一、CD45—淋巴细胞活化的重要调节分子（论文文献综述）
杨景[1]（2021）在《老年人群接种四价灭活流感病毒裂解疫苗免疫机制的系统生物学研究》文中认为季节性流感病毒（Seasonal Influenza Viruses）感染引起的患病和死亡,极其容易发生在老年人群和慢性肺部疾病患者。60岁及以上老年流感患者具有较高并发症风险,譬如脑炎、肺炎甚至恶化慢性心肺疾病相关的基础疾病。世界范围流行的季节性人流感是由A/H1N1、A/H3N2和B型流感病毒引起的。流感病毒基因组包含八个RNA片段,其中两个RNA片段编码两个包膜蛋白,分别为血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。国内目前上市的常用抗流感病毒药物如奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦,均属于神经氨酸酶抑制剂。然而,最为安全长效、公共卫生获益最大的抗病毒防御,需要各年龄人群按时接种季节性流感病毒疫苗,特别是具有高感染风险的老年人群。流感病毒疫苗的免疫原性和有效性评价采用血清学检测血凝素抑制实验（Hemagglutinin Inhibition Test,HAI）,特异性抗体的评价标准低估了流感病毒疫苗在老年人群中的获益情况。老年人群接种流感病毒疫苗将流感发病率降低,同时降低了住院率、减少了并发症和死亡率。然而,季节性流感疫苗虽然每年更新和接种,疫苗保护效果不如预期。一方面,流行季循环野毒株和疫苗株的不匹配;同时,老年人群疫苗接种率低;另一方,老年人群因免疫衰老出现免疫系统对流感疫苗的免疫反应下降。目前,国家人口统计局数据显示中国在迅速老龄化,截止2020年1月,有2.5388亿名60岁及以上老年人占国家总人口数的18.1%,预计在2030年老龄人口占比将达到26%。这将使流感病毒感染在老年人中造成极其沉重的疾病负担,但可以通过接种疫苗来减轻或防控。然而,在国内老年人群流感病毒疫苗接种率远低于2010年世界卫生大会提出的75%的疫苗接种覆盖率目标,仅有4%。较多因素造成老年人群疫苗接种率较低,包括政策、个人经济水平、受教育程度和健康意识等。此外,老年人群疫苗免疫后产生的流感病毒特异性抗体水平较18～60岁的成年人低,记忆B细胞和长寿浆细胞也出现显着减少。免疫衰老（Immunosenescent）,成为针对60岁及以上老年人群开发新的或更有效的流感病毒疫苗的主要挑战。免疫衰老表现出免疫功能的下降和各种传染性疾病的风险增加。因此,了解免疫衰老的老年人群免疫灭活四价季节性流感病毒裂解疫苗（QIVs）免疫机制,涉及外周血转录组、T淋巴细胞、主要细胞因子和免疫球蛋白在QIVs免疫前后动态特征,有助于发现老年人群免疫中与年龄、性别相关的变化是如何导致这种风险以及出现针对流感疫苗的弱体液免疫反应。事实上,现在人们普遍认为,疫苗接种后测定HAI滴度并不能全面反映老年人群的疫苗保护效果。此外,抗体反应弱或无的老年受试者每年接种疫苗,对流感的保护效果也出现提高,这表明细胞免疫机制可能对老年人的保护也很重要。最早的,2009年Querec等研究人员将系统生物学的方法应用于黄热病毒疫苗的机制研究中,并由此衍生出系统疫苗学的概念。鉴于传统疫苗研究基于体液免疫反应,缺乏对疫苗细胞免疫的认识。此外,QIVs疫苗免疫机制是网络化、多维度的,本研究采用系统生物学研究的方法,将从多个维度,借助高通量检测手段和计算机生物信息学分析关联传统疫苗学研究的特征指标,鉴定QIVs疫苗接种后在老年人群中建立有效免疫保护的重要生物分子和信号途径,筛选出与疫苗有效性、免疫反应性和持久性相关的枢纽基因,以期寻找疫苗有效性评价的替代生物标志物,加速疫苗临床研究进展。因机体免疫机制的复杂性,将从多个维度剖析老年人群QIVs免疫机制。本研究首先采用高通量测序RNA-Seq手段获取16名人口学和免疫特征具有显着差异老年受试者的转录组数据,随后进行整合关联分析。并采用不同生物信息学分析手段,首先通过基于生物学特征驱动（Biology-Driven）的配对比较聚类分析,老年女性和老年男性在QIVs免疫过程中因性别差异化表达基因和信号通路。随后,通过基于数据驱动（Data-Driven）的权重基因共表达网络分析（WGCNA）,将差异化表达基因按表达模式聚类,并将聚类的基因集关联性状特征（受试者人口学及免疫反应特征）分析,最终鉴定出影响性状特征的关键核心基因（Hub Gene）。此外,通过荧光定量qRT-PCR验证枢纽基因的表达特征与转录组结果一致。鉴于转录组RNA-Seq仅是从RNA分子水平阐明老年人群免疫QIVs的机制,为了解细胞介导QIVs免疫的动力学特征,本研究接着采用高通量多色流式细胞术分析了人口学性状及QIVs免疫反应特征明显的17名60周岁以上老年受试者的外周血PBMC标本详细的T细胞亚群免疫表型,并将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄（Age）、性别（Sex）和疫苗相关反应原性（QIVsrelated reactogenicity）。最后,我们使用高通量多重细胞因子检测技术分析了以上老年受试者的外周血血浆样本中具有细胞免疫和体液免疫代表性的细胞因子与免疫球蛋白Ig,同样将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄（Age）、性别（Sex）和疫苗相关反应原性（QIVs-Related Reactogenicity）。确定了不同性状特征老年受试者QIVs免疫前后细胞因子网络及主要免疫球蛋白Ig的动力学特征,以期了解细胞因子在细胞免疫中发挥的作用。第一部分:通过RNA-Seq获得老年人群QIVs免疫前后转录组数据进行生物信息学分析1.性别因素对老年人群QIVs免疫效果的影响临床数据显示,流感疫苗免疫应答存在性别差异,该研究旨在鉴定出差异表达基因（DEGs）造成老年人群接种四价灭活流感疫苗出现免疫相关的性别偏倚。以60～80岁的健康成年人为对象,对接种前后的基因表达情况进行分析。受试者体液免疫水平采用血凝抑制实验检测特异性抗体滴度HAI,并分析两个性别群体差异基因表达谱与体液免疫的相关性。在老年女性中,参与I型干扰素信号通路和经典通路补体激活的DEGs在流感疫苗接种3天内出现上调。在第28天,显示老年男性偏倚模式的免疫反应与调控蛋白质加工处理以及补体活化的经典途径相关。通过生物特征驱动聚类方法确定了与老年女性和男性对QIVs接种不同反应相关的一系列DEGs。老年女性对QIVs具有更强的免疫反应,但抗体半年后出现迅速下降,而老年男性具有维持持久反应的优势。此外,我们还发现了可能导致老年人接种流感疫苗性别变异的基因。我们的研究结果强调了开发个性化季节性流感疫苗的重要性。2.枢纽基因MCEMP1和SPARC分别驱动QIVs免疫不良反应事件发生与维持有效抗体深入了解潜在的候选中心基因可能有助于产生安全有效的季节性流感免疫,以及开发针对流感病毒感染高危老年人群的个性化流感疫苗。本研究旨在通过加权基因共表达网络分析,确定与2018/19季节四价灭活流感病毒疫苗免疫诱导过程相关的潜在中枢基因。从16名老年人的63份全血样本中,共获得13345个基因,分为8个共表达模块,其中两个模块与疫苗诱导的免疫应答显着相关。功能富集分析后,利用GO条件下的疫苗相关免疫基因构建hub基因的子网络,进行hub基因的鉴定和功能验证。MCEMP1和SPARC被证实是影响QIVs诱导免疫的中心基因。在接种后7天内,MCEMP1的表达量与QIVs相关的反应性呈负相关,CXCL8/IL-8可抑制MCEMP1的表达,颗粒酶-B细胞毒介质可加剧MCEMP1的表达量。同时,SPARC的表达增加了对QIVs的免疫应答,并有助于持续的保护性体液抗体滴度。这两个基因可用于预测QIVs诱导的不良反应、免疫反应的强度以及体液抗流感抗体的持续时间。这项工作为进一步研究开发个性化的QIVs提供了线索,这些QIVs具有适当的免疫反应和对即将到来的季节性流感的持久免疫。第二部分:老年人群QIVs免疫前后T淋巴细胞分布及动力学特征衰老产生的细胞免疫损伤,表现为胸腺退化及T淋巴细胞输出减少为主的免疫系统随年龄变化特征。然而,缺乏老年人群接种QIVs前后外周血T淋巴细胞亚群的详细分布特征研究。本研究旨在确认老年人群T淋巴细胞分布特征,并比较不同性状和免疫状态分组（包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应）的T细胞亚群动力学特征差异。本研究随机筛选的60名老年受试者中,分析受试者性状涉及人口学基线特征和免疫前预存流感病毒抗体水平,其中17名受试者具有显着性状差异被选取用于鉴定老年人群外周血T淋巴细胞衰老表型的特征。通过10色高通量流式细胞术检测分析外周血T细胞亚群的详细分布特征。计算各T细胞亚群占亲本比例,并进行不同性状和免疫状态分组比较,包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应。受试者人口学特征和基线特征基本一致,血常规检测淋巴细胞数量在正常范围。按照年龄分组比较T细胞亚群分布差异,CD8+PD1-CD57-T细胞亚群在高龄组M65yrs Group中显着更高,而CD8+PD1+CD57+T细胞亚群显着低于低龄组。CD8+CD27-CD28+T细胞亚群在高龄组M65yrs Group中显着更高但频数在免后两年龄组均出现显着降低,而两年龄组中CD27+CD28+/-T细胞在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中均在QIVs免后显着增加。两年龄组中TCMs在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中均在QIVs免后显着减少,而TNs则在QIVs免后显着增加。按照性别分组比较T细胞亚群分布差异,总T（CD3+）和CD4+T细胞的比例在老年女性受试者中较老年男性高,其中CD4+在免后Day180具有显着性别差异免后Day180,CD27+CD28+T细胞比例在老年女性受试者中显着高于老年男性。在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中,不同性状特征和免疫反应特征的老年人群间差异较小。然而,更详细的通过耗竭表型分子（PD-1）、衰老表型分子（CD57）、共刺激分子（CD27和CD28）以及T细胞效应记忆表型分子（CD45RA和CCR7）,发现QIVs免疫前后不同性状特征和免疫反应特征的老年人群间存在显着差异。第三部分:老年人群QIVs免疫反应主要细胞因子与免疫球蛋白Ig产生及动力学特征细胞因子（Cytokines）和趋化因子（Chemokines）是具有生长、分化和激活功能的冗余分泌型蛋白,调节并决定免疫反应的性质,控制免疫细胞的迁移以及免疫器官中细胞的排列。最初针对免疫损伤产生的细胞因子种类,便决定了免疫反应的发生,甚至随后的免疫反应发展结局特征是细胞毒性的、体液免疫、细胞介导的免疫还是过敏性的。因此,本研究旨在确认老年人群免疫反应相关主要细胞因子、免疫球蛋白Ig的水平特征,并比较不同性状和免疫状态分组（包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应）的主要细胞因子、免疫球蛋白Ig动力学特征差异。在本研究中,我们使用高通量多重细胞因子检测技术,针对人口学特征及QIVs免疫反应特征明显的18名60周岁以上老年受试者的血浆样本,定量检测具有细胞免疫和体液免疫代表性的细胞因子与免疫球蛋白Ig浓度,并将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄（Age）、性别（Sex）和疫苗相关反应原性（QIVs-Related Reactogenicity）。受试者人口学特征和基线特征基本一致,常规体检显示身体状况良好。按照年龄分组比较,IL-5在免前高龄组M65yrs Group中显着高于低龄NM65yrs Group,并在免后出现显着减少。Granzyme-B在免后低龄NM65yrs Group中显着高于高龄组M65yrs Group,免后两年龄组均出现显着增加。按照性别分组比较,IL-6在免后Day3,Female Group组中显着高于Male Group,随后Day28显着减少。IL-2在免后Day180,老年女性Female Group中显着高于老年男性组Male Group。按照免疫QIVs有无不良反应分组比较,免前,IL-12分泌在GR Group显着高于NGR Group。IL-18和IFN-alpha在QIVs免疫后Day 28,均在GR Group具有显着更高的表达。此外,Granzyme-B在免后Day 03,GR Group表达显着高于NGR Group。许多细胞因子同时具有促炎和抗炎潜能,观察到哪种活性取决于存在的免疫细胞及其对细胞因子的反应状态。体液免疫相关细胞因子IL-5和细胞毒作用相关Granzyme-B具有明显的年龄差异。同时,在QIVs免疫后,显着高表达的细胞因子IL-6和IL-2,证明了老年女性组具有更高的流感病毒特异性的细胞毒性CD8+T细胞以及CD4+记忆T细胞。
