多功能分子,它不仅能调节昼夜节律和季节性动物繁殖,而且在调节动物生殖方面也起着重要的作用。研究证明,褪黑素对卵泡的发育、卵母细胞的成熟和胚胎发育起着重要的作用。本研究主要是探讨外源性褪黑素对水牛卵母细胞体外成熟的影响,并对其相关作用机制进行探究,以期进一步优化卵母细胞体外成熟的培养体系,为阐明水牛卵母细胞成熟的机制提供一定的理论依据。首先,检测了水牛卵丘细胞和卵母细胞上褪黑素的两种受体MT1和MT2的表达情况。结果发现,在水牛卵丘细胞和卵母细胞上均存在褪黑素受体MT1和MT2。其次,探究了在体外成熟培养液中添加不同浓度褪黑素(0M、10-9M、10-8M、10-7M)对水牛卵母细胞体外成熟及其随后体外受精胚胎的发育的影响。结果显示：水牛卵母细胞在添加不同浓度的褪黑素(10-9M、10-8M、10-7M)的成熟液中成熟培养22-24h后,每个处理组的卵母细胞第一极体排出率均显着高于未添加组(50.30% vs 47.56%、53.04% vs 47.56%、50.63% vs47.56%,P<0.05),且浓度为10-8M组卵母细胞的极体排出率显着高于10-9M和10-7M组(P<0.05)。随后,将各组成熟培养24 h后的卵母细胞进行体外受精,发现受精后各处理组胚胎的分裂率显着高于未添加组(60.23% vs57.62%、65.26% vs 57.62%、62.84% vs 57.62%,P<0.05),而且10-8M和10-7M组的胚胎能发育到囊胚的比例显着高于未添加组(20.48% vs15.22%、18.68 vs 15.22%,P<0.05),但10-9M组的囊胚发育率与未添加组相比差异不显着(16.44% vs 15.22%,P>0.05)。最后,探讨了褪黑素对卵母细胞成熟影响的作用机制。结果发现：在成熟液中单独添加同等浓度的褪黑素受体拮抗剂(LZU,10-8M),水牛卵母细胞成熟培养后的极体排出率(47.44% vs 48.15%)、体外受精后胚胎分裂率(57.18% vs 58.42%)和囊胚率(15.06% vs 15.26%)与未添加组相比,差异不显着(P>0.05)；而单独添加同等浓度的褪黑素受体激动剂(IIK7,10-8M)时,水牛卵母细胞成熟培养后的极体排出率(51.25% vs 48.15%)、体外受精后胚胎分裂率(64.15% vs 58.42%)和囊胚率(19.04% vs 15.26%)均显着高于未添加组(P<0.05),但与单独添加褪黑素组(MT,10-8M)卵母细胞的极体排出率(51.25% vs 52.94%)、体外受精后胚胎的分裂率(61.24% vs 64.32%)和囊胚率(18.52% vs 19.36%)相比,差异不显着(P>0.05)；当同时添加褪黑素(MT,10-8M)和褪黑素受体拮抗剂(LZU，10-8M)时,水牛卵母细胞成熟后的极体排出率(48.19% vs 48.15%)、体外受精后胚胎的分裂率(58.13% vs 58.42%)和囊胚率(15.23% vs 15.26%)与未添加组相比,差异不显着(P>0.05)。对卵母细胞活性氧进行检测,结果发现褪黑素处理组卵母细胞成熟后细胞内的活性氧含量显着低于未添加的对照组(P<0.05)。利用激光共聚焦显微镜检测卵母细胞线粒体的分布和线粒体膜电位的变化情况,结果显示：褪黑素处组水牛卵母细胞线粒体呈扩散型分布的数量及线粒体的膜电位均显着高于未添加组(P<0.05)。利用酶标检测cAMP、cGMP、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶含量的变化,发现褪黑素处理组的卵母细胞内cAMP的含量显着低于未添加组,而cGMP、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的含量显着高于未添加组(P<0.05)。荧光定量PCR检测抗氧化基因GPX4和SOD1、卵丘扩展相关基因PTX3 和 HAS1、HAS2以及褪黑素受体基因MT1和MT2的表达情况,结果显示：经褪黑素处理能显着上调水牛卵母细胞GPX4、SOD1、MT1和MT2的表达,而且也显着上调了卵丘细胞上卵丘扩展相关基因PTX、HAS1、HAS2以及褪黑素受体基因MT1和MT2的表达水平(P<0.05)。上述结果表明：(1)在水牛卵丘细胞和卵母细胞上均存在褪黑素受体MT1和MT2;(2)在水牛成熟液中添加适当浓度(10-8M)的褪黑素有利于水牛卵母细胞体外成熟以及其胚胎发育潜能的获得；(3)褪黑素能抑制卵母细胞cAMP的合成、促进卵母细胞cGMP的合成,同时上调卵丘扩展相关基因PTX、HAS1、HAS2口上调受体基因MT1、MT2的表达；(4)褪黑素能促进卵母细胞中抗氧化物酶的合成,清除细胞活性氧,并上调抗氧化物酶的基因表达。
