陈灵华[1]2003年在《重组腺病毒H101对肝癌细胞生长抑制的实验研究》文中研究表明原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居恶性肿瘤第二位。尽管近年来肝癌的外科治疗获得了令人注目的成就，但对晚期肝癌及术后广泛复发和转移的患者仍无满意的手术方式。肝癌的非手术治疗主要有化疗、放疗、免疫治疗、中医治疗、射频和微波消融等，目前这些治疗的效果还不甚理想。因此要进一步提高肝癌的治疗效果，需要引入一种崭新机制的治疗手段。近年来随着肿瘤学、分子生物学和病毒学的发展，基因治疗正逐步进入临床，以其独特的治疗机制为肝癌治疗提供一种新的选择。 腺病毒能够感染分裂和非分裂期的细胞。腺病毒E1基因复合体的表达对它的感染起重要作用。E1基因复合体包括E1A和E1B基因。E1A结合和抑制pRB，为病毒增殖创造良好的细胞内环境。病毒的复制能激发p53通路诱导细胞凋亡或细胞周期停滞，从而中断病毒的感染；而E1B—55kD能结合和抑制p53蛋白，保证病毒顺利复制并裂解细胞。肿瘤细胞的pRB和p53基因经常发生突变或缺失；因此E1A或E1B基因缺陷的腺病毒仍可分别在这些肿瘤细胞中选择性复制，但在pRB和p53途径完好的正常细胞中的复制减弱。 H101是上海叁维生物有限公司构建并获得国家专利的重组腺病 浙江大学博士学位论文毒。H101的口 基因编码55kDa 蛋白的序列缺失；因此它在p53 基因突变的癌细胞中仍可表现出很强的细胞毒性作用，而在正常细胞中它的复制被大大抑制。H101肿瘤增殖的选择性使它有望成为一种新的肿瘤治疗药物。目前H101 已经进入临床试验阶段，但主要集中在体表肿瘤的治疗，而对于深部肿瘤如肝癌、胃癌、结肠癌和食道癌的治疗尚属空白。文献报道肝癌 p53 基因的突变率达30－50％。p53基因的突变与肝癌分化、侵袭性、门静脉癌栓、转移能力与预后有密切相关性，因此针对肝癌的p53 基因治疗对改善肝癌的预后有重要意义。本文拟就mol对体外、体内肝癌细胞生长的抑制作用及其与 中 突变的关系进行研究：同时将阿霉素与H101联用，探讨两者在杀伤肝癌细胞时的协同作用。全部研究包括以下叁部分。第一部分：重组腺病毒H101对体外肝癌细胞生长抑制的实验研究目的：研究H101对体外肝癌细胞生长的抑制作用与细胞株p53 基因突 变的关系，探讨H101的抑制作用与肝癌细胞p53 及其p53 通路 的下游基因 p21“”表达的关系。方法：所用细胞株分别为P53 基因无突变的肝癌细胞株HepGZ 和 BEL7404，P53 基因缺失的肝癌细胞株Hep3B，永生化正常肝细 ）他 L02。用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） fu单链构象多态性分析（single strand conformatlon polymorphism．SSCP）分析永生化正常肝细胞 L02的 p53 基因状 况。在用终极稀释滴定法确定H101滴度后t分别以不同的空斑 形成年．位／细胞（multofe of infection，MOI）感染不同 P53 基因型的细 胞株，培养 8 天后用 MTT法观察 H］of M细胞的杀伤作用。用 5 MOI的H101感染L02、HepGZ 和 HepGZ，并设不加病毒的对照 组；然后分别在感染后第24、36小时取样，用免疫组化染色观 察细胞株 p53、p21“”基因表达的变化。 结果：（l）L02 的p53 基因无突变。 2 浙江大学博士学位论文 （2 ） H101在MOI为 100、10、l、0．l、0．of 时对BEL7404细胞 株的杀伤率分别为 80．7％、2．5％、l．6％、2．5％、2．4％： H101在MOI为 100、10、l、0．l、0刀1 时对HepGZ 细胞 株的杀伤率分别为 98．3％、99．l％、98．9％、l．8％、2．1 ％；H101在MOI 为100、10、1、0．l、0刀］时对L02 细 胞株的杀伤率分别为 sl．