洪鉴光
【摘 要】 目的 分析幽门螺杆菌(Hp)对左氧氟沙星耐药性及左氧氟沙星耐药菌株与敏感菌株间gyrA基因的DNA序列差异，探索gyrA基因突变在Hp左氧氟沙星耐药产生过程中的作用。方法 我院消化科2011年2月至2013年2月进行胃镜检查的慢性胃炎、消化性溃疡的患者，将胃镜活黏膜标本接种于Hp选择性培养基，37℃微需氧环境培养3-5d，分离Hp菌株，采用氧化酶试验、过氧化氢酶试验、尿素酶试验和UreA基因PCR扩增鉴定菌种。左氧氟沙星药敏试验采用E-test法，筛选出耐药菌株和敏感菌株。提取Hp菌株基因组DNA，PCR扩增gyrA基因并进行测序并分析。结果 38例临床分离Hp菌株通过左氧氟沙星E-test药敏试验，其中12例最低抑菌浓度（MIC）＞1.0ug/ml，耐药菌株占31.58%，敏感菌株占68.42%。gyrA基因测序结果显示，261、271和272位点在10例耐药菌株存在突变；C261A突变2例，C261G突变1例，G271A突变2例，A272G突变2例，C261A与G271T、A272G突变2例，G271A与A272G突变1例，而在26株敏感菌株未发现突变。结论 我院消化科分离Hp的临床菌株左氧氟沙星耐药率较高，其耐药与gyrA基因261、271和272位点有关。
【关键词】 幽门螺杆菌； 左氧氟沙星； 敏感菌株间gyrA基因； DNA序列差异
幽门螺杆菌(Helicobacter pyroli，Hp)感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，与胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤等多种消化系统疾病具有密切的关系，已被世界卫生组织列入I类致癌原[1]。而Hp的耐药性是导致Hp根除失败的重要原因，所以Hp感染的治疗是Hp研究领域中的核心问题。目前常用的抗生素如甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素都存在不同程度的耐药问题，耐药率有不断增加趋势[2]。近年来国内外Hp共识意见新推荐左氧氟沙星作为Hp根除药物，左氧氟沙星是一种新型的氟喹喏酮类抗生素，抗菌谱广、疗效高、不良反应少[3-4]。本研究采用E—test方法分析Hp在我院消化科收治病人的左氧氟沙星耐药特征，并测序分析了gyrA基因突变与左氧氟沙星耐药的关系。
材料与方法
1．实验菌株：38株Hp分离菌株来自我院消化科2011年2月至2013年2月进行胃镜检查的慢性胃炎、消化性溃疡的患者，检查前1个月内未服用抗Hp药物。
2．细菌培养：采用匀浆接种法接种。用高压灭菌过的滴管吸取标本及其转送液至1 ml匀将器中，轻轻研磨8～10次后，用灭菌滴管，吸取组织混匀液，置于分离培养基上，用接种环作分段分离，置于35℃，在5％O2、10％CO2、和85％N2的三气培养箱中培养72 h。
3．Hp菌种鉴定：挑取可疑菌落，涂片染色镜检呈革兰染色阴性，菌体细长弯曲呈螺形、S形或海鸥形，氧化酶试验阳性，过氧化氢酶试验阳性，尿素酶试验阳性。采用PCR扩增Hp的UreA基因，上游引物为5'_GCCAATGGTAAATTAGTTCC 3'，下游引物为5'-CTCCTTAATTGTTTTTACAT一3'；反应体系为10×PCR反应缓冲液5.0ul，25um dNTP 1.0ul，10um引物各1．0ul，Taq DNA聚合酶(大连宝生物技术有限公司)1．O U，模板DNA(100 ng／uL)1．Oul，加无菌去离子水至50ul。反应条件为94℃5 min；94℃ 30 s，52℃，45 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃延伸5 min，1％琼脂糖凝胶电泳30 min后，观察结果。