蒋丽[3]2013年在《血管内皮生长因子对水牛卵母细胞体外受精的影响》文中指出在培养液中添加各种生长因子常被用于优化哺乳动物卵母细胞体外受精培养体系。研究表明,血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)支持动物配子的发生、生长和发育,对动物卵母细胞体外受精有积极影响。本研究探讨了VEGF对水牛卵母细胞体外成熟、受精和早期胚胎发育的影响,旨在优化水牛卵母细胞体外受精培养体系,进一步提高水牛体外胚胎生产效率。本研究包括叁个试验。试验一,检验卵丘细胞对水牛卵母细胞体外受精的影响,研究胞质轻微变形的受精卵的发育潜能,并初步试验VEGF对水牛配子发育潜能的影响。结果发现：(1)卵丘细胞去除组受精卵的卵裂率和囊胚率极显着高于保留组(55.14%、20.38%vs.21.44%、3.68%,P<0.01)；(2)细胞质轻微变形的受精卵卵裂率和囊胚率略高于细胞质形态正常组,但差异均不显着(59.96%、20.13%vs.48.59%、18.86%,P>0.05)；(3)卵母细胞成熟培养液中添加10ng/mL VEGF时,受精卵的卵裂率显着高于对照组(0ng/mL VEGF)(54.36%vs.41.84%, P<0.05);受精液中添加10ng/mL VEGF时,受精卵的卵裂率极显着高于对照组(64.28%vs.43.40%,P<0.01)。以上结果表明：(1)水牛成熟卵母细胞去除卵丘细胞的体外受精效果较好；(2)细胞质轻微变形的受精卵仍具有较好的发育潜能；(3)VEGF能提高水牛卵母细胞的发育潜能和精子的受精能力。试验二,探讨不同浓度的VEGF (0、1、10、100ng/mL)对水牛卵母细胞体外成熟的影响。结果发现：(1)各处理组卵丘扩展指数均高于对照组,但各组间差异不显着(2.83、2.68、2.65vs.2.61, P>0.05);(2)10ng/mL VEGF处理组的成熟率显着高于对照组(72.30%vs.57.30%,P<0.05)；1ng/mL和100ng/mL组的成熟率也高于对照组,但差异不显着(67.18%、60.58%vs.57.30%,P>0.05)；(3)各处理组的卵裂率均高于对照组,其中10ng/mL组卵裂率显着高于1ng/mL组和对照组(53.27%vs.41.60%、40.97%,P<0.05)。以上结果表明：(1)VEGF对水牛卵母细胞体外成熟有积极影响；(2)VEGF不仅能促进水牛卵母细胞的核成熟,还能提高卵母细胞的发育潜能。试验叁,探讨在受精液中添加不同浓度的VEGF(0、1、10、100ng/mL)对水牛精子受精能力的影响。结果显示,10ng/mL和100ng/mL VEGF处理组的卵裂率均极显着高于对照组(63.04%、56.26%vs.41.92%,P<0.01),1ng/mL组的卵裂率也显着高于对照组(55.16%vs.41.92%,P<0.05)；10ng/mL组的囊胚率显着高于对照组(32.62%vs.17.00%,P<0.05)。在前期研究结果的基础上,同时在成熟培养液和受精液中添加10ng/mL VEGF,研究其对水牛卵母细胞体外受精胚胎发育的影响,处理组的卵裂率和囊胚率均极显着高于对照组(64.28%、27.22%vs.43.40%、19.02%,P<0.01),且处理组的囊胚细胞数显着高于对照组(106.83vs.89.50,P<0.05)。以上结果表明,VEGF能促进水牛卵母细胞体外受精和早期胚胎发育,并且能提高胚胎质量。总之,VEGF对水牛体外胚胎生产有积极影响,可用于优化水牛体外受精培养体系。本研究中,以添加10ng/mL VEGF对水牛卵母细胞体外成熟和受精的促进效果最好。