孙琳[2]（2021）在《1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究》文中研究指明研究目的:1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus,T1DM）是一种由遗传因素和环境因素共同诱导,细胞免疫及体液免疫共同介导胰岛β细胞损伤的自身免疫性疾病,在儿童和青少年中更为常见。近年来,流行病学研究表明,我国T1DM发病率明显增加,而患者进行性的胰岛功能下降导致其需要终身应用胰岛素治疗,鉴于其逐年增长的发病率和随之出现的多系统并发症,T1DM已成为重大的公共卫生挑战。目前,T1DM的发病机制尚未完全明确,T细胞相关的研究一直是1型糖尿病的研究热点,而近年来除了CD4+T细胞,越来越多的研究表明CD8+T细胞在1型糖尿病的发病进程中有着重要作用。淋巴细胞活化信号分子家族（signaling lymphocyte activated molecular family,SLAMF）被报道在多种免疫异常疾病中表达异常,并显着影响包括CD8+T细胞在内的免疫细胞分化及功能。然而对T1DM免疫细胞表面SLAMF分子的表达情况未被报道,且对于T1DM中SLAMF分子如何通过影响CD8+T细胞功能仍不明确。为探讨这一问题,本课题通过对T1DM患者及非肥胖的糖尿病小鼠模型（non-obese diabetic,NOD）免疫细胞分化情况及SLAMF分子表达情况进行分析,并进行mRNA测序及相关的体外细胞实验,以期探讨T1DM免疫系统异常分化及SLAMF分子表达对T1DM免疫微环境下CD8+T细胞功能和命运的影响。研究方法:（1）对T1DM患者及健康对照组（health control,HC）的一般临床资料进行统计,利用流式细胞分析法对外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中T细胞及其亚群、NK细胞及其亚群、B细胞等免疫细胞比例进行分析,并检测T细胞、B细胞和NK细胞表面SLAM分子家族的表达情况;（2）利用流式细胞分析法对T1DM患者外周血中T细胞SLAMF4分子表达及促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-a的分泌情况进行检测,分析SLAMF4分子与细胞活化状态和细胞因子分泌能力之间的相关性;分析SLAMF4分子表达与1型糖尿病一般临床资料的相关性;（3）对自发性1型糖尿病小鼠模型NOD小鼠进行体重、随机血糖监测及小鼠尾静脉采血,对小鼠胰腺组织留取病理,进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosi,HE）染色,观察其组织细胞形态、炎细胞浸润情况;用流式细胞分析法检测小鼠外周血免疫细胞分化及外周血、胰腺引流淋巴结CD8+T细胞表面SLAMF4分子表达情况;（4）采用流式细胞分选技术得到纯化的T1DM患者的SLAMF4+CD8+T细胞和SLAMF4-CD8+T细胞,并进行mRNA转录组测序,分析差异表达基因的分布及临床意义;（5）应用免疫磁珠分选技术分选脐带血细胞中CD8+T细胞,在体外给予抗CD3/CD28单克隆抗体刺激下进行培养,检测作用不同时间CD8+T细胞表面SLAMF4分子表达情况;（6）采用磁珠分选联合流式细胞分选技术正常健康人SLAMF4阳性CD8 T细胞和SLAMF4阴性CD 8 T细胞分别进行分选,在体外给予抗CD3/CD28单克隆抗体的刺激下进行体外扩增,用CFSE标记细胞,检测细胞增殖情况,并于Day6检测两种细胞的凋亡情况。研究结果:（1）T1DM患者外周血PBMC中免疫细胞比例与HCs比较存在异常,表现为CD4+T细胞和B细胞比例增多,Treg细胞的比例降低,总NK细胞及其CD56dim亚群的NK细胞比例减低,CD56bright亚群的NK细胞比例升高。与HCs相比,T1DM患者外周血PBMC中SLAMF4阳性的总T细胞百分比降低,且SLAMF4阳性的CD8+T细胞明显降低;SLAMF3分子表达在B淋巴细胞比例有所降低,SLAMF5在NK细胞表面表达升高,差异均有统计学意义。（2）T1DM患者T细胞表面SLAMF4分子表达与细胞活化的状态有关,且与SLAMF4阴性CD8+T细胞相比,SLAMF4阳性CD8+T细胞具备更强的分泌促炎因子IFN-γ和TNF-a的能力;在与T1DM相关的一般临床指标的分析中,发现SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比与糖化血红蛋白水平及T1DM病程呈负相关。（3）与同周龄的Balb/c小鼠相比,NOD小鼠CD4+T细胞及CD4+CD25+的调节性T细胞百分比明显降低,随着NOD小鼠1型糖尿病的发生发展,SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比逐渐下降,且明显低于对照Balb/c小鼠。（4）mRNA转录组测序结果表明,1型糖尿病中SLAMF4作用后的CD8+T细胞表现出多个信号通路的异常改变,包括T细胞受体信号相关的信号通路、细胞因子分泌及细胞凋亡通路,差异表达的基因中也有多个与凋亡相关的基因,说明SLAFM4在1型糖尿病中调控CD8+T细胞的活性与命运。（5）通过体外培养人脐带血CD8+T淋巴细胞发现,一定程度的抗原刺激可促进SLAMF4在脐带血na?ve CD8+T细胞表面上调表达,随着免疫活化的时间延长,SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比逐渐下调。（6）通过SLAMF4阳性CD8+T细胞和SLAMF4阴性CD8+T细胞经CFSE标记后体外培养,发现SLAMF4阴性CD8+T细胞对抗CD3/CD28单克隆抗体的TCR刺激更敏感、更易扩增,增殖能力强,而SLAMF4阳性CD8+T细胞更容易凋亡。研究结论:（1）T1DM患者外周血PBMC中免疫细胞分化比例与HCs相比存在异常,且外周血T细胞及B细胞表面多种SLAM分子表达水平发生变化,结合课题组前期结果,这在T1DM及T2DM之间存在一定共性和不同之处。（2）与HCs相比,T1DM患者SLAMF4阳性CD8 T细胞百分比显着下降,且SLAMF4分子表达与细胞活化的状态及促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-a的分泌有关。在T1DM患者中,SLAMF4+CD8+T细胞百分比与患者的糖化血红蛋白水平和1型糖尿病病程呈负相关。（3）在动物模型中我们发现NOD小鼠也存在外周血T细胞异常分化状态。且随着NOD小鼠1型糖尿病的发生发展,SLAMF4阳性CD8+T百分比逐渐下降,明显低于对照Balb/c小鼠。（4）SLAMF4分子表达与1型糖尿病患者CD8+T细胞功能调控及凋亡显着相关,SLAMF4阳性的CD8+T细胞增殖能力较差且更容易凋亡,故体内持续抗原刺激会导致表达SLAMF4的CD8+T细胞的百分比降低,使其发挥类似调定点作用。综上所述,本课题首次分析了T1DM疾病模型中的SLAMF分子家族的表达谱,为SLAMF分子与T1DM免疫细胞的调控提供了实验证据,证实了在1型糖尿病免疫微环境中SLAMF4表达对CD8+T细胞的功能影响和命运的调控及SLAMF4阳性CD8+T细胞比例变化的具体机制,提示SLAMF4分子可能为T1DM的早期诊断,临床分期或免疫干预提供新靶点。
李兰洲[3]（2021）在《基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性及促造血功能的研究》文中提出胸腺肽类药物在恶性肿瘤的临床治疗常作为免疫调节剂与化疗药物联合使用。临床数据显示,胸腺肽类药物的使用提升了恶性肿瘤患者存活率和生活质量。胸腺肽注射制剂在使用中容易引起严重的过敏等副作用,而胸腺肽肠溶片虽然安全性更高,但也存在药品标准简单,质量控制项少等问题,且其相关研究较少,临床定位模糊,作用机制不明确。本研究以胸腺肽肠溶片原料药小牛胸腺肽（CTP）作为研究对象,对其物质基础进行测定,并通过免疫低下小鼠模型,B6/JGpt-Apcem1Cin（Min C）/Gpt基因型（APC）原发性结直肠癌小鼠模型,造血体外细胞模型和造血功能障碍小鼠模型,对CTP的免疫调节活性,基于免疫调节活性的抗结直肠癌活性和促造血活性及其作用机制进行研究。首先测定了CTP的分子量及分子量范围,17种氨基酸及5种核苷酸含量。结果显示CTP中分子量在100-800道尔顿（Da）之间有69.15%的组分,CTP的数均分子量为222 Da,重均分子量为998 Da。同时发现CTP中既含有大量的必须氨基酸,如:60.24 g/kg的赖氨酸和49.46 g/kg的亮氨酸,又含有大量的非必需氨基酸,如:86.82 g/kg的谷氨酸和55.67 g/kg的天冬氨酸。5种核苷酸中CMP以49763.19 mg/kg的含量占据绝对优势地位。其次,通过75 mg/kg环磷酰胺（CTX）建立免疫低下小鼠模型,通过测定小鼠自然杀伤（NK）细胞杀伤活性,淋巴细胞转化活性,免疫球蛋白（Ig）及细胞因子含量,对CTP免疫调节活性进行研究。结果显示CTP有效地缓解了免疫低下小鼠体重的降低,提高了小鼠NK细胞杀伤活性和淋巴细胞转化活性,提高了Ig A,Ig G,Ig M,白细胞介素（IL）-2,IL-6,肿瘤坏死因子α（TNF-α）,干扰素（IFN）-α和IFN-γ的含量,并降低了IL-10的含量。再次,在APC小鼠模型中,通过比较肿瘤形态变化及组织病理学,流式细胞术,肠道菌群测定,ELISA测定及western blot分析等技术,对CTP基于免疫调节的抗结直肠癌活性及作用机制进行研究。结果显示CTP作用有效地抑制了APC小鼠结直肠肿瘤的发展,限制了肿瘤组织中血管网络的建立,并有力地保持肠道细胞正常形态,说明在APC小鼠体内,CTP确实发挥了抑制结直肠癌的作用。CTP提高了APC小鼠外周血中NK细胞（CD3e-NK1.1+）和活化T淋巴细胞（CD3e+CD28+）的数量,提高了小鼠脾脏和肿瘤组织中CD4+、CD8+T细胞数量和辅助性T细胞（T helper cells,Th）1/Th2细胞比例。此外CTP作用显着提高了IL-2,IL-12,Toll样受体（TLR）4,TLR5含量,降低了IL-4,IL-10,转化生长因子β（TGF-β）含量,有效地提升了APC小鼠肠道菌群物种组成数量、种群丰度及均匀度,有效地降低了APC小鼠肿瘤及脾脏组织中细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）,程序性细胞死亡蛋白1（PD1）和程序性细胞死亡蛋白配体（PD-L）1含量,升高了小鼠脾脏中IL-2含量及Calcineurin A/活化T细胞核因子1（NFAT1）通路蛋白和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/核因子κB抑制剂激酶（IKK）/核因子κB（NF-κB）p65通路蛋白的活化水平。最后选用K562细胞和CHRF细胞作为体外模型,通过XTT测定,流式细胞术凋亡测定,联苯胺染色,western blot分析等,在体外模型中初步确定CTP促造血活性。并通过100 mg/kg CTX建立造血功能障碍小鼠模型,模拟化疗引起的骨髓损伤相关的造血功能障碍。通过外周血细胞分析,组织病理学分析,骨髓细胞流式细胞术分析,蛋白质组学联合ELISA测定技术对造血相关细胞因子进行分析,western blot分析等,在体内水平对CTP促造血活性及作用机制进行研究。体外细胞实验显示,CTP作用在增强K562细胞和CHRF细胞增殖活性的同时,也促进了细胞分化,增加了K562和CHRF细胞中磷酸化（P）-细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2、P-核糖体蛋白S6激酶（RSK）1 p90、c-Myc和ETS转录因子ELK1（ELK1）等增殖分化相关蛋白的表达,证实CTP可通过调节增殖分化实现体外促造血作用。在造血功能障碍小鼠中,CTP促进了小鼠外周血中白细胞（WBC）,嗜酸性粒细胞（EO）,中性粒细胞（NE）等血细胞数量及血红蛋白含量的增多,并促进小鼠骨髓形态结构的重建及骨髓中B淋巴细胞,造血干细胞（HSCs）和造血祖细胞（HPCs）的增多,同时增加了小鼠体内IL-2,IL-4,粒细胞集落刺激因子（G-CSF）,巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）等细胞因子水平,限制了IL-17,CCL1,单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）,TNF-α,IFN-γ等细胞因子的释放,显着升高了ERK1/2,PI3K,AKT和信号转导与转录激活因子3（STAT3）的磷酸化水平及G-CSF,粒细胞集落刺激因子受体（G-CSFR）,M-CSF,NFAT1和IL-2的蛋白水平。以上结果表明:（1）CTP作为小分子多肽类物质,可以提高免疫低下小鼠体内免疫相关细胞因子水平,并提高了小鼠杀伤性免疫细胞的活性;（2）CTP通过调节肠道菌群,调控IL-2相关通路蛋白活化,降低免疫检查点作用,增加T淋巴细胞和NK细胞介导的免疫杀伤反应实现抗结直肠癌活性。（3）CTP能够通过调节G-CSF、M-CSF和IL-2水平及其相关通路蛋白变化,促进骨髓完整性重建和造血功能细胞增多,从而发挥促造血作用。本文研究内容将为CTP药物质量标准提升提供科学数据支持,并有助于确定CTP药物作用机制,明确其临床适用症,为基于CTP开发抗肿瘤或促造血药物提供科学的数据支持。
白玲[4]（2021）在《CpG 685针对不同类型急性B淋巴细胞白血病的作用及其差异分子机制的研究》文中指出背景:急性B淋巴细胞白血病（B-cell Acute lymphoblastic leukemia,B-ALL）的免疫治疗发展迅速,使复发难治B-ALL的有效率从30%提高到90%;但由于其副作用和疗效仍然有限而限制了其应用。因此,寻找减少毒副作用和延长生存期的新策略至关重要。TLR9激动剂作为一种免疫佐剂在抗肿瘤治疗中已显示出良好的安全性和有效性,其不仅具有免疫调节作用,对于肿瘤细胞也具有直接作用。它能够在增强抗肿瘤免疫的同时影响肿瘤的抑制性免疫微环境,从而促进免疫系统更好地识别肿瘤,实现“冷肿瘤”向“热肿瘤”的转变。然而,既往的研究主要集中在其免疫调节方面,而对于肿瘤的直接作用常被忽略,尤其是对于B-ALL的直接作用尚无报道。通过我们前期研究发现:TLR9激动剂能够抑制B-ALL增殖、诱导凋亡、促进细胞周期阻滞而清除B-ALL,但对于不同类型B-ALL的作用具有异质性。因此,明确TLR9激动剂在不同类型B-ALL患者中的作用及分子机制,可能有助于发掘TLR9激动剂治疗有效的生物标志物和患者特征,优化B-ALL的精准治疗。研究目的:1.明确TLR9表达与B-ALL患者临床病理特征及预后的关系;2.探索CpG 685对B-ALL的作用;3.探讨CpG 685诱导B-ALL细胞凋亡的分子机制,发掘治疗有效的关键生物标志物;4.寻找针对不同类型B-ALL的治疗策略以及CpG 685应用有效的预测标志物。研究方法：1.通过实时定量RT-PCR和流式细胞术检测TLR9的表达,应用统计学分析明确TLR9表达与临床病理特征及预后的关系;2.通过WST-1增殖实验、AnnexinⅤ/7-AAD凋亡检测和流式细胞术检测CpG 685在不同类型B-ALL中的作用,明确CpG 685对B-ALL细胞体外直接作用的差异;3.通过构建NCG B-ALL小鼠移植瘤模型,应用流式细胞术检测小鼠骨髓、脾脏和外周血中肿瘤负荷的变化和观察小鼠生存期,明确CpG 685对B-ALL细胞在体内的作用差异;4.通过有或无相关信号通路及关键分子抑制剂预处理,在CpG 685刺激后,应用Western Blot、蛋白纯化及免疫沉淀、免疫荧光共定位、染色质免疫共沉淀检测TLR9下游信号通路相关蛋白的表达和基因的作用位点;通过RT-PCR和实时定量RT-PCR明确通路涉及的mi RNA的表达情况;通过对其作用机制的探究,发掘CpG 685治疗B-ALL有效的预测生物标志物;5.通过Ficol密度梯度离心法分离临床样本中的外周血单个核细胞,在有或无CpG 685刺激后,明确基于细胞系发现的预测标志物在临床应用中的可行性;6.通过在BALB/C小鼠中构建肿瘤移植瘤模型,应用流式细胞术检测各种免疫细胞所占小鼠淋巴细胞的比例,明确CpG ODN对小鼠机体抗肿瘤免疫的调节情况。研究结果:1.相比于正常人的外周血单个核细胞,TLR9在B-ALL患者的外周血单个核细胞中高表达;并且,相比于TLR9低表达组,高表达组的B-ALL患者预后较好;2.CpG 685对B-ALL细胞的作用存在异质性。对于BLIN-1细胞,其能抑制增殖、诱导凋亡、促进细胞周期阻滞、上调共刺激分子及免疫调节分子、降低小鼠骨髓、脾脏和外周的肿瘤负荷、延长生存期;而对于Sup-B15细胞无明显作用;3.BLIN-1细胞中,CpG 685通过P38/P53/BAX信号通路,依赖C-MYC过表达诱导B-ALL细胞凋亡。过表达的C-MYC可以促进P53稳定,诱导P53磷酸化,增强BAX转录,并介导BAX激活相关构象改变。4.伊马替尼和CpG 685联合应用于Ph（+）B-ALL细胞逆转两药单独应用的耐药、降低小鼠肿瘤负荷、延长小鼠生存期;伊马替尼能促进BAX的激活,同时抑制C-MYC低表达的抗凋亡效应;而CpG 685通过下调mi R-21,上调PTEN,进而逆转了PI3K/AKT/m TOR通路过度激活所致的伊马替尼耐药;5.临床患者中,CpG 685可直接诱导PBMC C-MYC高表达且Ph染色体阴性的B-ALL患者的原代B-ALL细胞凋亡;6.CpG ODN能够促进B细胞、pDC细胞的增殖,抑制MDSC细胞增殖,进而增加NK细胞、T细胞的比例,促进CD8+T细胞的分化和增加Ⅰ型巨噬细胞/Ⅱ型巨噬细胞的比例,促进抗肿瘤免疫的激活。结论:1.TLR9的表达与B-ALL患者的预后相关;2.TLR9是B-ALL潜在的治疗靶点,CpG 685可通过P38/P53/BAX信号通路诱导B-ALL细胞凋亡,该过程依赖于C-MYC的高表达;3.C-MYC可能是协助预测CpG 685单药对B-ALL患者有效的预测标志物;4.而对于Ph（+）B-ALL,联合应用伊马替尼和CpG 685可逆转两药单独应用的耐药。该联合治疗不仅能直接诱导Ph（+）B-ALL细胞凋亡,还增强了B-ALL细胞的免疫原性,促进CD8+T细胞的识别。5.CpG ODN能够通过促进CD8+T细胞的分化和增加Ⅰ型巨噬细胞/Ⅱ型巨噬细胞的比例,激活抗肿瘤免疫。