4．左氧氟沙星药敏试验：将Hp菌株用灭菌0．9％氯化钠溶液制成3个麦氏单位的菌悬液。使用棉签浸入菌悬液.分三个方向涂抹平皿表面。凉干10～15 min，放置E—test纸条。微需氧三气培养箱中培养3～5 d后观察结果。判断标准根据文献[5—8]，最低抑菌浓度(MIc)≥1．0ug/ml为耐药。
5．PCR扩增Hp的gyrA基因：根据J99标准菌株的基因组序列(AE001439)采用Primer 5．0
设计引物扩增gyrA基因，引物为gyrA—F：5’一TTTCTTTCAATCTTACAAA ATAAGC一3’，gyrA R：3'- ATCACCTTGTTTAGTCGCTA一5’，产物长度为1273 bp。反应体系为10×PCR反应缓冲液5．Oul，25um dNTP 1．0ul，10um引物各1．0ul，Taq DNA聚合酶(大连宝生物技术有限公司)1．0 U，模板DNA(100ng/ul)1．0 ul，加无菌去离子水至50ul。反应条件为94 C 10 min；94 ℃ l min，54℃ 1 min，72℃ 90 s，35个循环；72延伸10 min，0．8％琼脂糖凝胶电泳30 min后，观察结果。
6．基因测序与比对：将琼脂糖上特异性条带切割后采用胶回收试剂盒(Axygetl)回收，送宝生物(大连)有限公司测序。采用GeneDoc 2．7．O多序列比对与分析软件对所有测序结果与J99标准菌株的基因组(AE0()1439)的gyrA编码区第211位核苷酸开始进行序列比对分析。
结 果
1．菌株鉴定：经生化反应鉴定显示过氧化氢酶(+)、氧化酶(+)和尿素酶(+)。经过UreA基因PCR扩增在411 bp处出现特异性条带。该结果表明该38株菌均符合Hp鉴定标准。
2．左氧氟沙星药敏试验结果:38例临床分离Hp菌株通过左氧氟沙星E test药敏试验，结果12例MIC>1.0ug/ml，耐药菌株占31．58％，敏感菌株占68．42％。
3．gyrA基因测序：所有38例菌株gyrA基因扩增均出特异性条带(图1)。经测序结果显示261、271和272位点在10例耐药菌株存在突变(表1)；c261A突变2例，C261G突变1例，G271A突变2例，A272G突变2例，C261A与G271T、A272G突变2例，G271A与A272G突变1例，而在26株敏感菌株未发现突变。
讨 论
近年来国内外许多研究显示，含有左氧氟沙星的新三联疗法在Hp根除率方面与标准的三联方案比较，疗效明显增加。Nista等比较了3组HP阳性患者行根除治疗的效果，其中两组采用标准的质子泵抑制剂(PPI)三联疗法(埃索美拉唑+克拉霉素+阿莫西林／甲硝唑)，一组采用含左氧氟沙星的PPI三联疗法(埃索美拉唑+左氧氟沙星+克拉霉素)，每组病例数为100例，结果显示左氧氟沙星治疗组根除率达90．6％，与两个标准组(79．O％和77．4％)比较差异有统计学意义。Giannini等报道了169例采用含左氧氟沙星的PPI三联疗法治疗H声感染，根除率高达95％左右，虽然与不含左氧氟沙星的标准PPI三联疗法比较差异无统计学意义，但含左氧氟沙星的三联疗法不良反应发生率明显低于不含左氧沙星的标准PPI三联疗法。虽然上述研究表明左氧氟沙星对H声具有明显疗效，但最近研究表明国内外各地区不断出现左氧氟沙星耐药的HP菌株。有关H声对左氧氟沙星的耐药率国内外报道差别较大。美国的Carothers等报道为8．8％，其研究还表明左氧氟沙星耐药与既往10年内曾用过氟喹诺酮类药物有关，比利时的Bogaerts等报道为16．