丁向彬[4]2005年在《南阳牛卵泡卵母细胞体外成熟与体外受精的研究》文中认为本研究利用屠宰后南阳牛的卵巢,用抽吸法收集卵巢表面2～8mm卵泡中的卵母细胞,对所得A、B级卵母细胞进行体外成熟、体外受精及受精卵体外培养研究,筛选出了适合南阳牛体外胚胎生产的培养系统和操作方法,并探讨了相关影响因素。试验结果如下: 1.以TCM199作为成熟培养基础液添加不同组合激素(E_2、FSH+LH+E_2、PMSG+hCG+E_2)进行卵母细胞体外成熟培养。结果表明,添加FSH+LH+E_2组(B组)成熟率及卵裂率(72.5%,52.6%)均显着高于添加F_2组(A组)(47.5%、35.4%)(p<0.05)。添加PMSG+hCG+E_2组(C组)卵裂率(50.6%)显着高于A组(p<0.05)。B、C两组成熟率和卵裂率差异均不显着(p>0.05)。ABC叁组间囊胚发育率无显着差异(p>0.05); 2.成熟培养基础液中分别添加0.6mg/mlBSA、10%FCS、10%OCS进行卵母细胞体外成熟培养。结果表明,添加10%OCS组所得卵母细胞成熟率(73.3%)显着高于添加BSA组(51.7%),(P<0.05)。成熟培养液中添加OCS,FCS所得卵裂率和囊胚发育率都高于添加BSA组,但各组间差异不显着(P>0.05); 3.成熟培养基础液中分别添加0%(对照组,添加10%FCS)、10%、20%、30%BFF进行卵母细胞体外成熟培养。结果表明,卵母细胞成熟率及卵裂率随卵泡液浓度的增加而降低,添加10%和20%BFF组成熟率、卵裂率和囊胚发育率与添加FCS组相比无显着差异(p>0.05)。添加30%BFF组成熟率、卵裂率均显着低于添加FCS组和10%BFF组(p<0.05); 4.卵母细胞经体外成熟培养(18h,22h,26h),成熟率(52.5%,67.5%,70.0%)随培养时间延长逐渐升高,但差异不显着。培养22h所得卵裂率(54.3%)显着高于培养18h组(40.0%)(p<0.05)。囊胚发育率各组间差异不显着(p>0.05); 5.叁种精液洗涤方法用于南阳牛卵泡卵母细胞的体外受精,结果表明上浮法与密度梯度离心法(Percoll法)相比,卵裂率与囊胚发育率均无显着差异(P>0.05)。上浮法所得卵裂率及囊胚发育率(58.3%、25.9%)均显着高于直接离心法(47.2%,13.3%),(P<0.05)。Percoll密度梯度离心法所得卵裂率(60.6%)显着高于直接离心法(P<0.05),囊胚发育率(21.4%)虽然高于直接离心法,但差异不显着(P>0.05); 6.采用BO液,mTyrode's液,TCM199液作为精子的获能基础液对精子进行获能处理,然后进行体外受精。结果表明,BO液与mTyrode's液所得卵裂率及囊胚发育率相比差异均不显着(P>0.05)。BO液和mTyrode's液所得卵裂率(60.1%、59.3%)显着高于TCM199液(48.5%)(P<0.05),囊胚发育率(17.8%、19.6%)高于TCM199液(14.1%),但差异不显着(P>0.05); 7.以叁种精子密度(0.1×10~6/ml、1.0×10~6/ml、10.0×10~6/ml)进行南阳牛的体外受精。结果表明,所得卵裂率和囊胚发育率均无显着差异,但随着精子密度增加,卵裂率有所增加,1.0×10~6/ml组的囊胚发育率(22.7%)高于其它两组(20.6%,17.7%),差异不显着(p>0.05); 8.以TCM199或mSOFaa作为受精卵基础培养液进行受精卵的体外培养。结果表明两种培养系统所得的卵裂率、桑椹胚率和囊胚发育率均无显着差异(p>0.05),虽然mSOFaa系统中的卵裂
冯贵雪[5]2006年在《卵母细胞体外成熟及人胚胎玻璃化冷冻的研究》文中提出1．探讨了不同大小水牛卵泡卵母细胞体外成熟过程中的减数分裂进程及其胚胎发育潜能。结果发现，不同大小水牛卵泡卵母细胞成熟速度存在明显差异，卵泡的体积越大，卵母细胞的体外成熟速度越快；2～6mm卵泡卵母细胞体外成熟后具有较高的胚胎发育潜能。2．探讨了表皮生长因子(EGF)浓度(0，10ng／ml，25ng／ml，50ng／ml，100ng／ml)对水牛卵母细胞体外成熟的影响。EGF对水牛卵丘细胞的扩展没有影响，但不同浓度的EGF均显着提高水牛卵母细胞的第一极体(PB1)排出率和孤雌激活后的囊胚孵化率，其中以25ng／ml的EGF效果最好。3．探讨了MEM维生素的浓度(0，0.2％，0.5％，1％，1.5％)对水牛卵母细胞体外成熟的影响。添加0.2％和0.5％的MEM维生素对水牛卵丘细胞的扩展没有影响，但显着提高卵母细胞孤雌激活后的囊胚发育率、囊胚孵化率和囊胚细胞数；然而，当浓度升高到1.0％或1.5％时，明显抑制卵丘的扩展和降低PB1的排出率。4．研究了人绒毛膜促性腺激素(HCG)浓度(0.75 IU／ml，2.5 IU／ml，5 IU／ml，7.5IU／ml)对水牛卵母细胞体外成熟的影响。HCG显着促进水牛卵丘细胞的扩展和PB1的排出，但对水牛卵细胞孤雌激活后的胚胎及囊胚细胞数没有影响。5．