韩超[5]（2021）在《Th17细胞中SOX-5介导RORγt基因新的增强子RORCE2与启动子相互作用的机制研究》文中进行了进一步梳理Th17细胞是一种CD4+辅助性T细胞（CD4+Th）的亚群,表达细胞因子IL-17A,以及IL-17F、IL-26、IL-22、IL-21和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等,这些细胞因子尤其是IL-17A是Th17细胞发挥各种生物学功能的基础。Th17细胞在多种炎症相关的疾病中发挥着非常重要的作用,例如多发性硬化（multiple sclerosis,MS）、实验性自身免疫性脑炎（Experimental autoimmune encephalitis,EAE）、类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）、肝炎（Hepatitis）、以及结肠炎（colitis）等等。因此,深入研究Th17细胞的内在分子机制对于多种炎症相关疾病的发病原理和相关防治措施的建立都具有非常重大的意义。维甲酸受体相关孤儿受体（Retinoic acid receptor-related orphan receptor-γ,RORγ,又称为RORC）基因可以编码两种不同的异构体,RORγ1和RORγ2（也称为RORγt）。目前众多的研究表明,在CD4+Th免疫细胞亚群中,RORγt仅表达于Th17细胞中,是Th17细胞特异性的关键转录因子（transcription factor,TF）。在体外实验中证实,敲除RORγt基因的CD4+T细胞中的IL-17A的表达量会迅速下降;而通过基因转染的方式过表达RORγt可恢复表达IL-17A。缺失RORγt基因小鼠的Th17细胞会发生缺陷,在构建的EAE疾病模型中,RORγt基因缺失小鼠更难发病,发病时间会延迟,疾病程度会减轻。由此可见,RORγt是Th17细胞分化、发育和发挥功能的关键转录因子。RORγt可以控制许多调控Th17细胞分化的关键基因,因此,对于RORγt基因自身转录调控机制的研究就显得尤为重要。近年来的研究已经明确RORγt基因的启动子是位于转录起始位点（transcriptional start site,TSS）-400～+151 bp的区域,但是关于RORγt基因增强子却报道不多。本课题围绕RORγt基因增强子的发现和鉴定,以及其具体的作用机制进行了深入的研究,并得到了以下三方面的结论:1.增强子RORCE2通过增强RORγt的表达促进Th17细胞的分化。我们首先利用表观遗传学方法通过对增强子相关的组蛋白修饰H3K4me2的Ch IP-seq数据进行分析,发现在小鼠RORC基因上游存在一段Th17细胞特异的1.5kb左右的候选增强子序列RORCE2;并在人的Th17细胞中RORC基因相同的位点发现了还高度表达与增强子活化相关的H3K4me1和H3K27ac表观修饰标志;体外双荧光素酶实验证实了RORCE2对RORγt启动子活性有显着地增强作用;在小鼠体内分选的Th17细胞中,利用染色质免疫共沉淀（Chromatin Immnoprecipitation,Ch IP）-q PCR进一步证实该序列还发生了与增强子活化密切相关的其他组蛋白修饰,例如H3K4me1、H3K27ac和H3ac;基于CRISPR/Cas9技术制备RORCE2敲除的小鼠,利用RT-q PCR和流式细胞技术（Flow cytometry,FCM）证实RORCE2的缺失严重影响RORγt和IL-17A的表达;在体外诱导分化模型中,通过FCM进一步发现RORCE2的缺失影响Th17细胞的分化;利用RORCE-/-和WT小鼠建立EAE疾病模型发现RORCE2的缺失显着降低了EAE疾病的严重程度。这些结果都提示了Th17细胞中RORCE2是RORγt基因的潜在增强子·,可以通过增强RORγt的表达促进Th17细胞的分化。2.SOX-5介导增强子RORCE2与RORγt基因启动子相互作用对Th17细胞的分化至关重要。增强子对于目的基因的调节依赖于染色质环（loop）的形成,其具体机制是:首先是谱系特异性转录因子与增强子结合并开放该染色质区域,然后招募其他的转录因子协同活化该增强子区域,使其发生特定的组蛋白修饰并最终被彻底激活,进而与同源基因的启动子相互作用发挥增强子的功能。为了进一步探究Th17细胞中增强子RORCE2是如何发挥作用的?我们做了如下实验:（1）首先我们发现在RORCE序列中存在8个限制性内切酶Nla III的酶切位点（TS1-8）;（2）通过染色体构象捕获技术结合定量PCR的方法（Chromatin conformation capture-q PCR,3C-q PCR）证实,无论是表达RORγt的小鼠淋巴细胞株EL4,还是FACS分选的Th17细胞,或者是体外诱导分化的Th17中,3号检测位点（TS3）相比于其他位点而言,可以与RORγt启动子存在很强的相互作用;（3）通过对增强子上转录因子结合位点的生物信息学分析以及文献提示,我们推测转录因子SOX-5可能是与增强子RORCE2相互结合进而参与loop形成调节RORγt基因表达的关键转录因子,其结合位点（SOX-5-Binding site,SOX-5-BS）位于TS3上游约50 bp;（4）通过Ch IP-q PCR证实SOX-5确实结合在SOX-5-BS与以及RORγt启动子区域;（5）通过3C-q PCR结合Ch IP的实验方法（Ch IP-loop）证实,无论是EL4还是体外分化的Th17细胞中,SOX-5都介导了TS3和RORγt启动子之间的相互作用;（6）为了进一步了解其中的机制,基于CRISPR/Cas9技术构建了RORCE上转录因子SOX-5结合位点缺失的小鼠(SOX-5-BS-deficient,SOX-5-BS-/-),结果发现SOX-5-BS的缺失导致SOX-5在SOX-5-BS上的结合显着降低,并严重破坏了TS3和RORγt启动子之间的相互作用;（7）小鼠体内实验也表明:SOX-5结合位点的缺失显着影响了RORγt和IL-17的表达,并通过影响Th17细胞的分化显着降低了EAE疾病的严重程度。这些结果都提示了Th17细胞中转录因子SOX-5介导增强子RORCE2与RORγt基因启动子相互作用对Th17细胞的分化至关重要。3.Th17细胞中SOX-5与STAT3协同诱导RORCE2的染色质开放。SOX家族转录因子通过与DNA结合可以引起染色质开放从而进行基因的转录调控,但是有研究表明,SOX家族的转录因子结合DNA后,并不能独自的招募染色质重塑复合物导致染色质结构的改变,必须依赖于结合在邻近位置上的伙伴转录因子（Partner TF）协同合作才能招募重塑复合物引起染色质的开放。基于此,我们首先利用WT和SOX-5-BS-/-小鼠,通过Ch IP-q PCR和染色质可接近性检测实验发现,SOX-5-BS缺失后,增强子RORCE2区域染色质开放程度严重下降;通过生物信息学分析发现在SOX-5-BS下游存在转录因子STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）的结合位点（STAT3 binding site,STAT3-BS）,多篇研究证实STAT3在Th17细胞的分化中至关重要,这就提示Th17细胞中我们STAT3是潜在的SOX-5的Partner TF;进一步的实验结果显示STAT3可以结合在RORCE2上,而且当SOX-5与RORCE2结合缺失后,STAT3与RORCE2的结合也几乎消失;双荧光素酶报告实验结果表明STAT3-BS的缺失严重影响了RORCE2对RORγt启动子活性的增强作用;Co-IP的结果也证实STAT3与SOX-5之间存在蛋白-蛋白之间的相互作用;此外,我们在Th17细胞中敲低（Knock down,KD）STAT3表达后发现,增强子RORCE2区域的染色质开放程度明显降低。这些结果提示我们Th17细胞中SOX-5与STAT3协同诱导RORγt基因增强子RORCE2染色质开放。综上所述,我们证实了在Th17细胞中RORCE2是RORγt基因新的增强子,它可以在转录水平上增强RORγt基因的表达从而促进Th17的分化,转录因子SOX-5与STAT3协同诱导了增强子RORCE2染色质的开放,并介导了其与RORγt基因启动子的相互作用。这项开创性的研究证实了顺式作用元件在疾病发病机制中的重要意义,该研究不仅进一步丰富了Th17细胞分化的机制,同时也为Th17细胞相关疾病的干预治疗提供潜在线索。
王亦心[6]（2021）在《利用人源化小鼠模型研究人肺脏对于甲型流感病毒感染后的免疫应答》文中进行了进一步梳理研究目的:流感病毒属于正粘病毒科,分为甲、乙、丙、丁四型。甲型流感病毒（Influenza A viruses,IAVs）是导致人类流感大流行的主要原因,对公众健康造成潜在威胁。目前对于IAVs主要的预防措施是应用流感病毒疫苗,但是由于存在抗原漂移及抗原突变的情况,使得这种方式难以发挥较好的保护作用,并且一种疫苗难以针对不同种病毒毒株进行中和。很多研究发现组织定居记忆性T细胞（Tissue resident memory T cells,Trm cells）可能对于抵抗流感病毒感染有一定的作用,因此近些年针对于T细胞疫苗的研究也逐渐开展。甲型流感病毒的研究主要依赖于小鼠模型,但小鼠的肺组织结构及细胞比例与人肺脏存在一定的差异,因此小鼠的肺脏在感染后的免疫变化可能无法完全反应在人肺中的情况。而轻、中度流感病毒患者的肺组织样本往往难以取材,多数样本来源于癌旁组织及器官捐献,这些样本难以进行流感病毒感染期间肺内免疫细胞的动态观察研究。因此我们在给NCG免疫缺陷小鼠重建人的免疫系统（human immune system,HIS）的基础上,同时在鼠背部皮下移植同源HL组织,建立人免疫系统-人肺小鼠（HIS with autologous lung xenograft,HISL mice）模型。通过对移植后的人肺脏组织进行甲型流感病毒感染,来研究人肺中以及各个器官在感染之后的免疫应答情况,探究此模型的重要临床意义。研究方法:（1）通过给NCG小鼠肾被膜下移植人胚胎胸腺组织、背部皮下移植同源肺脏组织（HL）及尾静脉注射同源肝脏来源CD34+造血干细胞,建立HISL小鼠模型;（2）给予HISL小鼠皮下人肺移植物接种H1N1病毒,对照组给予PBS等体积接种,研究两组小鼠免疫细胞的变化、特异性抗体的产生、转录组的特征及差异;（3）给予HISL小鼠皮下HL预先接种H1N1病毒,再给予HISL小鼠致死剂量H1N1病毒经鼻接种,探求预先接种对于HISL小鼠接受致死剂量H1N1经鼻感染后的保护作用。研究结果:（1）给予接受全身辐照后的NCG小鼠肾被膜下胚胎胸腺组织移植、皮下同源胚胎肺组织移植、尾静脉注射同源胚胎肝脏来源的CD34+造血干细胞后,成功建立HISL小鼠模型,其人CD45+细胞嵌合比例可达90%以上,以T细胞、B细胞为主,髓系细胞、自然杀伤细胞比例较低;小鼠皮下移植的HL组织在模型建立成功后可见其具有与成人肺中相似的、完整的呼吸性气道等结构。（2）H1N1病毒感染小鼠皮下移植的人肺组织后,H1N1组HISL小鼠人肺中的HLA-DR+CD11c+细胞和CD20+细胞比例显着高于对照组,且H1N1组小鼠HL中CD4+Trm、CD8+Trm水平较PBS组显着升高,其水平与HLA-DR+CD11c+细胞和CD20+细胞的比例呈正相关;H1N1组HISL小鼠HL中HLA-A*0201限制性H1N1抗原特异性的CD8+T细胞的比例相比对照组显着升高;H1N1组HISL小鼠血清中产生病毒特异性的Ig、IgG抗体;两组小鼠人肺的转录组测序后表达基因存在显着差异,H1N1组小鼠HL中H1N1流感病毒感染相关、免疫相关的基因表达显着上调。（3）HISL小鼠皮下HL经过5000TCID50 H1N1病毒单次接种后,再次给予小鼠致死剂量（5000TCID50）病毒的经鼻接种,小鼠死亡;预先给予HISL小鼠多次500 TCID50 H1N1病毒皮下HL内接种,小鼠在经过致死剂量流感病毒经鼻感染后生存时间较对照组显着延长。研究结论:（1）HISL小鼠模型可实现对人肺脏组织结构、免疫细胞水平及变化等的研究。（2）HISL小鼠可研究人肺脏组织在流感病毒感染后人肺中的免疫细胞的变化,可进一步研究其中T细胞亚型的特点、基因组的差异以及血清中特异性抗体的产生。（3）多次低剂量H1N1病毒预先感染HISL小鼠皮下HL可提供一定的保护作用,延长该小鼠在接受致死剂量病毒经鼻感染后的生存时间,并提高其生存率。综上所述,本课题首次建立了可用于流感病毒研究的人肺脏组织及免疫系统的小鼠模型,为后期进一步研究感染后免疫系统的变化、T细胞表型特点、特异性抗体的产生、转录水平的差异等提供了有力的工具,并对后期疫苗的研发及其他肺部感染性疾病的研究等具有重要意义。