9％、4．3％、3二％、3．5％、3．7 ％；H101在MOI为100、10、l、0．l、0．of 时对Hep3B 细胞株的杀伤率分别为99二％、99．4％、99二％、引J ％、28．8％。肝癌细胞株 Hep3B（p53基因缺失）在 H101为 0．IMOI以上时即可被显着杀伤：H：pGZ（p53基因野生型） 在 MOI为 1 时以上时才被显着杀伤；BEL7404（p53基因野 生型）和 L02 （p5基因野生型）在 MOI为 100 以上时才被 显着杀伤。 （3）在H101作用24、36’J’时后，HepGZ 和 L02 的实验组 p53、pZI””蛋白表达均为阳性，而对照组为阴性； Hep3B 实验组的 pZIW”蛋白表达在 H101感染后和对照组 一样始终为阴性。 结论：（1）L02 的 p53 基因为无突变的野生型。 （p ） 低浓度H101对肝癌细胞的选择性杀伤作用与 p53 基因突 变
陈漉[2]2009年在《特异性抗肿瘤重组腺病毒抑癌作用研究》文中认为为更好的研究重组腺病毒抗肿瘤制剂在临床应用过程中存在的安全性和有效性,本研究利用分子生物学、病毒学和免疫学等技术和手段,通过同源重组方法构建了分别含有特异性抑癌基因HN、Apoptin的特异性抗肿瘤重组腺病毒;同时构建了对照重组腺病毒,Ad-EGFP。通过一系列实验研究证明,所获得重组腺病毒性状稳定,形态完整。通过MTT染色、AO/EB染色、流式细胞术等方法检测了重组腺病毒感染对HepG-2人肝癌细胞的抑制作用。证明了,Ad-Apoptin和Ad-HN重组腺病毒可不同程度地抑制体外培养的HepG-2肿瘤细胞。利用Annexin V染色、DAPI染色、Caspase活性检测等方法探讨了所构建重组腺病毒致HepG-2细胞死亡的方式。证实了,Ad-Apoptin、Ad-HN重组腺病毒主要以诱导凋亡的方式抑制体外培养的HepG-2肿瘤细胞。通过在C57BL/6小鼠荷小鼠肝癌(H22)肿瘤模型上的体内实体肿瘤抑制试验,发现Ad-Apoptin、Ad-HN均可不同程度地抑制实体肿瘤的生长,提高荷瘤动物模型生存率,延长荷瘤动物模型生存期。另外,Ad-HN还可以刺激机体产生抗肿瘤免疫效应。上述研究为揭示HN、Apoptin的抑瘤和免疫调控机理提供了有价值的参考数据。
刘扬[3]2012年在《CRAd.pEgrl-Trail联合放疗对人乳腺癌细胞杀伤效应的实验研究》文中进行了进一步梳理近年来，恶性肿瘤发病率逐年提高，已经成为严重威胁人类健康的疾病。根据世界卫生组织的报告，2008年的癌症死亡人数达760万例（约占所有死亡人数的13%），预计全世界癌症死亡人数将继续上升，到2030年将超过1310万例。目前，我国每年新发恶性肿瘤病人220万例，死亡160万例，其生存率和治愈率仅为13%。尽管有多种方法来治疗和预防癌症，但其仍是全球的主要死因，肿瘤的治疗已经成为亟待解决的课题之一。传统的肿瘤治疗方法主要为手术、放疗和化疗等，但是单一的治疗手段都存在着自身的局限性，达不到最佳的治疗效果；恶性肿瘤也往往伴随着病情的发展，随时存在转移播散的可能。因此，采用多种手段联合治疗肿瘤已成为目前研究领域的热点。肿瘤基因–放射治疗与临床实践的密切结合，既减少了正常组织的放射损伤，又增加了外源基因的表达；尤其是，由于某些肿瘤的辐射抗性，患者耐受性有限，很难应用较大剂量的照射，通过与基因治疗结合，降低了辐射剂量，并减轻了射线的毒副作用。本研究成功构建了重组腺病毒质粒pAd-Egr1-Trail-hTert-E1A-E1Bp-E1B55K，并成功包装为CRAd.pEgr1-Trail，该病毒具有肿瘤细胞内靶向增殖及辐射诱导基因表达增强的特性，联合照射对人乳腺癌MDA-MB-231细胞具有明显的生长抑制和促其凋亡的作用，其机制为死亡受体途径的Trail、DR5、caspase-8和-3共同作用的结果。本研究为肿瘤综合治疗提供了新的途径，并提供了实验基础和理论依据。