探讨了水牛和人无卵丘卵母细胞体外成熟的可行性。结果发现，未扩展卵丘细胞包围法和扩展卵丘细胞团支撑法可促进卵丘细胞与卵母细胞间的间隙连接重建，进而促进无卵丘水牛卵母细胞的体外成熟；与单层卵丘细胞共培养并不能促进无卵丘水牛卵母细胞的体外成熟；卵巢组织包围培养不能模拟体内卵巢的环境，且卵巢组织可能分泌抑制卵母细胞胞质成熟的因子；扩展卵丘细胞团支撑法能明显促进人无卵丘卵母细胞减数分裂的恢复，其成熟培养的无卵丘人卵母细胞显微受精后能发育成为正常囊胚；卵泡液有利于人卵丘细胞团叁维结构的维持。6．探讨了玻璃化冷冻保存人4-8细胞胚胎的可行性及其临床应用价值。结果发现，胚胎承载器具和冷冻样品体积对人4-8细胞胚胎的玻璃化冷冻保存效果有显着影晌，冷冻样品的体积越小，其胚胎冷冻保存的效果越好，玻璃毛细管(GMP)的玻璃化冷冻保存效果优于拉细开口塑料细管，是一种可用于临床的人4-8细胞胚胎高效冷冻方法。7．探讨了胚胎培养结合玻璃化冷冻技术挽救人低评分胚胎的可行性。结果发现，第叁天(D3)早期低评分胚胎不宜进行冷冻保存，但经过体外培养后部分胚胎能够形成囊胚，且这些囊胚可以玻璃化冷冻保存，解冻移植后能够获得健康婴儿。
李敏玲[6]2015年在《EGCG对水牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响》文中研究指明体外胚胎生产中,各种抗氧化剂常被添加于不同的培养液中以提高体外胚胎生产效率。实验表明,表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin Gallate, EGCG)能够清除健康细胞中ROS,提高配子的抗氧化能力,有利于动物卵母细胞体外成熟和精子受精。本研究主要探讨了EGCG对水牛卵子体外成熟、精子受精能力的影响以及可能的作用机理,旨在使水牛体外胚胎生产高效化。本研究包括叁个试验：试验一,EGCG对水牛卵母细胞体外成熟的影响。旨在探讨EGCG对水牛卵母细胞卵丘扩展、成熟率的影响,并初步试验EGCG对水牛配子发育潜能的影响。结果发现：(1)10、20 μmol/L处理组与对照组卵丘扩展指数差异显着(2.49、2.42 vs.2.22, P<0.05);5、30 μmol/L处理组卵丘扩展指数也高于对照组,但无统计学意义(2.36、2.28 vs.2.22,P>0.05)；(2)10、20μmol/L处理组成熟率显着高于对照组(59.31%、50.98% vs.45.26%,P<0.05)；但两组之间差异不显着；5 μmol/L和30 μmol/L处理组的成熟率与对照组差异不显着(47.04%、42.81% vs.45.26%,P>0.05)；(3)在成熟液中添加EGCG,各处理组的卵裂率、囊胚率均高于对照组,其中10 μmol/L处理组效果最佳。孤雌激活后,卵裂率和囊胚率均显着高于对照组(67.07%vs.57.53%、31.69% vs.20.66%, p<0.05);体外受精后,卵裂率和囊胚率也显着高于对照组(59.64% vs.44.65%、24.68% vs.15.02%, p<0.05)。以上结果表明,EGCG能促进水牛卵母细胞体外成熟,并提高了卵母细胞的发育潜能。试验二,EGCG (0、5、10.20、30 μmol/L)对水牛卵母细胞体外成熟阶段抗氧化能力的影响。结果显示：(1)添加20.30 μmol/L的处理组MⅡ期ROS DCF荧光强度与对照组差异显着(18.77、25.39 vs.38.04,P<0.05)；(2)各处理组MⅡ期水牛卵母细胞H202含量与对照组差异不显着(4.68、4.33、4.16、4.51 vs. 4.90, P>0.05); (3) 5、10、20 μmol/L处理组GSH含量与对照组差异显着(3.0、3.21、3.25 vs.2.59, P<0.05); 30 μmol/L处理组GSH含量也高于对照组,但无统计学意义(2.99 vs.2.59,P>0.05)。以上结果表明：在水牛卵母细胞体外成熟过程中,EGCG能够降低卵母细胞内活性氧水平,提高GSH的合成,但不能降低H202的含量；(4)综上所述,在卵母细胞体外成熟过程中,EGCG影响氧化反应。试验叁,探讨在受精液中添加10 μmol/L的EGCG对水牛精子受精能力的影响以及在成熟液和受精液中同时添加EGCG是否有协同作用。