张利[7]（2021）在《CXCL13趋化型CAR-T细胞对骨肉瘤治疗及其机制的研究》文中认为骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是一种多发病于青少年的恶性肿瘤,易发生肺转移。对于转移性的骨肉瘤,手术治疗和放化疗的临床治疗效果不佳,患者的五年生存率低于30%,目前缺少有效的治疗方案。嵌合抗原受体T细胞疗法（Chimeric antigen receptor T,CAR-T）对肿瘤细胞的杀伤并不需要依赖于MHCI（Major histocompatibility complex class I molecule）类分子,可以有效的防止肿瘤逃逸。实体瘤特殊的免疫微环境使得CAR-T细胞很难浸润到肿瘤组织中,即使浸润到肿瘤组织中,也会因严峻的免疫抑制性环境而耗竭。NKG2D（Natural killer group 2D）是一种NK（Nature killer）细胞表面激活受体,当其与配体结合后通过激活下游信号通路使NK细胞释放各种细胞因子,进而发挥其杀伤肿瘤作用。在我们的研究中发现,OS组织中NKG2D配体蛋白MICA/B（MHC class I chain-related protein A/B）高表达,同时趋化因子CXCL13（chemokine C-X-C motif ligand 13）促进了骨肉瘤的转移和侵袭。CXCR5（C-X-C chemokine receptor type5）为CXCL13的受体;CXCL13可以趋化CXCR5+T淋巴细胞归巢到肿瘤组织发挥抑制肿瘤的作用。本研究制备人源和鼠源的CXCR5共表达的NKG2D-CAR-T细胞,探究CAR-T细胞的对骨肉瘤治疗作用及相关机制。第一部分共表达CXCR5的NKG2D-CAR-T细胞治疗骨肉瘤的研究制备人源对照CAR-T（Mock-CAR-T）,NKG2D-CAR-T和CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞。对比于NKG2D-CAR-T细胞,CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞向CXCL13细胞因子的趋化能力和对靶细胞的杀伤能力明显加强;CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞激活相关的分子如TNF-α（Tumor necrosis factorα）、IFN-γ（Interferonγ）、CD107a和Gzm B（Granzyme B）的表达量显着提高,体外增殖能力显着增强,并且PD-1（Programmed cell death-1）和TIM-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3）的表达水平更低。RNA测序结果显示CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞在增殖、记忆性分化、抵抗免疫耗竭和NFAT通路相关的基因表达显着提高。通过Western blotting、钙信号检测和NFAT-Jurkat报告基因等方法验证显示CXCR5-NKG2D-CAR-T通过CXCL13/CXCR5/Ca2+/NFAT信号轴提高了CAR-T细胞的综合效果。体内实验使用U-2OS细胞对NSG小鼠进行皮下荷瘤,建立骨肉瘤模型,检测CAR-T细胞对荷瘤小鼠的肿瘤杀伤情况。与NKG2D-CAR-T细胞相比,CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞可以在体内存活时间更长,血液中CD8+T淋巴细胞的比例升高,实现更好的肿瘤趋化效果和对肿瘤的抑制能力。第二部分CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞对骨肉瘤肿瘤免疫微环境的影响构建鼠源的Mock-CAR-T,NKG2D-CAR-T和CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞以及鼠源的CXCL13过表达骨肉瘤细胞系。对比于鼠源的NKG2D-CAR-T细胞,CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞的体外趋化能力明显提高;并且展现出更强的骨肉瘤细胞杀伤能力;与细胞杀伤相关的分子如Gzm B,CD107a和IFN-γ的表达量明显提高;体外增殖能力得到明显的增强;并显着降低了耗竭相关的PD-1的表达量。将鼠源的骨肉瘤细胞注射到小鼠胫骨内进行原位建模。对比于鼠源的NKG2D-CAR-T细胞,鼠源的CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞在体内的存活时间、CD8+T淋巴细胞的比例和记忆性T细胞的分化方面展现出优势;并产生更好的肿瘤和淋巴结的归巢能力;产生更强肿瘤抑制效果;并显着降低了肿瘤中髓系来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）、肿瘤相关的巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）和调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）的比例;对抑制性的骨肉瘤免疫微环境有较好的改善作用。结论:CXCR5的共表达显着提高了NKG2D-CAR-T细胞的肿瘤趋化和杀伤能力,并改善了骨肉瘤免疫微环境,本研究为骨肉瘤的CAR-T细胞免疫疗法提出了一种新的方案。
王姝文[8]（2021）在《ITP中骨髓T细胞转录组图谱构建及免疫检查点单核苷酸多态性研究》文中研究说明第一部分:免疫性血小板减少症中骨髓T细胞的转录组图谱构建及亚群特征研究研究背景:免疫性血小板减少症（ITP）是一种自身免疫介导的血小板减少综合征。临床表现以无明显诱因的皮肤黏膜出血为主,也可发生内脏出血甚至颅内出血,严重者危及生命。迄今为止,仍有约30%-40%的患者治疗无效或短期内复发,进展为慢性或难治性ITP。因此深入研究ITP的病理生理机制、开发新的靶向治疗方式具有重要的临床意义。ITP的发生机制主要包括血小板破坏增多和/或生成减少,近年来有越来越多的研究关注T细胞功能失衡在ITP发生发展中的作用。血小板易受CD8+T细胞免疫监视作用的影响,当效应性CD8+T细胞识别血小板所表达的I类主要组织相容性复合物（MHC I）呈递的同源肽时,可脱颗粒并诱导靶细胞凋亡。此外,CD4+T细胞也参与ITP的免疫失耐受过程,其中,CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）数量减少、功能减弱是引起ITP自身免疫耐受缺陷的重要机制之一。目前,虽已有关于部分T细胞在ITP发病机制中作用的研究,但更多种类的T细胞亚群在ITP中的作用仍有待进一步深入探索。骨髓是重要的免疫反应器官,是血小板生成及破坏的关键场所之一。在自身免疫病、肿瘤等疾病发生时,免疫细胞聚集于骨髓并参与到机体致病反应中。其中,初始T细胞（TN）归巢于骨髓,在抗原刺激下分化为效应和记忆T细胞以发挥功能。值得注意的是,近年来发现一群可长期特异性驻留于骨髓的T细胞亚群,称为骨髓驻留记忆T细胞（TRM）。另外,骨髓中也存在Treg、黏膜相关恒定T细胞（MAIT）等T细胞亚群,它们在免疫应答中也具有不可替代的作用:骨髓Treg有助于维持自身耐受,在骨髓移植后,Treg对造血干细胞的植入和移植物抗宿主病的控制有积极作用;MAIT的溶细胞潜力以及MHC相关蛋白1的普遍表达和单态性,提示其可能成为自身免疫病的潜在治疗靶点,但目前相关研究仍较少。因此,解析骨髓T细胞的分群及功能有助于探索ITP等自身免疫病的致病机制及新的治疗方法。单细胞转录组测序（scRNA-seq）可以在单细胞水平上进行RNA提取、扩增、测序等操作,最终得到单个细胞的转录本信息。与群体水平的RNA测序不同,在单细胞水平上对基因表达进行分析可以更好地描述机体各项反应的发生过程,以及更精确地描述某些数量较少或构成较为复杂的细胞群体的特征。近年来,scRNA-seq在解析自身免疫病的发生机制、耐药途径和治疗靶点等方面有越来越多的应用。如对原发性干燥综合征患者外周血单核细胞的scRNA-seq分析显示,在患者中有两个T细胞亚群的比例显着增高,其特异性扩增参与疾病的发生;利用scRNA-seq对处于非肥胖型自身免疫性糖尿病各个阶段小鼠的胰岛细胞进行测序分析,提供了定义自身免疫性糖尿病分期的单细胞图谱。但目前仍缺少针对ITP致病机制或治疗方式的单细胞组学研究。研究目的:1.收集ITP患者及健康对照者骨髓样本,基于单细胞测序技术,构建骨髓T细胞在单细胞水平上的转录组图谱。2.探究ITP骨髓中,与自身免疫性疾病相关的多个T细胞亚群的特征及作用机制,为揭示ITP的发病机制及发现新的治疗靶点提供单细胞精度的依据。研究方法:1.病例和对照:收集初诊原发性ITP患者及健康供者骨髓样本,每例约3mL。2.分离骨髓单个核细胞（BMMCs）:使用Ficoll密度梯度离心法分离骨髓样本中的BMMCs并使用台盼蓝检测细胞活性。3.分选骨髓T细胞:利用流式细胞分选仪分选BMMCs中的CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞,分选后合并备用。4.制备油滴包裹的凝胶珠（GEMs）:配置GEMs制备反应体系,运行Chromium Controller的Chromium Chip A程序并使用PCR仪进行GEMs逆转录。5.扩增及纯化cDNA:回收GEMs逆转录产物,使用PCR仪进行cDNA的扩增,并用SPRIselect试剂盒纯化扩增后的cDNA。6.构建5’测序文库:进行cDNA片段化并用SPRIselect试剂盒纯化,完成接头连接和连接后的纯化,然后选择适当的Sample Index进行PCR并使用Agilent生物分析仪检测文库质量。7.单细胞上机测序:使用Illumina NovaSeq测序仪进行5’ Gene Expression文库和 Chromium Single Cell V（D）J 富集文库测序。8.流式细胞术检测骨髓TRM:通过检测细胞表面标志物CD3、CD8、CD69、CD45RA和CD45RO,分析骨髓中CD4+TRM和CD8+TRM分别占CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例。9.数据分析9.1 数据处理:使用Cell Ranger软件将测序产生的fastq测序数据比对到参考基因组上进行基因表达定量,生成细胞-基因表达矩阵。9.2 数据质控及标准化:对数据进行质控与过滤,并进行标准化处理。9.3 数据合并及去批次效应:使用Seurat结合Harmony算法整合各样本的数据并校正样本的批次效应。9.4 细胞的聚类分析及注释:使用Seurat对细胞进行无监督聚类及分群,根据特征基因的表达对各亚群进行注释。9.5 基因本体（GO）分析:利用GO数据库,在细胞组分、分子功能、生物过程三个层面上对数据进行富集分析。9.6 京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析:基于KEGG数据库对各亚群差异表达的基因进行富集分析。9.7 基因集富集分析（GSEA）:使用GSEA对基因集进行进一步富集分析。NES 绝对值>1,nominal p-value<0.05,FDR q-value<0.25 的通路下的基因集有意义。9.8 免疫组库V（D）J分析:应用scRepertoire对T细胞免疫组库进行可视化分析,内容包括CDR3区核苷酸长度、不同抗原受体序列丰度及文库的多样性和克隆性等。9.9 流式细胞术数据分析:使用Kaluza软件对流式细胞分析仪所采集的数据进行分析,并将整理后的数据导入SPSS 26.0和GraphPad Prism 7中进行统计学分析。研究结果:1.样本信息:研究纳入了 4例ITP患者及2例健康对照者。ITP患者均为初诊ITP,未使用过大剂量激素、丙种球蛋白等治疗自身免疫性疾病的药物。2.单细胞测序数据质量评估及质控:各样本中单细胞中位基因数平均为1190,单个细胞的 Fraction Reads 均大于 92%,Valid Barcodes 均大于 82%。3.骨髓来源T细胞的无监督聚类分群:根据特征基因的表达对各群进行注释,得到CD4+效应记忆T细胞/驻留记忆T细胞（TEM/TRM）、CD4+中央记忆T细胞（TCM）、CD4+细胞毒性 T 细胞（CTL）、CD4+TN、CD8+TN、CD8+TEM/TRM、CD8+CTL、Treg、MAIT等共1 1个T细胞亚群,ITP组、健康对照组及两者合并组的分群较为一致。4.骨髓来源T细胞的V（D）J分析:使用Chao和ACE指数进行克隆型多样性分析的结果显示,健康对照者相对ITP患者具有更高的丰富度,提示ITP患者存在疾病相关克隆扩增。5.ITP中骨髓MAIT单细胞转录组特征:ITP患者骨髓中MAIT与正常对照相比,富集的上调基因主要包括干扰素通路相关基因IFI44L、IFI6、IFITM1和调节细胞毒性及溶细胞作用的基因CTSW等。富集的下调基因主要包括维持细胞静止的基因BTG2、细胞周期相关基因YPEL5等。多个差异表达的基因与CTLA4、PD1等免疫检查点相关。此外,KEGG分析显示ITP中MAIT上调的基因与I型糖尿病、自身免疫性甲状腺病等自身免疫病相关。6.ITP中骨髓Treg单细胞转录组特征:ITP患者的Treg存在与MAIT相似的干扰素通路相关基因的上调,其他表达上调的基因包括动力蛋白基因DYNLTI等。而ITP组下调的基因包括趋化因子或细胞粘附相关基因,核质运输相关基因等。说明除干扰素通路异常外,在ITP患者中还可能存在Treg的趋化、粘附、转运功能异常。7.ITP中骨髓TN单细胞转录组特征:与MAIT及Treg相似,ITP患者CD4+TN的上调基因富集到I型干扰素通路及抗病毒/固有免疫应答过程。下调基因主要包括调节细胞周期及静止的基因LBH、BTG2,并且下调基因还富集到了激素应答相关通路。与CD4+TN相似的是,ITP患者CD8+TN中也存在IFI44L、CTSW基因表达的上调和BTG2表达的下调。不同的是,ITP CD8+TN下调的基因还有自噬调节基因等。此外,CD8+TN在基因富集分析中也表现出与CD4+TN相似的基因富集通路,但存在更多与氧化应激相关的基因的下调,这部分的结果显示ITP中CD4+和CD8+TN既在干扰素通路及激素应答方面呈现出相似的特征,又在自噬及氧化应激方面有不同的特点。8.骨髓来源部分T细胞的进一步分群及注释:我们提取了第一次分群后的经典记忆性T细胞及效应性T细胞亚群,将其分为CD4+T细胞和CD8+T细胞两类,并在此基础上进行了更高分辨率条件下的聚类分群。CD4+T细胞注释后得到 CD4+TCM-1、CD4+TcM-2、CD4+TEM、CD4+TRM等共 7 个亚群,其中CD4+TCM-1比CD4+TCM-2表现出更强的与TN的关联性。CD8+T细胞在第二次分群及注释后得到 CD8+TCM-1、CD8+TCM-2、CD8+TEM、CD8+TRM等共9个亚群,其中CD8+TCM-1与TN的关联性大于CD8+TCM-2。9.ITP患者骨髓TRM比例及单细胞转录组特征:单细胞测序和后续的流式细胞术验证结果都显示出ITP患者骨髓中的CD4+TRM占CD4+T细胞的比例和CD8+TRM占CD8+T细胞的比例较健康对照组增加。CD4+TRM相较总体CD4+记忆及效应T细胞亚群高表达的基因主要富集在T细胞活化、淋巴细胞增殖相关的基因通路。ITP患者CD4+TRM与正常对照者比较,富集的上调基因主要包括调节细胞活化或分化的基因、抗原递呈相关基因等。而下调基因富集在激素反应性及凋亡相关通路。我们还发现ITP患者中的CD8+TRM存在促活化/分化基因以及趋化因子相关基因的上调。上调的基因ID2、MAP3K8还与免疫检查点信号传导相关。这部分的结果提示,TRM亚群与总体记忆及效应T细胞相比,高表达的基因主要富集在T细胞活化及淋巴细胞增殖相关通路;ITP患者TRM与健康对照者相比,显示出细胞活化相关基因的上调及凋亡相关基因的下调。10.ITP患者骨髓CD8+CTL-1及CD8+TCM-1的单细胞转录组特征:CD8+CTL-1和CD8+TCM-1亚群相对于总体CD8+记忆及效应T细胞高表达的基因,在T细胞活化及分化通路上有更明显的富集。