梁旻[4]2004年在《针对原发性肝癌的新型重组腺病毒基因治疗》文中研究表明在本课题的研究中我们构建了一系列条件复制性腺病毒载体,其主要特征是删除了 5 型腺病毒 E1 区基因,代之以经过结构优化的甲胎蛋白启动子基因,在其上游插入基因调节序列 HS4,在其下游插入腺病毒的 E1A 基因、报告基因 AP或治疗基因 TRAIL,这些插入的外源基因的表达由隔离子和甲胎蛋白启动子共同调控。通过这一系列的重组腺病毒载体,研究 E1A 基因在溶瘤性腺病毒载体中的作用,研究由甲胎蛋白启动子调控的溶瘤性腺病毒载体对表达甲胎蛋白的原发性肝癌细胞的特异性杀伤作用,研究上游调控基因对外源启动子的特异性及启动活性的调控作用,研究由肿瘤特异性的溶瘤性腺病毒载体表达治疗性基因对肿瘤细胞的特异性治疗作用。 为研究 E1A 基因在溶瘤性腺病毒载体中的作用,我们构建了 Ad.IR-AP 载体和 Ad.IR-AP/E1A 病毒,体外细胞试验表明,E1A 的表达可以促进 Ad.IR-AP/E1A腺病毒载体在体外培养细胞中的复制以及对肿瘤细胞的致细胞病变作用。将Ad.IR-AP/E1A 病毒通过静脉给药方式注射入荷瘤动物体内,结果显示 E1A 基因的表达可以有效的促进腺病毒载体在肿瘤细胞中的复制与病毒在肿瘤细胞间的播散。 为研究甲胎蛋白启动子调控的腺病毒载体在分泌甲胎蛋白的原发性肝癌细胞中特异性表达目标基因,以及基因调节序列隔离子 HS4 序列对甲胎蛋白启动子特异性的调控,我们构建了 Ad.AFP-AP 和 Ad.HS4.AFP-AP 病毒载体。结果表明,在表达甲胎蛋白的原发性肝癌细胞中,由 AFP 启动子调控的腺病毒特异性的表达报告基因 AP,而在 AFP 启动子之前插入隔离子 HS4 序列可以增强重组病毒针对表达甲胎蛋白的原发性肝癌的特异性。 结合以上研究结果,我们构建了具有治疗用意义的重组溶瘤腺病毒载体Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL, 利用特异性针对表达甲胎蛋白的原发性肝癌细胞的溶瘤腺病毒载体表达治疗基因 TRAIL,以达到增强治疗原发性肝癌的特异性及有效性的目的。研究结果表明,Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL 溶瘤病毒具有针对表达甲胎蛋白的原发性肝癌的特异性,在体外细胞及动物体内肿瘤模型中都可以特异性杀伤肿瘤细胞。 本研究探索了利用异源的肿瘤特异性启动子结合隔离子等基因转录调控元 4<WP=5>件调控溶瘤性腺病毒载体,在靶向组织中特异性复制病毒与表达插入的外源基因,为肿瘤基因治疗探索一种新的手段。
朴秉国[5]2011年在《表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用》文中认为本研究对具有肿瘤特异性复制和肿瘤靶向性杀伤功能的重组腺病毒Ad-HP和Ad-HT的肝癌(BEL-7402)抑制作用进行了探讨。本研究首先利用MTT染色等方法,探讨了Ad-HT和Ad-HP对体外培养的人肝癌细胞BEL-7402的抑制作用。结果表明,Ad-HT和Ad-HP均可有效抑制BEL-7402细胞的增殖,且其作用在一定条件下呈现剂量和时间依赖关系。本研究利用台盼蓝染色、AO/EB染色、Annexin V染色和DAPI染色对Ad-HT和Ad-HP抑制BEL-7402细胞的方法进行了探讨。结果表明,Ad-HT和Ad-HP均可造成BEL-7402细胞的细胞膜通透性增加、细胞核凝聚、磷脂膜外翻。虽然不同检测方法所得到结果不尽相同,但仍可推断,Ad-HT和Ad-HP能够通过诱导细胞凋亡抑制BEL-7402肿瘤细胞的增殖。本研究利用流式细胞术、Western blot等方法探讨表达NDV HN基因重组腺病毒对细胞凋亡信号转导系统内线粒体膜电位、活性氧水平和Caspase酶活性等关键控制点信号分子的影响。实验结果表明,Ad-HP和Ad-HT均可不同程度的上调BEL-7402细胞Caspase酶活性和活性氧水平,并不同程度的降低BEL-7402细胞线粒体膜电位。可以推断,表达NDV HN基因重组腺病毒通过线粒体途径诱导BEL-7402细胞发生凋亡,从而体现其对BEL-7402细胞的抑制作用。本研究利用小鼠肝癌的肺转移和实体肿瘤模型探索了Ad-HP和Ad-HT在体内的抑瘤作用。结果表明,Ad-HP和Ad-HT具有减缓肿瘤组织生长速度、延长模型动物平均生存期和刺激免疫的作用。