结果显示：在成熟液、受精液、成熟液和受精液中分别添加10μmol/L的EGCG后,各组卵裂率显着高于对照组(61.31%、59.14%、58.57% vs.45.71%,P<0.05)；各组的囊胚率显着高于对照组(23.61%%、22.77%、23.56% vs.16.74%,P<0.05)。以上结果表明,EGCG能提高水牛精子受精能力和促进早期胚胎发育,但在成熟液和受精液中同时添加EGCG没有协同作用。为了高效方便,本试验中,最佳方案为在成熟液或者受精液中添加10 μmol/L的EGCG。总之,EGCG作为一种高效的抗氧化剂,能够促进水牛卵母细胞体外成熟、体外受精,并提高了胚胎体外发育率。EGCG对提高水牛体外胚胎生产有积极影响,可提高水牛卵子的利用率。本实验室条件中,单独在成熟液或者受精液中添加10 μmol/L EGCG效果最好。
田秀芝[7]2017年在《褪黑素和CNP对绵羊卵母细胞体外成熟的影响及过表达AANAT的研究》文中提出卵母细胞体外成熟(IVM)是胚胎工程研究的重要基础环节,但体外成熟卵母细胞的质量与体内相比仍有很大差异。大量的研究表明褪黑素(MT)和C-型钠钛(CNP)在动物的生殖活动尤其是对卵母细胞的成熟发育具有重要的意义。因此本研究利用MT和CNP对绵羊卵母细胞进行体外成熟培养,以期进一步完善体外培养体系并研究卵母细胞体外成熟的调控机理,从而为绵羊的体外受精、核移植等生物技术的开展奠定基础。实验一研究了褪黑素对绵羊卵母细胞体外成熟的影响。免疫荧光检测表明在绵羊GV和MII卵丘颗粒细胞、卵母细胞上都表达褪黑素受体MT1和MT2,western blot检测表明MT1和MT2在壁颗粒细胞、GV和MII卵丘颗粒细胞及卵母细胞上都表达,且MT1在颗粒细胞和GV卵丘颗粒细胞上的表达显着高于GV卵母细胞、MII卵母细胞和卵丘颗粒细胞;MT2在MII卵母细胞上的表达显着高于GV颗粒细胞、卵丘颗粒细胞和卵母细胞及MII卵丘颗粒细胞;成熟液中添加10-9～10-7 mol/L褪黑素显着提高卵丘颗粒细胞扩展和极体排出率,且10-7 mol/L显着提高了卵裂率和囊胚率;RT-PCR结果表明10-7mol/L褪黑素对卵母细胞GDF9、DNMT1的表达没有影响但提高了卵母细胞上BMP15及卵丘颗粒细胞PTX3、HAS2、EGFR的表达;添加抑制剂Luzindole组极体排出率、孤雌激活后的卵裂率、囊胚率和孵化囊胚率与对照组相比没有差异,但显着低于MT组;MT显着降低卵母细胞的cAMP、增加颗粒细胞的cGMP。本研究结果说明MT主要是通过MT1受体发挥作用的。实验二研究了 CNP对绵羊卵母细胞减数分裂的影响。RT-PCR检测表明在绵羊壁层颗粒细胞、GV卵丘颗粒细胞和卵母细胞上CNP和NPR2都有表达,且壁层颗粒细胞上CNP含量显着高于卵母细胞和卵丘颗粒细胞,而卵丘颗粒细胞上NPR2显着高于壁层颗粒细胞和卵母细胞。在成熟培养液中添加200 nM CNP处理不同时间(4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h)的结果表明:CNP处理4 h内能显着抑制核成熟,6 h后抑制作用迅速降低,CNP处理16 h已有卵丘颗粒细胞完全扩展,说明CNP处理最佳时间是4 h且对卵丘颗粒细胞扩展没有影响。CNP处理绵羊COCs 4 h、8 h、12 h卵母细胞和卵丘颗粒细胞上相关基因的表达变化表明:卵母细胞上CNP、NP和MT18 h表达量最高,卵丘颗粒细胞上NPR2 4 h表达量最高,FSHR、LHR、MT1、MT2、EGFR总体呈上升趋势,说明卵母细胞发生GVBD需要CNP的参与,CNP能够促进成熟相关基因的表达。200 nM CNP处理共培养绵羊壁层颗粒细胞(MGC)和COCs 4 h、8 h、12 h结果表明:GC细胞上CNP、NPR2、MT1、MT2和LHR的表达量呈上升趋势,说明GC分泌CNP,同时促进了 GC上NMT1、LHR的表达;COCs上CNP也增加,主要可能是由于GC合成的CNP进入COCs,而COCs上NPR2在4 h表达量最高,充分说明了壁层颗粒细胞分泌CNP并通过卵丘颗粒细胞上NPR2发挥作用。本研究结果揭示了 CNP在4 h内能够抑制卵母细胞的减数分裂恢复,且不影响COCs的卵丘颗粒细胞扩展,其作用机制是通过壁层颗粒细胞分泌CNP作用于卵丘颗粒细胞上的NPR2受体,从而影响了卵母细胞和卵丘颗粒细胞上相关基因的表达,进一步影响COCs的体外成熟。实验叁研究了 CNP和MT共同处理对绵羊卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎体外发育的影响。