CD8+CTL-1中,ITP患者与正常对照者相比高表达促活化或分化的基因MAP3K8、PIK3R1等;富集分析结果显示出与T细胞毒性相关的通路显着富集。ITP患者CD8+TCM-1亚群的ID2、ZFP36基因表达上调;而下调的基因在凋亡通路有所富集,并且与激素治疗反应性有关。KEGG分析提示这两个亚群与I型糖尿病、自身免疫性甲状腺病的相关性较健康对照组都明显增强。结论:构建了骨髓T细胞在单细胞水平上的转录组图谱,ITP组、健康对照组及两者合并组的分群及注释结果均较为一致。在ITP骨髓中,CD4+TN、CD8+TN、Treg、MAIT亚群上调的基因均显示出在干扰素通路上的富集,这4个亚群在ITP中发挥作用的途径与Ⅰ型、Ⅱ型干扰素相关。骨髓中部分T细胞亚群显示出较高的活化水平,TRM、CD8+CTL-1和CD8+TCM-1细胞,相较总体记忆性及效应性T细胞亚群,所高表达的基因主要富集在T细胞活化相关通路。第二部分:T细胞免疫检查点单核苷酸多态性与免疫性血小板减少症相关性研究研究背景:ITP是临床最常见的出血性疾病之一,以血小板计数减少和出血风险增加为特征。ITP是一种获得性自身免疫病,主要病理特点为血小板破坏增多和/或血小板生成减少,其发病机制涉及T细胞的过度活化,对于细胞介导的细胞毒性作用和IgG的生成至关重要。因此,进一步探讨ITP患者的T细胞异常有助于深入揭示ITP的发生和发展机制。免疫检查点分子包括共刺激分子和共抑制分子,是调节T细胞介导的免疫应答、决定T细胞功能和命运的关键机制之一。共刺激和共抑制信号,也称为“第二信号”,可调节T细胞受体（TCR）和MHC结合所提供的“第一信号”,并协同决定适应性T细胞免疫的结果。共刺激分子表达过高和/或共抑制分子表达不足可能引起机体自我耐受性下降,促进自身反应性T细胞的生成或引起自身反应性T细胞逃避中枢和外周耐受,导致自身免疫病的发生。T细胞的共刺激分子包括CD28、可诱导T细胞共刺激分子（ICOS）、肿瘤坏死因子超家族成员4（TNFSF4）和DNAX辅助因子1（DNAM1）等;而共抑制分子包括T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3（TIM3）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）、程序性死亡蛋白1（PD1）和淋巴细胞活化基因3（LAG3）等。其中,CD28和CTLA4与抗原递呈细胞表面的配体（CD80和CD86）相互作用,分别向T细胞引入刺激和抑制信号。而PD1是B7/CD28家族的一种新的共抑制成员,与PDL1结合抑制T细胞活化。因此,共刺激和共抑制信号可能导致自身免疫性疾病中T细胞的过度活化。单核苷酸多态性（SNP）是人类最常见的遗传变异类型。遗传学研究揭示,编码免疫检查点分子的基因的多态性与几种自身免疫病的易感性有关。CD28 rs1980422的CC基因型与类风湿关节炎（RA）中类风湿因子和抗瓜氨酸蛋白抗体有关,而 ICOS rs6726035、PD1 rs36084323、DNAM1 rs763361 和 TIM3 rs10515746的多态性也作为RA发生的相关因素。CTLA4rs231779的TT基因型增加患Graves病的风险。此外,多发性硬化（MS）患者LAG3 rs870849中TT基因型的分布与健康对照组相比有所不同。在系统性红斑狼疮（SLE）中,TNFSF4 rs2205960的次要等位基因的频率与自身抗体的产生相关。尽管多个SNP位点已被报道与机体免疫异常有关,但很少有研究关注ITP中免疫检查点基因的单核苷酸多态性。免疫检查点基因的单核苷酸多态性是否是ITP的保护性或危性险因素,以及这些SNP位点是否与ITP的易感性、严重程度、激素治疗敏感性或难治性相关,目前仍有待探索。研究目的:1.探究T细胞免疫检查点相关SNP位点的多态性在ITP患者及健康对照人群中的分布情况。2.探究免疫检查点基因单核苷酸多态性与ITP易感性、严重程度、难治性、激素治疗敏感性的关联及在其中的作用,揭示从T细胞免疫检查点入手治疗ITP的可能靶点。研究方法:1.病例和正常对照:收集ITP患者及健康对照者样本,对于ITP患者,按严重程度、难治性和糖皮质激素治疗敏感性进一步分层。2.基因组DNA提取:采用Ficoll密度梯度离心法分离样本中外周血单个核细胞（PBMCs）,并从中提取基因组DNA。3.选择SNP位点及基因分型:共选择8个SNP位点（TIM3 rs10515746,CD28 rs1980422,TNFSF4 rs2205960,CTLA4 rs231779,PDI rs36084323,ICOS rs6726035,DNAM1 rs763361,LAG3 rs870849）,使用 MassARRAY 系统进行基因分型。4.流式细胞术:通过检测细胞表面标志物CD3、CD4和CD28,分析CD4+T淋巴细胞中CD28的表达量。5.免疫磁珠分选:使用CD4+T细胞磁珠从PBMCs中分选CD4+T细胞,分选后检测CD4+T细胞纯度。6.实时定量PCR:提取上述CD4+T细胞的RNA,反转录获取cDNA,采用Light Cycler 480Ⅱ Real-Time PCR 系统进行定量 PCR,检测 CD28 的表达。7.统计分析:首先进行哈迪-温伯格平衡（HWE）检验,然后使用SPSS 26.0软件统计并分析数据;同时,利用GMDR0.9软件进行广义多因素降维（GMDR）分析,以解析基因-基因间的相互作用。研究结果:1.研究人群:ITP患者（307例）及健康对照者（295例）间在年龄结构、性别分布方面没有统计学差异（p>0.05）。使用对照组数据进行计算后,被检测的 8 个 SNP 均符合 HWE（p>0.24）。2.与ITP易感性相关的SNPs:使用4种遗传模型分析8个免疫检查点相关SNPs与ITP易感性的关系,包括显性模型、隐性模型、共显性模型和等位基因模型。共显性模型下的CD28 rs1980422的多态性与ITP易感性的关联最为显着（p=0.002）,且经过错误检出率（FDR）校正后仍具有相关性。对于CD28rs1980422,在共显性和显性模型下,CT和CC/CT基因型与ITP易感性显着相关（分别为p=0.006和p=0.016）。在共显性模型下的联合分析发现,TIM3 rs10515746的杂合基因型CA和CD28 rs1980422的杂合基因型CT使ITP发病风险明显增加（OR>l,p<0.05）。此外,使用显性模型的联合分析显示,与主要等位基因的纯合子相比,TIM3 rs10515746的CA/AA基因型和CD28 rs1980422的CC/CT基因型显着增加了 ITP的发生风险。采用GMDR方法进一步研究SNPs影响ITP易感性的多因素交互作用,证明TIM3 rs10515746、CD28 rs1980422 和 ICOS rs6726035 这 3 个 SNP 位点对 ITP 易感性表现出交互作用。3.与ITP严重程度相关的SNPs:PD1 rs36084323的TT基因型和T等位基因与ITP严重程度显着相关（p<0.05）。在等位基因模型下,LAG3 rs870849的T等位基因与ITP严重程度间有统计学意义（p<0.05）。等位基因模型的联合分析发现,携带PD1 rs36084323的T等位基因的ITP患者发生重度ITP的风险增加 1.649倍（OR=1.649,95%CI=1.186-2.291,p=0.003）;相反的是,LAG3 rs870849的T等位基因使重度ITP的发生风险降低（OR=0.506,95%CI=0.312-0.818,p=0.005）。4.与糖皮质激素治疗敏感性相关的SNPs:对于DNAM1 rs763361,在共显性和隐性模型的分析中都呈现出与糖皮质激素治疗敏感性显着相关（分别为p=0.016和p=0.030）。在等位基因模型下,糖皮质激素敏感组和耐药组之间的ICOS rs6726035等位基因频率存在显着差异（p=0.015）。DNAMl rs763361的T等位基因使糖皮质激素耐药风险增加1.939倍（OR=1.939,95%CI=1.278-2.942,p=0.002）;相反,ICOS rs6726035的T等位基因具有保护作用（OR=0.538,95%CI=0.366-0.791,p=0.002）。5.与ITP难治性相关的SNPs:PD1 rs36084323的基因型分布与ITP难治性显着相关（p<0.05）。共显性和显性模型下发现PD1 rs36084323的基因型分布在难治组与非难治组之间存在统计学差异（分别为p=0.030和p=0.034）。此外,在显性模型下,携带rs36084323的TT/CT基因型的患者发生难治性ITP 的风险是 CC 基因型患者的 8.889 倍（OR=8.889,95%CI=1.183-66.771,p=0.034）。6.CD28 rs1980422多态性与CD28表达相关:分析来自CD28 rs1980422位点为CT或TT基因型的ITP患者的CD4+T细胞中CD28+细胞的比例及CD28的平均荧光强度（MFI）,发现CD28rs1980422位点为CT基因型的ITP患者,CD28蛋白表达水平高于TT基因型患者（p=0.006）。另外,与TT基因型相比,CT基因型患者的CD28在mRNA水平的表达也增加（p=0.028）。结论:T细胞免疫检查点相关的6个SNP位点（TIM3 rs10515746,CD28rs1980422,PD1 rs36084323,ICOS rs6726035,DNAM1 rs763361,LAG3 rs870849）在 ITP患者和健康对照人群中的基因型和/或等位基因频率分布有所不同;这些SNP位点与ITP的易感性、严重程度、难治性或糖皮质激素治疗敏感性有关。CD28 rs1980422位点为CT基因型的ITP患者,CD28在蛋白及mRNA水平的表达均高于TT基因型ITP患者。研究所得到的6个SNP位点有望成为ITP发生发展及治疗效果的预测因子,也为ITP的免疫治疗提供了新的靶点。
谭思雨[9]（2021）在《转录因子Zhx2抑制NK细胞的成熟及抗肿瘤功能的作用及机制》文中进行了进一步梳理NK细胞是组成固有免疫系统的重要部分,通过释放穿孔素、颗粒酶及多种细胞因子,裂解肿瘤细胞和病毒感染细胞,并调节多种免疫细胞,发挥免疫监视功能。基于NK细胞的免疫治疗成为癌症治疗的关键方法之一。NK细胞在发育过程中逐步获得杀伤功能,并伴随其成熟,杀伤功能逐渐增强。然而,动物研究和临床证据均表明,肿瘤微环境中功能性NK细胞数目降低,而活性丧失、不成熟表型的NK细胞大量积累,呈现“耗竭”的表型。深入研究调控NK细胞成熟和存活的分子机制,有助于逆转肿瘤微环境NK细胞的耗竭表型,对开发以NK细胞为基础的免疫治疗新策略具有重要意义。NK细胞主要在骨髓中发育,逐渐获得IL-15Rβ（CD122）和NK1.1表面分子的表达。根据CD27和CD11b的表达,可以将NK细胞的成熟过程划分为四个时期:CD27-CD11b-,CD27+CD11b-,CD27+CD11b+,CD27-CD11b+。伴随着NK细胞的成熟,其细胞杀伤功能不断增强,增殖能力逐渐降低,并且更容易凋亡。NK细胞的发育和成熟过程需要细胞因子的调控,其中,IL-15对NK细胞的成熟至关重要。此外,NK细胞的发育过程由一系列转录因子调控,这些转录因子调控效应分子和细胞表面成熟相关标志物的表达。大量研究已经发现了调控NK细胞早期发育及终末成熟的多种转录因子,但是NK细胞发育过程中发挥负向调控作用的转录因子研究仍然比较有限。Zhx2（Zinc fingers and homeoboxes 2）属于锌指蛋白与同源框蛋白家族。已有文献报道其作为转录因子,发挥转录抑制功能,参与肿瘤抑制、细胞分化和代谢相关疾病。Zhx2在胸腺和脾脏中丰富表达,影响B细胞发育和巨噬细胞极化。文献显示,Zhx2通过调控巨噬细胞的活化和分化,参与调控炎性相关疾病,如动脉粥样硬化和脓毒血症。这些发现表明,Zhx2在免疫细胞分化中可能是一个关键基因。然而,Zhx2在NK细胞中的作用尚不明确。本研究旨在揭示Zhx2在NK细胞发育及功能中的关键作用,并研究Zhx2通过调控NK细胞发育及功能影响肿瘤发生进程的作用,以期为调控NK细胞进行肿瘤免疫治疗提供新的靶点。论文分为以下三个部分:（1）揭示Zhx2在NK细胞的发育及功能调控中的作用;（2）探讨Zhx2调控NK细胞的机制,发现了Zhx2调控IL-15信号通路及Zeb2转录,进而影响NK细胞成熟及功能的新机制;（3）动物实验证明干预Zhx2促进NK细胞抗肿瘤的作用。以上结果揭示了 NK细胞成熟的调控新机制,提供了基于NK细胞进行肿瘤免疫治疗的新思路。主要方法与结果如下:一、Zhx2缺失促进NK细胞成熟为研究Zhx2对NK细胞发育成熟的调控作用,本研究首先利用数据库分析NK细胞中Zhx2的表达丰度,进而构建NK细胞特异性Zhx2敲除小鼠,流式细胞术检测Zhx2敲除后NK细胞的数目和表型。1.Zhx2高表达于不同来源NK细胞对GEO数据库中的小鼠肝脏居留免疫细胞的scRNA-seq（GSE125188）测序结果进行分析,发现在各种免疫细胞亚群中,Zhx2在淋巴细胞中具有高水平表达。进一步分析人外周血、骨髓、脾脏、肺脏、淋巴结中CD56brightCD16-及CD56dimCD16+NK细胞中的ZHX家族分子mRNA表达水平,发现ZHX2在各组织NK细胞中均具有高水平的表达,提示Zhx2可能参与NK细胞调控。2.NK细胞特异性Zhx2敲除小鼠体内成熟NK细胞的数目、比例显着增加利用Ncr-cre小鼠构建NK细胞特异性Zhx2敲除小鼠（Zhx2△/△）,Western Blot证实Zhx2在小鼠脾脏NK细胞中敲除效果良好。分离Zhx2△/△及对照Zhx2+/+小鼠肝脏、脾脏、外周血NK细胞,流式细胞术检测显示,与对照小鼠相比较,Zhx2△/△组小鼠不同来源NK细胞的相对数目及绝对数目均显着增加。进一步流式检测各个发育阶段NK细胞,结果显示,Zhx2敲除后NK前体细胞（NKP,Lin-CD244+CD27+CD122+）的数目、比例没有差异,而最成熟的CD27-CD1 1b+NK细胞比例、数目均明显增加<。同样,与Zhx2+/+组比较,Zhx2△/△小鼠肝脏和脾脏来源NK细胞中KLRG1+成熟NK亚群增加。3.Zhx2内源性抑制NK细胞发育成熟为排除其他细胞对Zhx2△/△小鼠NK细胞成熟的可能影响,设计小鼠骨髓细胞混合转输实验及非竞争性骨髓回输实验。骨髓细胞混合转输实验中,分别从背景为CD45.2+的Zhx2+/+小鼠和背景为CD45.1+的Zhx2△/△小鼠中分离骨髓细胞,1:1比例混合后,计数1×107细胞,尾静脉回输至经致死辐照（10Gy）的Zhx2+/+受体鼠体内,重建小鼠免疫系统,于5周后处死小鼠进行流式检测。结果显示来源于CD45.2+Zhx2△/△的NK细胞比例及成熟度均高于CD45.1+Zhx2+/+小鼠。非竞争性骨髓回输实验中,将来源于Zhx2+/+小鼠和Zhx2△/△小鼠的骨髓细胞分别回输至致死辐照（10Gy）的Zhx2+/+小鼠体内,5周后检测受体小鼠脾脏NK细胞比例。同样证明接受Zhx2△/△小鼠骨髓回输的受体鼠体内NK细胞比例更高。二、Zhx2抑制NK细胞的功能前期结果提示Zhx2缺失会促进NK细胞的功能。