8％，日本的Miyachi等报道为15％，意大利的Marzio等报道为10％～30％。有研究显示氟喹诺酮类药物原发耐药很少，而获得性耐药相当多见，各国报道的左氧氟沙星耐药率的不同可能与既往使用氟喹诺酮类药物的情况不同有关。而在我国各地区HP左氧氟沙星耐药情况也不一致，Hp对左氧氟沙星的耐药率北京29．1％．上海3．8％，西安21．7％(13/60)_1]。在本研究中分离38例临床HP菌株中有12例左氧氟沙星耐药，达31．58％，与北京地区相似；分析其原因可能由于本地区喹诺酮类药物使用较多引起的继发性耐药，因此本地区的在使用左氧氟沙星治疗HP感染患者时应考虑患者既往使用喹诺酮类抗生素的情况。
gyrA基因位于细菌染色体第38分位，编码DNA解旋酶A亚基；该基因核苷酸存在一定的保守区，尤其是编码122位氨基酸周围的区域。gyrA基因耐药突变范围主要集中在67～106位氨基酸的区域，该区的核苷酸变化是在细菌喹诺酮类药物方面具有十分重要的作用。虽然关于gyrA基因在其他革兰阴性细菌左氧氟沙星耐药突变的报道已经很多，但在Hp中的研究最近才开始起步，在本研究中在10例耐药菌株存在突变，C26lA突变2例，C26lG突变1例，以上两种突变均使87位氨基酸天冬酰胺突变为赖氨酸；G271A突变2例，该突变使91位氨基酸天冬氨基酸突变为天门冬酰胺，A272G突变2例。该突变使91位氨基酸天冬氨基酸突变为甘氨酸；C26lA与G27lT、A272G双突变2例，G271A与A272G双突变1例，而在26株敏感菌株未发现突变，该结果与Bogaerts等[12]报道结果相似，但未发现其他位点突变，可能说明本地区Hp的gyrA基因在这三个位点存在聚集性突变，应该进一步加大样本量进行流行病学研究。该研究结果显示，gyrA基因该区段突变可能是造成Hp耐受左氧氟沙星治疗的重要机制，从而进一步推测左氧氟沙星可能通过该区段结合Hp的gyrA基因，从而干扰Hp基因组复制，因此该区段发生突变导致氨基酸替代造成gyrA蛋白空间构象改变，使左氧氟沙星不能结合gyrA基因，进而不能抑制Hp基因组复制，使Hp继续生长繁殖，最终出现左氧氟沙星耐药。因此gyrA基因该区段的突变不仅对预测Hp左氧氟沙星耐药而且对Hp的个体化治疗方案的制定具有重要意义。
参考文献
[1]胡伏莲．中国幽门螺杆菌耐药研究现状．胃肠病学和肝病学杂志，2008；17：51 7 518．
[2]Kim JM，Kim JS，Jung HC，et a1．Distribution of antibiotic MICs for Helicobacter pylori strains over a 16-year period in patients from Seoul，South Korea.Antimicrob Agents Chemother，2004，48：4843 4847．
[3]Malfertheiner P，Megraud F，O'Morain C,eta1.Current concepts in the management of Helicobacter pylori infection：the Maastricht HI Consensus Report．Gut，2007，56：772—781．
[4]中华医学会消化病分会幽门螺杆有学组／幽门螺杆科研协作组．第三次全国幽门螺杆茵感染若干问题共识报告．胃肠病 学，2008，13：42 46．
论文作者:洪鉴光
论文发表刊物:《中华临床医师杂志》(电子版)2016年2月第4期
论文发表时间:2016/7/14
标签：氧氟沙星论文; 菌株论文; 突变论文; 基因论文; 幽门论文; 引物论文; 螺杆论文; 《中华临床医师杂志》(电子版)2016年2月第4期论文;