实验结果表明,CNP预处理4 h再继续成熟24 h和28 h组孤雌激活胚的卵裂率显着高于对照组,再成熟24 h组囊胚率显着高于对照组,而再成熟28 h组囊胚率和对照组没有显着差异。研究结果还表明CNP、MT单独或联合使用胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数都显着高于对照组;定量PCR结果表明,CNP、MT、CNP + MT叁组CNP、NPR2、FSHR和EGFR都显着提高;CNP、MT、CNP + MT叁组线粒体均匀分布比例显着提高,皮质颗粒完全迁移的比例显着提高。综上所述,利用CNP、MT进行绵羊卵母细胞体外成熟培养都能够促进胞质与核成熟的同步性,增加成熟相关细胞因子的分泌,从而显着提高卵母细胞体外成熟的质量,从而提高胚胎的发育能力。实验四研究了过表达AANAT基因对转基因绵羊生产效率的影响。研究结果表明OPS冷冻胚胎的产仔率、羔羊存活率和转基因阳性率与未冷冻胚胎没有显着性差异,但冷冻胚胎的后代平均初生重高于未冷冻胚胎,转AANAT阳性后代的超排效率和后代扩繁效率与对照组差异不显着,但显着高于阴性组,后代扩繁的窝产羔数显着高于对照组和阴性组,但扩繁后代初生重低于对照组。以上结果揭示了原核注射AANAT基因的胚胎过表达AANAT基因,提高了胚胎的褪黑素水平和后代卵母细胞的质量,进而提高了胚胎移植效率、转基因阳性率和后代的繁殖效率。综上所述,MT能够促进绵羊卵母细胞的体外成熟及孤雌胚胎的体外发育;CNP在4 h内能够显着抑制卵母细胞的减数分裂恢复;CNP、MT单独或者联合使用,都有利于卵母细胞的体外成熟,提高CNP、NPR2、FSHR、LHR、EGFR、MT1和MT2基因的表达及线粒体均匀分布和皮质颗粒完全迁移的比例;显微注射转入AANAT基因提高了胚胎的褪黑素水平,提高胚胎移植的效率和转基因后代的阳性率及转基因后代的繁殖效率。
杜凤娇[8]2015年在《脑源性神经营养因子对水牛卵母细胞体外成熟的影响及其作用机制的初步研究》文中认为脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族成员,不仅在神经系统广泛表达,在哺乳动物的卵巢中也表达。研究表明,BDNF对哺乳动物卵泡发育、卵母细胞成熟及早期胚胎发育起重要作用。本研究旨在探讨BDNF对水牛卵母细胞体外成熟的影响,并对其相关作用机制进行初步研究,以期进一步优化卵母细胞体外成熟培养体系,提高胚胎体外生产的效率。1.水牛BDNF基因克隆、序列分析及其在不同组织中的表达模式。测序结果显示,克隆获得的水牛BDNF基因全长800bp,编码区753bp,编码250个氨基酸,其核苷酸和氨基酸序列与多个物种的同源性都很高；蛋白结构预测分析显示,BDNF定位在细胞内且为含有信号肽序列的分泌型蛋白,其叁级结构由多个α-螺旋、3对反向平行的p-折迭结构等构成活性中心,即NGF功能结构域；qRT-PCR检测结果显示,BDNF在胎儿及成年水牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、’肾脏、大脑、皮肤、肌肉、卵巢、睾丸10种组织中均有表达,在卵巢上高表达；受体TrkB. p75在胎儿及成年水牛各组织中的表达模式与BDNF并不完全一致,但TrkB在卵巢中高表达,而p75在卵巢中表达很低。2. BDNF及其受体在水牛卵泡、卵母细胞及早期胚胎中的表达模式。利用免疫组化、ELISA、免疫荧光染色及qRT-PCR等方法的检测结果发现,BDNF在水牛卵泡发育各时期均有表达,且主要在卵母细胞、颗粒细胞及卵丘细胞中表达,同时在直径4<Φ≤7mm的卵泡中,卵泡液BDNF浓度、卵泡颗粒细胞BDNF mRNA及TrkB mRNA的表达水平均最高,Φ>7mm的次之,2≤Φ≤4mm的最低,且存在显着性差异(P<0.05),而p75 mRNA表达水平很低；水牛COCs在体外成熟过程中(0h、6h、12h、24 h), BDNF mRNA在卵母细胞及卵丘细胞上表达呈逐渐上升趋势,TrkB mRNA在卵丘细胞上表达呈先上升后下降趋势,但在卵母细胞上不表达,p75 mRNA在卵母细胞及卵丘细胞上表达呈先降低后快速上升趋势；水牛早期胚胎在发育过程中(2cell、4cell、8cell、桑椹胚、囊胚),BDNF mRNA表达呈先上升后下降趋势,4cell表达最高,p75 mRNA表达呈逐渐下降趋势,2cell表达最高,BDNF及p75在桑椹胚及囊胚表达都很低,而TrkB在胚胎发育过程中不表达。3. BDNF对水牛卵母细胞体外成熟的影响及其作用机制。