为进一步明确Zhx2对NK细胞功能的影响,设计体内外实验,分别检测NK细胞表面活化性受体、抑制性受体及细胞因子、杀伤性分子的表达,并检查NK细胞毒活性及抗肿瘤功能。1.Zhx2敲除NK细胞活化性受体表达升高、抑制性受体表达降低分离Zhx2+/+小鼠和Zhx2△/△小鼠脾脏单个核细胞,流式细胞术检测NK细胞表面活化性受体NKG2D和抑制性受体NKG2A的表达。结果显示Zhx2△/△NK细胞NKG2D表达高于Zhx2+/+NK细胞,NKG2A表达水平低于Zhx2+/+NK细胞,具有更加活化的表型。2.Zhx2敲除NK细胞具有更强的细胞因子分泌及杀伤分子表达能力分离Zhx2+/+小鼠和Zhx2△/△小鼠肝脏、脾脏单个核细胞,使用NK细胞特异性激动剂NK1.1抗体刺激活化NK细胞,流式细胞术检测结果显示,Zhx2△/△小鼠肝脏和脾脏来源的CD3-NK1.1+NK细胞分泌IFN-γ、TNF-α、CD107a和granzyme的水平明显高于Zhx2+/+小鼠。磁珠纯化Zhx2+/+小鼠和Zhx2△/△小鼠脾脏NK细胞,RT-QPCR检测IFN-γ、TNF-α和granzyme B表达得到相同结果。3.Zhx2△/△ NK细胞具有更强的细胞毒作用为检测NK细胞杀伤靶细胞能力,我们以小鼠淋巴瘤细胞Yac-1为靶细胞,CFSE染色后与纯化的脾脏NK细胞共培养,7-AAD染色死亡细胞。结果显示,Zhx2△/△小鼠NK细胞的杀伤活性明显强于对照组Zhx2+/+NK细胞。进一步将CFSE染色的Yac-1细胞腹腔回输至Zhx2△/△小鼠及Zhx2+/+小鼠体内,于24h后流式细胞术检测小鼠腹腔中剩余CFSE+Yac-1细胞数目及比例。结果表明,与Zhx2△/△小鼠相比较,Zhx2+/+小鼠体内CFSE+Yac-1数目更多,比例更高。证明Zhx2△/△组NK细胞在体内对靶细胞Yac-1具有更强的杀伤能力。4.Zhx2△/△ NK细胞对体内肿瘤具有更强的杀伤作用小鼠肝癌细胞Hepa1-6皮下注射,在Zhx2+/+及Zhx2△/△小鼠建立皮下成瘤模型,结果显示,与Zhx2+/+鼠相比较,Zhx2△/△小鼠皮下成瘤生长更加缓慢,最终成瘤体积及重量均显着小于对照组。5.ZHX2抑制人NK细胞系NK92细胞功能人NK92细胞系通过电转或慢病毒感染进行ZHX2过表达或小干扰后,使用PMA和离子霉素联合刺激或靶细胞K562共培养活化NK细胞。流式结果显示,ZHX2 过表达降低 NK92 细胞 TNF-α、IFN-γ、perforin 和 granzyme B 表达,并抑制NK92细胞对K562靶细胞的杀伤能力,干扰ZHX2则促进NK92细胞中上述细胞因子的表达和杀伤能力。三、Zhx2缺失促进NK细胞抵抗凋亡为明确Zhx2缺陷小鼠成熟NK细胞增多的原因,我们从细胞增殖及凋亡抵抗两方面研究Zhx2敲除对NK细胞的影响。1.Zhx2缺失不影响NK细胞的增殖分离纯化Zhx2+/+和Zhx2△/△小鼠脾脏NK细胞,5ng/mL IL-15刺激6h后通过EdU及Ki67标记,检测NK细胞的增殖情况。结果显示,Zhx2△/△NK及对照NK细胞的增殖能力没有明显差异。2.Zhx2缺失促进NK细胞的凋亡抵抗能力为明确Zhx2对NK细胞存活能力的影响,分离Zhx2+/+和Zhx2△/△小鼠脾脏单个核细胞,Annexin V/7-AAD染色,流式检测NK细胞凋亡的差异。结果显示从Zhx2△/△小鼠分离出的NK细胞凋亡细胞数明显减少。进一步使用凋亡诱导剂CHX处理细胞,分别于不同时间收取细胞,流式细胞术检测Zhx2敲除NK细胞对凋亡的抵抗能力。实验结果显示,体外培养的Zhx2△/△NK细胞在所有检测时间点的凋亡水平均显着少于对照组。同时,Zhx2+/+和Zhx2△/△脾脏NK细胞的RNA-seq结果GSEA富集分析发现,相对于Zhx2△/△组NK细胞,编码凋亡相关分子的基因集在Zhx2+/+NK细胞中显着富集。为明确Zhx2体内作用,分别使用荧光染料Cell Trace Violet（CTV）或CFSE体外标记磁珠纯化的Zhx2+/+小鼠或Zhx2△/△小鼠来源的脾脏NK细胞,尾静脉注射回输到Zhx2+/+受体小鼠中,分别于不通时间分离脾脏单个核细胞,检测CFSE+NK细胞及CTV+NK细胞的体内存活情况。流式结果显示,Zhhx2+/+来源的NK细胞在受体小鼠体内比例随时间延长逐渐降低。以上结果表明,Zhx2缺失会促进NK细胞的存活。四、Zhx2缺失促进NK细胞对IL-15的应答IL-15在维持NK细胞存活、促进NK细胞发育成熟及活化NK细胞发挥功能等方面均具有重要作用。GSEA富集分析发现Zhx2△/△细胞富集IL-15信号通路相关基因。因此,我们检测Zhx2是否影响NK细胞的IL-15信号通路转导。1.Zhx2缺失促进NK细胞IL-15信号通路磁珠纯化Zhx2+/+和Zhx2△/△小鼠脾脏NK细胞,进行RNA-seq。GSEA富集分析显示,Zhx2△/△NK细胞中IL-15信号通路相关基因集富集。分离Zhx2+/+和Zhx2△/Δ小鼠脾单个核细胞,流式细胞术检测结果显示,Zhx2缺失不影响NK细胞表面IL-15受体CD122的表达。分离不同小鼠脾脏单个核细胞,50ng/mL IL-15活化后,流式细胞术检测NK细胞p-STAT5和p-AKT表达。结果显示,Zhx2敲除后,IL-15信号下游的关键蛋白STAT5和AKT蛋白的磷酸化水平明显上升。2.Zhx2缺失促进IL-15介导的NK细胞功能增强我们进一步检测1L-15刺激后NK细胞的功能性分子的表达。分离Zhx2+/+和Zhx2△/△脾脏单个核细胞,不同浓度IL-15刺激后,流式检测NK细胞CD107a和IFN-γ表达。结果显示Zhx2缺失的NK细胞CD107a和IFN-γ表达均显着高于对照组。进一步seahorse检测显示,Zhx2敲除后,NK细胞氧化磷酸化水平（OCR）和最大耗氧量增强。此外,体外5ng/mL IL-15培养NK细胞的情况下,Zhx2缺失的NK细胞存活能力显着强于Zhx2+/+组。以上结果表明,Zhx2缺失促进IL-15介导的NK细胞的功能、代谢水平及存活能力。3.Zhx2通过IL-15信号通路抑制NK细胞存活及功能分离Zhx2+/+和Zhx2△/△脾脏单个核细胞,STAT5-IN预处理后,使用IL-15活化NK细胞,流式检测结果显示,STAT5-IN预处理抑制NK细胞中IL-15下游STAT5蛋白的磷酸化,并消除了 Zhx2敲除导致的Zhx2+/+和Zhx+/+NK细胞间STAT5蛋白磷酸化水平的差异,也几乎完全破坏了 Zhx2敲除导致的NK细胞CD107a和IFN-γ表达的增强。表明,Zhx2对NK细胞存活和功能的抑制依赖于其对IL-15信号通路的调控。五、Zhx2通过抑制Zeb2基因转录,抑制NK细胞发育为进一步寻找Zhx2调控NK细胞表型和功能的靶基因,分别对Zhx2+/+和Zhx2△/△脾脏NK细胞进行RNA-seq和ATAC-seq测序分析。1.Zhx2缺失导致NK细胞转录调控网络发生改变分析Zhx2+/+和Zhx2△/△脾脏NK细胞的RNA-seq结果,差异基因分析显示,Zhx2敲除NK细胞中共有1642个差异表达基因,其中有1325个上调基因,317个下调基因。比较RNAseq结果与GEO数据库（GSE45842）小鼠不同发育阶段NK细胞RNA-seq数据,并进行富集分析。结果显示,在CD27low终末成熟NK细胞亚群中,更加富集Zhx2△/△NK细胞相关基因。Gene Ontology（GO）富集分析发现,Zhx2△/△NK细胞显着富集免疫反应及炎性反应相关信号通路。2.Zhx2调控NK细胞成熟相关基因转录对ATAC-seq、RNA-seq差异基因,与GEO数据库中报道的不同发育阶段NK细胞差异表达基因进行聚类分析,三个数据库中共发现9个差异基因。RT-QPCR验证上述基因在Zhx2敲除小鼠脾脏NK细胞中的表达与RNA-seq结果相一致。进一步借助GEO数据库（GSE45842）中成熟NK细胞RNA-seq结果,分析上述基因在NK发育过程中的表达。热图显示,Zhx2上调的3个基因中的2个（Tcf7、Slamf6）在NK细胞发育过程中表达均逐渐下调。而Zhx2敲除后表达上升的基因均在NK细胞发育成熟过程中逐渐表达升高。其中,Zeb2是表达变化差异最大的转录因子。3.Zhx2与Zeb2启动子区域结合并转录调控Zeb2磁珠纯化Zhx2+/+和Zhx2△/△脾脏NK细胞,RT-QPCR结果发现NK细胞中Zeb2与Zhx2表达显着负相关。进一步构建Zeb2启动子报告质粒pGL3-Zeb2,分别与pcDNA3.0质粒或pcDNA-ZHX2质粒共转染HEK293T细胞,双荧光素酶报告基因检测结果显示,Zhx2过表达细胞Zeb2启动子区活性显着低于对照组。此外,ATAC-seq结果显示,Zhx2敲除后Zeb2基因启动子区域染色质开放程度显着升高。进一步对Zhx2敲除NK细胞RNA-seq结果及GEO数据库（GSE72162）中CD8+T细胞中Zeb2调控基因表达数据,进行GSEA富集分析,结果显示Zhx2敲除NK细胞显着富集Zeb2下调的基因。以上结果表明,Zhx2通过与Zeb2基因启动子区结合,转录抑制Zeb2基因表达。4.Zhx2通过Zeb2抑制NK细胞的成熟及功能设计Zeb2拯救实验,明确Zeb2在Zhx2调控NK细胞表型及功能中的作用:磁珠纯化Zhx2+/+和Zhx2Δ/△脾脏NK细胞,利用shZeb2慢病毒干扰Zeb2后,尾静脉回输到经半致死剂量（5.5Gy）辐照的受体小鼠体内。Western blot证实Zhx2敲除及Zeb2干扰效果良好。流式细胞术结果显示,Zhx2敲除促进NK细胞的终末发育成熟及CD107a表达,但在干扰Zeb2后,Zhx2敲除促进NK细胞终末成熟及功能的作用消失。以上结果表明,Zhx2调控NK细胞成熟和功能依赖于Zeb2。六、Zhx2缺陷NK细胞能够更好的抑制体内肿瘤生长为进一步明确Zhx2是否可以作为NK细胞免疫治疗的靶点,我们首先通过TCGA数据库肝癌患者临床信息分析肿瘤中NK细胞浸润与ZHX2表达相关性及患者预后信息。进而建立不同小鼠肿瘤模型,评估NK细胞的抗肿瘤功能,并以重度免疫缺陷小鼠为研究对象,设计了两种人类肝细胞肝癌治疗模型。1.肝癌患者中ZHX2表达与NK细胞在肿瘤中浸润成负相关首先分析TCGA数据库肝细胞肝癌患者临床信息中NK细胞的浸润情况,发现在肿瘤中浸润的NK细胞数目越多,ZHX2表达水平则越低,且ZHX2低表达患者比ZHX2高表达的患者具有更高的生存率。建立小鼠肝脏原位成瘤模型,流式细胞术检测结果显示,在Zhx2△/△荷瘤小鼠肝癌组织中浸润的CD3-NK1.1+NK细胞比例显着高于Zhx2+/+小鼠,且终末成熟的NK细胞亚群及CD107a的表达也更高。2.Zhx2缺陷NK细胞能够更好的抑制肿瘤生长转移进一步采用小鼠肝癌细胞皮下成瘤模型及黑色素瘤细胞肺转移模型,评估Zhx2干预NK细胞的抗肿瘤功能。Hepa1-6细胞于腹股沟处皮下成瘤,皮下成瘤模型显示当小鼠接受Zhx2△/△脾脏NK细胞回输,Hepa1-6皮下肿瘤的生长更显着的受到抑制,成瘤体积和重量均小于对照组。此外,制备B16-F10肺转移模型,回输1×106 Zhx2+/+或Zhx2△/△NK细胞。结果同样显示回输Zhx2△/△NK小鼠肺部结节数更少,生存时间显着延长。3.干预ZHX2有效提升人NK细胞抗肿瘤治疗效果以重度免疫缺陷小鼠为研究对象,设计了两种人类肝细胞肝癌治疗模型:Huh7肝癌细胞皮下成瘤模型以及HepG2肝癌细胞腹腔成瘤模型。人肝癌细胞系HepG2-luciferase 腹腔注射 NCG 小鼠,一周后回输 LV-shNC 或 LV-shZHX2-NK92细胞,建立人源化小鼠肝癌模型。小鼠活体成像检测结果显示,接受LV-sh ZHX2-NK92回输的小鼠体内肝癌细胞的荧光信号显着受到抑制,小鼠总生存期显着更长。同样,Huh7肝癌细胞皮下成瘤,一周后回输LV-shNC或LV-sh ZHX2-NK92细胞,建立人源化小鼠肝癌皮下成瘤模型。实验结果同样证明,在接受LV-ZHX2 NK92细胞治疗的小鼠中肿瘤生长减缓,小鼠肿瘤体积及重量显着减小。
杜丽[10]（2021）在《嵌合抗原受体T细胞疗法的优化策略研究》文中进行了进一步梳理背景:嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）是一种发展迅速的肿瘤免疫治疗策略,在癌症个体化免疫治疗方面表现出了巨大的前景。该技术是将抗体对抗原的高度特异性和T细胞对靶细胞的细胞毒活性相结合的一种方法。然而CAR-T细胞的广泛应用仍面临一些艰巨的挑战,T细胞慢病毒转染效率低、CAR-T细胞功能受到抑制、CAR-T细胞输注后缺乏持续性、肿瘤细胞抗原表达缺失引起免疫逃逸等。慢病毒载体能够通过整合到宿主基因组,稳定转染分裂或非分裂的细胞。此外,这些载体对人体无毒,可使转染的原代T细胞获得长期稳定的基因表达。但是,目前慢病毒介导的T细胞转染面临着低转染效率的局限性,如何提高慢病毒转染效率仍然是一个挑战。考虑到CAR-T细胞在患者体内持续性差,增加低分化CAR-T细胞的占比可有效提高CAR-T细胞持久抗瘤的效果。尽管低分化T细胞群具有明显的优势,但由于缺乏生产低分化CAR-T细胞的合适方法,目前大多数过继性细胞疗法仍依赖于终末分化型CAR-T细胞。因此,优化制备方法以获得高质量的CAR-T细胞非常重要。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原结合区、一个胞外铰链区、一个跨膜区和一个胞内信号区。单一的CAR骨架构成为其在临床应用中提供了很大的灵活性,但是,这种简单的结构并不能模拟真实、精密而复杂的TCR识别模式。天然状态下的T细胞能对抗原提呈细胞表面的单个抗原肽-MHC分子复合物做出反应,而在CAR-T细胞活化中,尽管抗原抗体识别具有很强的亲和力,但比天然状态下的T细胞需要更多更强的靶抗原表达才能有效激活CAR-T细胞。实验研究表明超过20%的病人在接受CD19-CAR-T细胞治疗后出现癌症复发,以及在最近的CD22-CAR临床试验中,超过50%的患者在获得完全缓解后出现疾病的复发,而复发的主要原因是肿瘤细胞的靶抗原表达降低,从而导致免疫逃逸。因此,如何根据天然状态下T细胞的识别程序来优化CAR-T细胞的结构设计,提高CAR-T细胞对靶抗原低表达的肿瘤细胞的识别和杀伤,有利于开发出更有效的CAR-T治疗方法。γC家族细胞因子在促进T细胞生长、对抗肿瘤和促使记忆性T细胞的生成以抵抗肿瘤转移或复发方面发挥关键作用。白介素-21（Interleukin-21,IL-21）主要激活的信号转导和转录激活因子不同于其他γC家族的细胞因子,使其在抗肿瘤免疫中有其独特的作用。本实验旨在探究在CAR-T制备过程中添加IL-21会对CAR-T的生产带来哪些影响,从而优化CAR-T细胞的制备过程。目前所知,最少有三种酪氨酸激酶参与了T细胞活化的早期磷酸化事件。其中淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(P56Lymphocyte-specific tyrosine kinase,P56LCK)主要表达在T细胞的细胞膜上和细胞质中。遗传学研究表明P56LCK对T细胞的活化十分重要,P56LCK的缺失突变可致T细胞的发育不良。在T细胞的免疫突触形成过程中,配体与受体结合引起膜受体位置和构型改变,膜受体发生交联。