王宏芳[6]2011年在《CRAd.pEgr1-Smac联合照射对MDA-MB-231肿瘤细胞的抑制效应》文中认为放射治疗是肿瘤治疗的重要的手段之一,但由于肿瘤临近部位正常组织的放射损伤和某些肿瘤的辐射抗拒性等问题,严重地影响着放疗的疗效和应用。肿瘤基因治疗是近年来新兴的一种肿瘤治疗技术,为肿瘤的彻底治愈带来了可能,但由于基因转导系统的低靶向性和治疗基因表达的不可控性,使基因治疗这把双刃剑尚不能替代传统的肿瘤治疗方法。肿瘤作为一种全身性疾病,其发生发展是一多因素、多步骤和多阶段的复杂过程,单一疗法往往难以取得满意疗效,肿瘤的综合治疗势在必行。肿瘤基因-放射治疗的提出为弥补放射治疗与基因治疗各自的弊端带来了可能,通过将辐射诱导性基因的调控序列与肿瘤杀伤基因相偶联,转染或感染肿瘤细胞后,在对肿瘤实施局部放疗的同时诱导肿瘤杀伤基因表达的增强,产生辐射和基因表达产物的协同抑瘤作用。该疗法一方面将放疗与基因治疗有机地结合,发挥协同作用；另一方面,由于辐射具有靶向性和可控性,实现了对杀伤基因表达的时空调控。利用具有肿瘤细胞靶向性的条件复制型腺病毒作为基因治疗的载体,提高治疗基因对肿瘤细胞的靶向性；利用Egr-1启动子在电离辐射诱导下可启动其下游基因表达的特性,提高治疗基因表达的可控性。本实验构建了对肿瘤细胞具有双重靶向的重组腺病毒质粒pAd.Egr1-Smac-hTert-E1A(CR2)-E1Bp-E1B55K,并在HEK293细胞内包装成携带Egr-1启动子和Smac基因的条件复制型腺病毒CRAd.pEgr1-Smac,研究其在x射线诱导下对MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响,以及CRAd.pEgr1-Smac联合照射对MDA-MB-231细胞中凋亡相关基因mRNA及蛋白水平表达的影响,探讨其抗肿瘤作用机制。实验结果表明,CRAd.pEgrl-Smac联合照射对MDA-MB-231细胞具有明显的增殖抑制和促凋亡作用,同时伴有细胞中Smac、Cyt c、caspase-9和-3 mRNA及其蛋白表达增高。这些结果提示,CRAd.pEgr1-Smac联合照射抑制MDA-MB-231肿瘤细胞增殖的促凋亡机制,涉及线粒体途径的Smac、Cyt c、caspase-9和-3的相互作用。本研究为提高肿瘤基因治疗靶向性、可控性及放射治疗的有效性,将基因-放射治疗有机地联合应用,为肿瘤基因-放射治疗的临床应用提供实验依据,为肿瘤综合治疗提供了新的思路。
参考文献：
[1]. 重组腺病毒H101对肝癌细胞生长抑制的实验研究[D]. 陈灵华. 浙江大学. 2003
[2]. 特异性抗肿瘤重组腺病毒抑癌作用研究[D]. 陈漉. 吉林大学. 2009
[3]. CRAd.pEgrl-Trail联合放疗对人乳腺癌细胞杀伤效应的实验研究[D]. 刘扬. 吉林大学. 2012
[4]. 针对原发性肝癌的新型重组腺病毒基因治疗[D]. 梁旻. 复旦大学. 2004
[5]. 表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用[D]. 朴秉国. 吉林大学. 2011
[6]. CRAd.pEgr1-Smac联合照射对MDA-MB-231肿瘤细胞的抑制效应[D]. 王宏芳. 吉林大学. 2011
标签：肿瘤学论文; 肝癌论文; 肿瘤论文; 肿瘤细胞论文; 基因治疗论文; 特异性论文; 腺病毒论文; p53基因论文; 启动子论文; 甲胎蛋白论文; 癌症论文;