在体外成熟液中添加lOng/ml的BDNF能显着提高卵母细胞的成熟率(59.07%vs48.96%,P<0.05)及随后IVF早期胚胎的囊胚率(23.29% vs 15.58%,P<0.05),但对裸卵成熟无显着影响(50.82% vs 50.86%,P>0.05)；在体外成熟液中分别添加TrkB和p75的抑制剂K-252a与Pep-5, BDNF+K-252a组的成熟率显着低于BDNF组(49.50% vs 60.01%,P<0.05),而BDNF+Pep5组的成熟率与BDNF组相比无显着性差异(59.04% vs 60.01%,P>0.05)；卵丘细胞凋亡相关基因(Bax> Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Fas、p53)、BDNF受体(TrkB、p75)及发育相关基因(CCNB1、COX2、Cx37、Cx43、CYP11A1、FSHR、HAS2、MAPK、PCNA、PGES、PTX3、TSG-6)表达的qRT-PCR检测结果显示,BDNF能显着下调Caspase-9、Fas的表达,上调TrkB、 CCNB1、PCNA、Cx37、Cx43、HAS2、PTX3、TSG-6的表达。以上结果表明：(1)克隆获得的水牛BDNF基因全长800bp,编码区753bp,编码250个氨基酸,在物种间具有高度保守性,且BDNF及其受体TrkB在水牛卵巢中高表达；(2) BDNF在水牛卵泡发育各时期及不同直径卵泡的卵泡液中均有表达,同时BDNF及p75在不同直径的卵泡颗粒细胞、体外成熟过程中的卵母细胞和卵丘细胞、以及早期发育阶段的胚胎中均有表达,而TrkB仅在颗粒细胞和卵丘细胞中高表达,在卵母细胞及早期胚胎中不表达；(3)适宜浓度的BDNF (lOng/ml)有利于水牛卵母细胞体外成：熟及发育潜能的获得,BDNF的这一作用可能是通过与卵丘细胞上受体TrkB结合,下调卵丘细胞凋亡相关基因Caspase-9、Fas的表达,上调受体TrkB、增殖相关基因CCNB1、PCNA和缝隙连接基因Cx37、Cx43,以及卵丘扩展相关基因HAS2、PTX3、TSG-6的表达而实现的。
胡林勇[9]2008年在《牛体外受精技术体系的优化研究》文中指出自1982年第一头牛体外受精后代出生以来,虽然国内外学者对牛的体外受精(in vitro fertilization,IVF)技术进行了不断的完善,但是目前对于一些因素对IVF效率的影响还存争议。因此,有必要对牛的IVF体系进行优化研究。这不仅有助于进一步明确这些因素对IVF的影响,而且对于提高IVF胚胎生产效率及加速IVF技术在生产上的推广应用都有重要的意义。本研究在目前国内外体外受精研究的基础上,对牛卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)、IVF及早期胚胎的体外培养(in vitro culture,IVC)作了进一步的优化研究,并重点研究了葡萄糖对牛IVF及早期胚胎体外培养的影响。旨在建立一套经过优化的牛IVF技术体系。1.在卵母细胞体外培养中,比较了不同蛋白质添加物(胎牛血清,fetal bovine serum,FBS;新生牛血清,newborn calf serum,NCS;牛血清白蛋白,bovine serum albumin,BSA)以及表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对卵母细胞IVM的影响。结果表明,与BSA相比,血清可以显着促进卵母细胞的成熟,而FBS对成熟效果要好于NCS。EGF添加量在20 ng/mL时即明显促进卵母细胞的成熟率,随着其浓度的增加,卵母细胞成熟率并未相应增加。2.在精子获能和受精中,不同公牛个体对体外受精卵裂率、8-细胞胚胎发育率及囊胚率均有明显影响,就体外受精卵裂率来讲,2号牛(62.3%)和3号牛(67.4%)显着高于5号牛(35.8%, P<0.01)。精子获能液中肝素的添加剂量对体外受精的影响仅表现在卵裂率的差异,50 ng/mL组的卵裂率(71.3%)显着高于10 ng/mL组(62.1%, P<0.05)。就卵裂率及囊胚率来讲,获能液和受精液中的葡萄糖添加与否对IVF无明显影响。3.受精卵体外培养时,无论在开始进行胚胎培养时就加入葡萄糖,还是先在不含葡萄糖的培养液中培养48 h后添加葡萄糖,5.6 mmol/L组的囊胚发育率均明显低于其他各组。这表明,在体外高浓度的葡萄糖会抑制牛IVF胚胎的体外发育。