CD3、CD4或CD8分子的胞浆区尾部聚集在一起,CD4或CD8分子胞内区相连的蛋白酪氨酸激酶P56LCK发生磷酸化而激活,继而使CD3分子中的免疫受体酪氨酸激活基序（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM）发生酪氨酸磷酸化激活T细胞。而CD4和CD8分子与P56LCK结合的区域是一段相似的包含两个半胱氨酸的带负电荷区域。我们将设计的优化的半胱氨酸序列串联到CAR的胞内区,探究该优化结构对CAR-T细胞的抗肿瘤能力的影响。我们希望通过优化CAR-T细胞的制备过程和CAR结构提高CAR-T细胞抗肿瘤效果,为临床CAR-T细胞技术更好的应用提供参考。方法:（1）采用分子克隆构建人类表皮生长因子受体-2（Human epidermal growth factor receptor-2,HER-2）CAR质粒,和TR1419-28ξCAR（28CAR）、TR1419-BBξCAR（137CAR）、优化质粒TR1419-BBξLCK1CAR（137LCK1）、优化质粒TR1419-BBξLCK2CAR（137LCK2）及其他相关质粒,并进行酶切和测序验证。（2）设计8组细胞因子组合（不含IL-21:白介素-2（Interleukin-2,IL-2）、白介素-7（Interleukin-7,IL-7）、白介素-15（Interleukin-15,IL-15）、IL-7+IL-15;含IL-21:IL-2+IL-21、IL-7+IL-21、IL-15+IL-21、IL-7+IL-15+IL-21）,分别用于培养制备HER-CAR-T细胞,采用自动细胞计数仪计数不同细胞因子组合培养的T细胞数,流式细胞术检测不同细胞因子组合培养的T细胞的CAR转染率和HER-CAR-T细胞的表型。（3）流式细胞术检测几组构建成功的TR1419-CAR-T细胞亚型和抑制性分子程序性死亡受体1（Programmed cell death protein 1,PD-1）、淋巴细胞激活基因3（Lymphocyte activation gene 3,LAG-3）和T细胞膜蛋白3（T-Cell membrane protein 3,TIM-3）表达水平,并比较CAR的表达强度。（4）T细胞的干扰素-gamma（Interferon-γ,IFN-γ）检测。采用流式细胞术和酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,EIISA）检测在不同时间段不同细胞因子组合培养的活化T细胞的IFN-γ表达。（5）CAR-T细胞的杀伤功能检测。流式细胞术检测肿瘤细胞的靶抗原表达并选取表达阳性的的肿瘤细胞作为靶细胞,钙黄绿素释放试验检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果。ELISA检测杀伤上清中IFN-γ和颗粒酶B（Granzyme B,Gzms B）的含量。（6）各组TR1419-CAR-T细胞和肿瘤细胞共孵育培养7天,流式细胞术检测CAR-T细胞的增值、亚型分化和抑制性分子表达,确定137LCK2-T是否具有更好的持久性特征。结果:第一部分:（1）我们成功构建了HER-2-CAR相关质粒并建立慢病毒转染方法,可有效制备CAR-T细胞。（2）IL-21提高了T细胞的慢病毒转染率。4组不含IL-21的细胞因子组合培养的T细胞CAR转染率无显着差异,均在15%-30%之间。4组添加IL-21的细胞因子组合培养的T细胞CAR转染率也无明显差异,均在25%-40%之间。其中,添加IL-21的细胞因子组合培养的T细胞均比对应的不含IL-21的细胞因子组合培养的T细胞有更高的慢病毒转染率。（3）IL-21调控T细胞活化早期IFN-γ的表达。实验结果发现在T细胞活化后的前6小时,IL-2+IL-21、IL-7+IL-21和IL-15+IL-21组的T细胞比对应的IL-2、IL-7和IL-15组的T细胞表达更高水平的IFN-γ。在T细胞活化的24-48小时,添加IL-21的4组细胞因子组合培养的T细胞比不含IL-21的4组细胞因子组合培养的T细胞表达更低水平的IFN-γ。最后,我们发现CD8+T细胞转染效率与其在转染时刻IFN-γ表达呈显着负相关。（4）IL-21提高了T细胞的增殖。IL-7+IL-21、IL-15+IL-21和IL-7+IL-15+IL-21组的T细胞在转染后培养12天的增殖倍数显着高于对应的IL-7、IL-15和IL-7+IL-15组的T细胞增值倍数。其中,IL-21的添加尽管提高了IL-7组的T细胞的增殖,但协同IL-7介导的T细胞增值倍数仍显着低于其他细胞因子组合培养的T细胞增殖倍数。（5）IL-21提高初始T细胞（Na?ve T,Tn）在CAR-T细胞中的比例。八组细胞因子组合培养的CAR-T细胞的亚型均以Tn为主,占比50%-80%。其中,IL-7+IL-21组的CAR-T细胞的Tn占比最高,其次是IL-15+IL-21组。而IL-2组的CAR-T细胞的Tn占比最少,其次是IL-2+IL-21组。我们还发现添加了IL-21的细胞因子组合培养的CAR-T细胞的Tn占比均比对应的不含IL-21细胞因子组合培养的CAR-T细胞的Tn占比更高。（4）IL-21增强CAR-T细胞的特异性杀伤能力。8组细胞因子组合培养的HER-2 CAR-T细胞均对HER-2阳性的肿瘤细胞具有良好的杀伤能力并伴随着显着的INF-γ和Granzyme B的分泌。其中,添加了IL-21的细胞因子组合培养的HER-2 CAR-T细胞对HER-2阳性的肿瘤细胞具有更强的杀伤能力和更高的效应细胞因子的分泌。几组细胞因子组合培养的HER-2 CAR-T细胞对HER-2阴性的肿瘤细胞未表现出显着高于对照T细胞的杀伤能力和细胞因子分泌。第二部分:（1）完成了二代和半胱氨酸结构域优化的靶向TRAIL-R1的CAR质粒的构建工作,质粒测序结果和原始序列匹配。采用慢病毒转染Jurkat细胞和T细胞,均能成功转染表达CAR基因。（2）将137CAR以及优化设计的137LCK0、137LCK1和137LCK2转染Jurkat细胞,采用不同浓度的靶抗原（TRAIL-R1-Fc融合蛋白）刺激,检测几组CAR-Jurkat细胞的CD69表达,137LCK2-Jurkat在低浓度的靶抗原刺激下比其他组表达更高的CD69,因此筛选137LCK2用于后续实验。（3）28CAR、137CAR和137LCK2转染T细胞,几组CAR-T细胞的转染率均在30%-40%,且平均荧光强度无显着差异。几组CAR-T细胞的PD-1、LAG-3和TIM-3表达相当。其中,CD4+CAR-T细胞比CD8+CAR-T细胞表达更高水平的PD-1,而CD8+CAR-T细胞比CD4+CAR-T细胞表达更高水平的LAG-3和TIM-3。分析比较几组CAR-T细胞的亚型占比,均以初始T细胞（Na?ve T,Tn）为主,占比约50%,Tn在28CAR-T细胞中的比例略高于其他组。（4）采用不同浓度的靶抗原刺激几组CAR-T细胞,几组CAR-T细胞的CD137表达随靶抗原浓度的降低表达下降,其中137LCK2-T细胞在多种靶抗原浓度刺激下均比137CAR-T表达更高的CD137,而其他几组CAR-T细胞未表现出显着差异。我们根据肿瘤细胞表面TRAIL-R1的表达水平,选择HS578-T、和SW480作为杀伤试验的靶细胞,三组CAR-T细胞均能有效杀伤表达TRAIL-R1的肿瘤细胞,且三组CAR-T细胞对HS578-T和SW480的杀伤率无明显差异。（5）几组CAR-T细胞在靶抗原的刺激下培养7天后,几组CAR-T细胞均是以Tn为主。其中CD4+CAR-T细胞以中央记忆性T细胞（Central memory T,Tcm）为主,CD8+CAR-T细胞中以Tn为主。效应记忆型T细胞（Effect memory T,Tem）和效应T细胞（Effect T,Te）在几组CAR-T细胞中的比例无显着差异。同时,在137LCK2细胞中,有更多的Tn分化成Tcm。另一方面,CD4+137LCK2-T和CD8+137LCK2-T细胞的增殖速率均明显高于其他组的CAR-T细胞,且137LCK2细胞表达更低的LAG-3。结论:一方面,我们发现IL-21提高T细胞的慢病毒转染效率,并调控T细胞活化早期IFN-γ的表达,且IL-21对T细胞IFN-γ表达的调控可能是其提高慢病毒转染率的部分原因。我们证实IL-21提高了低分化CAR-T细胞的富集和扩增,增强CAR-T细胞的特异性杀伤能力。另一方面,我们通过在CAR的胞内段连接一段特定半胱氨酸序列模拟CD4/CD8共受体在T细胞活化信号转导中的作用,该优化方式提高了CAR-T细胞对靶抗原的灵敏度,增强了CAR-T细胞在靶抗原刺激下的增殖,促进了CAR-T细胞的Tcm分化,且降低了抑制性分子LAG-3的表达。本实验通过对CAR-T细胞的制备过程和CAR机构的优化为CAR-T细胞抗肿瘤治疗提供了新策略。
二、CD45—淋巴细胞活化的重要调节分子（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、CD45—淋巴细胞活化的重要调节分子（论文提纲范文）
（1）老年人群接种四价灭活流感病毒裂解疫苗免疫机制的系统生物学研究（论文提纲范文）
| 武汉生物制品研究所博士学位论文创新点概述 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1. 前言 |
| 1.1 立题依据 |
| 1.2 研究进展 |
| 1.3 研究内容和目标 |
| 2. 第一章60周岁及以上老年人群免疫QIVs前后外周全血Total mRNA表达谱研究 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 3. 第二章60周岁及以上老年人群QIVs免疫前后T淋巴细胞分布及动力学特征 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4. 第三章 老年人群QIVs免疫反应主要细胞因子与免疫球蛋白Ig产生及动力学特征 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5. 全文创新性总结 |
| 6. 文献综述--老年人群流感病毒疫苗有效性评价所面临的挑战 |
| 6.1 影响流感病毒疫苗有效性评价的混杂因素 |
| 6.2 流感病毒免疫史对流感病毒疫苗有效性评价的影响 |
| 6.3 流行病学研究提升针对老年人群开发下一代流感病毒疫苗 |
| 6.4 结论 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录a. 受试者入选、排除标准及提前终止实验标准 |
| 附录b. 实验组和对照组QIVs疫苗株 |
| 附录c. 63 份老年人外周全血转录组测序原始数据Raw-Data存储于GEO公共数据库 |
| 附录d. Supplementary Materials (Figure S and Table S) |
| Figure S |
| Table S |
| References |
（2）1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 课题的假设与提出 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 1型糖尿病免疫系统异常概述 |
| 2.1.1 适应性免疫系统与1型糖尿病 |
| 2.1.2 先天性免疫系统与1型糖尿病 |
| 2.1.3 免疫治疗在1型糖尿病中的应用 |
| 2.2 SLAM分子家族在免疫系统异常疾病中的表达 |
| 2.2.1 SLAM分子家族概述 |
| 2.2.2 SLAM分子家族在多种疾病中异常表达 |
| 2.3 SLAMF4(CD244)研究现状综述 |
| 2.3.1 SLAMF4(CD244)的结构与功能 |
| 2.3.2 SLAMF4(CD244)的异常表达与疾病 |
| 2.3.3 SLAMF4(CD244)的应用前景与展望 |
| 第3章 T1DM患者免疫系统变化及SLAM分子家族表达 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 人外周血来源 |
| 3.2.2 材料和试剂 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 研究对象入组及排除标准 |
| 3.3.2 生化的测定 |
| 3.3.3 密度梯度离心法分离PBMC |
| 3.3.4 细胞外标志物染色 |
| 3.3.5 细胞内Foxp3 染色 |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 T1DM患者及HCs基线指标及生化检测结果 |
| 3.4.2 T1DM患者及HCs外周血PBMC中T细胞表达 |
| 3.4.3 T1DM患者及HCs外周血PBMC中B细胞表达 |
| 3.4.4 T1DM患者及HCs外周血PBMC中NK细胞表达 |
| 3.4.5 T1DM患者及HCs外周血PBMC中髓系细胞表达 |
| 3.4.6 各免疫细胞表面SLAM分子家族表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 T1DM患者T细胞表面SLAMF4 分子表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 人外周血来源 |
| 4.2.2 材料和试剂 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 研究对象入组及排除标准 |
| 4.3.2 生化及一般临床资料的测定 |
| 4.3.3 密度梯度离心法分离PBMC |
| 4.3.4 细胞外标志物染色 |
| 4.3.5 细胞内IFN-γ/TNF-a染色 |
| 4.3.6 统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 T1DM患者及HCs外周血T细胞SLAMF4分子表达 |
| 4.4.2 T1DM患者及HCs外周血T细胞亚群SLAMF4分子表达 |
| 4.4.3 SLAMF4分子表达与细胞活化的状态有关 |
| 4.4.4 T1DM患者外周血SLAMF4分子表达与一般临床资料相关性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 NOD小鼠免疫细胞分化及SLAMF4分子表达 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和动物 |
| 5.2.1 材料和试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验动物 |
| 5.2.4 垫料与饲料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 NOD小鼠体重及一般情况 |
| 5.3.2 NOD小鼠血糖的测量 |
| 5.3.3 检测小鼠外周血免疫细胞分化及血清分离 |
| 5.3.4 胰腺淋巴结单细胞悬液制备 |