在培养开始时即加入3.0 mmol/L葡萄糖时,其8-细胞胚胎发育率低于不添加葡萄糖组(50.9% vs 60.6%, P<0.05);而在培养48 h后加入3.0 mmol/L葡萄糖时,其8-细胞胚胎与不添加葡萄糖组无明显差异(59.8%, 59.3%, P>0.05),这提示葡萄糖对胚胎发育的影响与其添加时期有关。在以FBS为蛋白质添加物时,添加1.5 mmol/L葡萄糖与否并未显着影响IVF胚胎的囊胚发育率;而在以BSA为蛋白质添加物时,添加1.5 mmol/L葡萄糖却明显促进了IVF胚胎的囊胚发育率(23.1% vs. 17.3%, P<0.05)。这说明葡萄糖对IVF胚胎体外发育的影响还与蛋白质添加物有关。另外,在培养液中添加1.5 mmol/L葡萄糖时,以FBS为蛋白质添加物组的囊胚发育率显着高于以BSA作为蛋白质添加物组(37.8% vs 23.1%,P<0.05)。这进一步说明FBS可以提高牛IVF体系的胚胎生产效率,在牛IVF体系中具有重要作用。
胡文举[10]2006年在《南阳牛卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的研究》文中认为南阳牛是我国五大黄牛良种之一,有着十分重要的保种和育种价值。以南阳牛卵泡卵母细胞为材料通过体外成熟培养和体外受精技术建立南阳牛胚胎基因库是进行南阳牛保种的一个新途径。但是,迄今为止还未见到对南阳牛体外受精技术进行系统性研究的报道。本研究以屠宰后南阳牛的卵巢为材料,用抽吸法收集卵巢表面2～8mm卵泡中的卵母细胞,通过体外成熟、体外受精及受精卵体外培养的研究,探讨了影响南阳牛体外受精的因素。建立了适合南阳牛胚胎体外生产的可行性程序。试验结果如下:1.探讨了卵母细胞周围的卵丘细胞层数对卵母细胞体外成熟和发育潜力的影响。结果显示,具有2～8层卵丘细胞的卵母细胞的第一极体率(87.5%)、卵裂率(74.2%)和囊胚率(35.1%)均显着的高于8层以上组、2层以下组和裸卵组;2层以下组的第一极体率(67.5%)、卵裂率(48.8%)和囊胚率(23.8%),显着高于8层以上组和裸卵组;裸卵组的效果最差,囊胚率为0%。2.卵母细胞成熟培养22h以上时卵母细胞的第一极体率(87.5%、87.5%)虽然高于培养18～22h组,但是,卵裂率(41.3%、24.3%)和囊胚率(26.3%、11.1%)均明显低于培养18～22h组(75.3%、36.2%),差异极显着(P<0.01);培养18h以下时,卵母细胞的第一极体率、卵裂率和囊胚率显着降低。3.在培养液中添加10%的OCS,卵母细胞的第一极体率(87.5%)、卵裂率(74.2%)和囊胚率(35.1%)最高,与添加FCS组和BSA组之间差异极显着(P<0.01);添加FCS组的第一极体率,卵裂率和囊胚率与添加BSA组之间差异极显着(P<0.01);添加BSA组的第一极体率(52.5%)、卵裂率(32.9%)和囊胚率(15.6%)最低。4.比较了成熟培养基础液中添加0%(对照组,添加10%FCS)、10%、20%、30%、40%BFF对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,添加10%、20%BFF组的卵母细胞第一极体率(82.5%、85.0%)、卵裂率(76.9%、77.9%)及囊胚率(30.1%、35.8%)显着高于对照组、30%和40%组。卵泡液的浓度增加到30%和40%时与添加20%组相比卵母细胞的第一极体率和卵裂率分别降低了42.5、75.0和44.9、64.0个百分点,但添加30%组的囊胚率比添加20%组提高了5.3个百分点。5.在卵母细胞成熟培养液中分别单独添加FSH、LH、E_2与对照组相比,对卵母细胞的第一极体率、卵裂率和囊胚率的影响各组之间差异不显着(P>0.05);添加复合激素E_2+FSH+LH对卵母细胞的第一极体率和卵裂率没有明显的影响,但添加复合激素E_2+FSH+LH时卵母细胞的囊胚率显着的其他各组(P<0.01)。6.用直接离心法、Percoll密度梯度离心法和上浮法处理的南阳牛精子进行体外受
参考文献：
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[4]. 南阳牛卵泡卵母细胞体外成熟与体外受精的研究[D]. 丁向彬. 河南农业大学. 2005
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