| 5.3.5 小鼠尾静脉采血及血清分离 |
| 5.3.6 密度梯度离心法分离小鼠外周血单个核细胞 |
| 5.3.7 细胞外标志物染色 |
| 5.3.8 苏木精-伊红(hematoxylin and eosin stain,HE)染色 |
| 5.3.9 统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 NOD小鼠1型糖尿病发病情况 |
| 5.4.2 NOD小鼠外周血T细胞亚群分布异常 |
| 5.4.3 NOD小鼠T细胞表面SLAMF4分子异常表达 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 SLAMF4调控CD8~+T细胞的增殖与凋亡 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 人脐带血来源 |
| 6.2.2 正常人外周血来源 |
| 6.2.3 T1DM患者外周血来源 |
| 6.2.4 材料与试剂 |
| 6.2.5 仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 密度梯度离心法分离脐带血单个核细胞 |
| 6.3.2 磁珠分选脐带血CD8~+T细胞 |
| 6.3.3 体外培养脐带血来源的CD8~+T细胞 |
| 6.3.4 流式分选T1DM患者SLAMF4~+及SLAMF4~-CD8+T细胞转录组测序 |
| 6.3.5 磁珠分选正常人外周血来源的CD8~+T细胞 |
| 6.3.6 流式分选正常人SLAMF4~+CD8+T细胞及SLAMF4~-CD8+T细胞 |
| 6.3.7 细胞凋亡检测 |
| 6.3.8 细胞增殖检测 |
| 6.3.9 统计分析 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 体外培养脐带血来源CD8~+T细胞SLAMF4表达情况 |
| 6.4.2 T1DM患者SLAMF4~+及SLAMF4~-CD8+T细胞的RNA测序 |
| 6.4.3 SLAMF4与CD8+T细胞凋亡 |
| 6.4.4 SLAMF4与CD8+T细胞增殖 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第7章 T1DM免疫损伤机理及SLAMF分子异常表达的思考 |
| 第8章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性及促造血功能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词索引表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 胸腺肽的研究进展 |
| 1.1.1 胸腺肽概述 |
| 1.1.2 胸腺肽作用研究 |
| 1.2 免疫系统的研究进展 |
| 1.2.1 免疫系统的组成 |
| 1.2.2 免疫系统的功能 |
| 1.2.3 免疫系统影响因素 |
| 1.2.4 免疫系统与肿瘤发生发展的关系 |
| 1.2.5 造血与免疫系统 |
| 1.3 免疫治疗在结直肠癌治疗中的研究进展 |
| 1.3.1 肿瘤免疫治疗 |
| 1.3.2 免疫治疗在结直肠癌治疗中的应用 |
| 1.4 化疗引起的造血功能障碍研究进展 |
| 1.5 立题背景及意义 |
| 第2章 小牛胸腺肽成分分析研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 CTP分子量测定 |
| 2.3.2 CTP中氨基酸含量的测定 |
| 2.3.3 CTP中核苷酸含量的测定 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 分子量测定结果 |
| 2.4.2 氨基酸含量测定结果 |
| 2.4.3 核苷酸含量测定结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 试剂盒和抗体信息 |
| 3.2.4 实验细胞及动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 免疫低下小鼠模型的构建及分组给药 |
| 3.3.2 小鼠样品采集及脏器指数检测 |
| 3.3.3 NK细胞杀伤活性及淋巴细胞转化活性 |
| 3.3.4 小鼠肝脏、脾脏、肾脏病理学检测 |
| 3.3.5 小鼠生化指标测定 |
| 3.3.6 APC小鼠分组给药 |
| 3.3.7 小鼠样品采集及脏器指数、肠道指数检测 |
| 3.3.8 小鼠外周血有核细胞制备、染色及流式测定 |
| 3.3.9 小鼠肠道菌群检测及分析 |
| 3.3.10 小鼠结直肠及脏器组织病理学检查 |
| 3.3.11 小鼠脾脏和肿瘤组织中相关蛋白免疫组化检测 |
| 3.3.12 小鼠生化指标测定 |
| 3.3.13 Western blot分析 |
| 3.3.14 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CTP对免疫低下小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 3.4.2 CTP对免疫低下小鼠NK细胞杀伤活性的影响 |
| 3.4.3 CTP对免疫低下小鼠淋巴细胞转化活性的影响 |
| 3.4.4 CTP对免疫低下小鼠脏器组织病理学的影响 |
| 3.4.5 CTP对免疫低下小鼠免疫相关细胞因子的影响 |
| 3.4.6 CTP对 APC小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 3.4.7 CTP对 APC小鼠结直肠肿瘤和肠道指数的影响 |
| 3.4.8 CTP对 APC小鼠肿瘤组织病理学的影响 |
| 3.4.9 CTP对 APC小鼠脏器组织病理学的影响 |
| 3.4.10 CTP对 APC小鼠外周血中免疫细胞的影响 |
| 3.4.11 CTP对 APC小鼠脾脏和结直肠肿瘤中免疫相关蛋白的影响 |
| 3.4.12 CTP对 APC小鼠血清和结肠中免疫相关细胞因子的影响 |
| 3.4.13 CTP对 APC小鼠肠道菌群物种组成的影响 |
| 3.4.14 小鼠肠道菌群Alpha多样性分析 |
| 3.4.15 小鼠肠道菌群Beta多样性分析 |
| 3.4.16 小鼠肠道菌群差异性分析 |
| 3.4.17 CTP对 APC小鼠肿瘤组织和脾脏中相关蛋白表达的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 小牛胸腺肽促造血功能活性的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器与材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 试剂盒及抗体信息 |
| 4.2.4 实验细胞及动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 K562 细胞和CHRF细胞的铺板及CTP给药 |
| 4.3.2 细胞活性检测 |
| 4.3.3 细胞凋亡检测 |
| 4.3.4 K562 细胞联苯胺染色 |
| 4.3.5 Western blot分析 |
| 4.3.6 造血功能障碍小鼠模型的构建及CTP给药 |
| 4.3.7 样品采集及脏器指数检测 |
| 4.3.8 外周血细胞计数 |
| 4.3.9 小鼠骨髓有核细胞制备,染色及流式细胞术测定 |
| 4.3.10 小鼠骨髓及脏器组织病理学检测 |
| 4.3.11 蛋白质组学分析筛选细胞因子 |
| 4.3.12 小鼠生化指标测定 |
| 4.3.13 Western blot分析 |
| 4.3.14 小鼠骨髓有核细胞制备及给药 |
| 4.3.15 Western blot分析 |
| 4.3.16 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 CTP对 K562 细胞和CHRF细胞活性的影响 |
| 4.4.2 CTP对 K562 细胞和CHRF细胞凋亡的影响 |
| 4.4.3 CTP对K562 细胞分化能力的影响 |
| 4.4.4 CTP对 K562 细胞和CHRF细胞增殖分化相关蛋白的影响 |
| 4.4.5 CTP对造血功能障碍小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 4.4.6 CTP对造血功能障碍小鼠外周血细胞的影响 |
| 4.4.7 CTP对造血功能障碍小鼠骨髓细胞的影响 |
| 4.4.8 CTP对造血功能障碍小鼠骨髓和脏器组织病理学的影响 |
| 4.4.9 CTP对造血功能障碍小鼠细胞因子的影响 |
| 4.4.10 CTP对造血功能障碍小鼠脾脏中相关通路蛋白的影响 |
| 4.4.11 CTP对小鼠原代骨髓细胞中相关通路蛋白的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论和展望 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及在攻读博士学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（4）CpG 685针对不同类型急性B淋巴细胞白血病的作用及其差异分子机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 综述 Toll样受体的免疫调控机制及其所介导的肿瘤细胞死亡方式 |
| 2.1 Toll样受体 |
| 2.2 基于TLRs的免疫调节机制 |
| 2.2.1 肿瘤微环境的免疫平衡 |
| 2.2.2 TLRs对抗原提呈细胞的免疫调节机制 |
| 2.2.3 TLRs对巨噬细胞的免疫调节机制 |
| 2.3 TLRs所介导的细胞死亡的作用机制 |
| 2.4 TLRs在肿瘤治疗中的临床试验研究 |
| 2.4.1 TLR2 相关的临床研究 |
| 2.4.2 TLR3 相关的临床研究 |
| 2.4.3 TLR4 相关的临床研究 |
| 2.4.4 TLR5 相关的临床研究 |
| 2.4.5 TLR7/8 相关的临床研究 |
| 2.4.6 TLR9 相关的临床研究 |
| 2.4.7 传统抗肿瘤治疗对TLR通路的影响 |
| 2.5 总结和展望 |
| 第3章 材料和方法 |
| 3.1 主要仪器设备 |
| 3.2 主要耗材 |
| 3.3 主要抗体列表 |
| 3.3.1 流式抗体列表 |
| 3.3.2 Western Blot抗体列表 |
| 3.4 主要试剂 |
| 3.5 临床样本 |
| 3.5.1 研究对象 |
| 3.5.2 纳入标准 |
| 3.5.3 排除标准 |
| 3.5.4 资料收集及分组 |
| 3.5.5 随访 |
| 3.6 细胞系及培养条件 |
| 3.7 CpG基序的单链脱氧寡核苷酸(CpG ODNs)的制备 |
| 3.8 RNA提取、逆转录条件 |
| 3.9 普通PCR和实时定量PCR |
| 3.10 主要引物序列 |
| 3.11 细胞凋亡测定 |
| 3.12 细胞周期测定 |
| 3.13 细胞表面及细胞胞内蛋白测定 |
| 3.14 蛋白印迹试验 |
| 3.15 蛋白纯化及免疫沉淀 |
| 3.16 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)检测 |
| 3.17 信号通路抑制剂 |
| 3.18 免疫荧光共聚焦显微镜成像 |
| 3.19 急性B淋巴细胞白血病NCG小鼠移植瘤模型的建立 |
| 3.20 CT26 小鼠皮下移植瘤模型的建立 |
| 3.21 小鼠全身免疫微环境的测定 |
| 3.22 统计学分析 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 TLR9在B-ALL患者PBMC中的表达情况 |
| 4.2 TLR9 的表达与B-ALL患者预后的相关性 |
| 4.3 B-ALL细胞系的选择及鉴定 |
| 4.4 TLR9 激动剂——CpG 685对B-ALL细胞系的体外效应 |
| 4.5 CpG 685 对小鼠肿瘤负荷和生存期的影响 |
| 4.6 CpG 685 诱导BLIN-1 细胞凋亡的分子机制 |
| 4.6.1 CpG 685 激活BLIN-1 细胞中的TLR9 下游信号通路 |
| 4.6.2 CpG 685 通过P38 MAPK信号通路诱导BLIN-1 细胞凋亡 |
| 4.6.3 CpG 685 通过JNK/C-MYC信号通路诱导BLIN-1 细胞凋亡 |
| 4.6.4 C-MYC过表达对CpG 685 诱导的BLIN-1 细胞凋亡至关重要 |
| 4.7 不同类型B-ALL对 CpG 685 具有异质性的影响因素 |
| 4.8 Sup-B15 细胞系对CpG 685 耐药的机制 |
| 4.9 联合应用CpG 685 和伊马替尼逆转单药耐药的分子机制 |
| 4.10 联合应用CpG 685 和伊马替尼对Sup-B15 移植瘤小鼠的肿瘤负荷和生存期的影响 |
| 4.11 CpG 685 对原代B-ALL细胞的反应性 |
| 4.12 CpG ODN对小鼠机体免疫状态的调控 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果及奖励 |
| 致谢 |
（5）Th17细胞中SOX-5介导RORγt基因新的增强子RORCE2与启动子相互作用的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 增强子RORCE2 通过增强RORγt的表达促进Th17 细胞的分化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 SOX-5 介导增强子RORCE2与RORγt启动子的相互作用影响Th17 细胞的分化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 Th17 细胞中SOX-5与STAT3 协同诱导增强子RORCE2 的染色质开放 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Th17 细胞中RORγt转录调控及转录后调控的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（6）利用人源化小鼠模型研究人肺脏对于甲型流感病毒感染后的免疫应答（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 课题的假设与提出 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 甲型流感病毒的概述 |
| 2.1.1 流行病学 |
| 2.1.2 结构及致病机制 |
| 2.1.3 预防和治疗 |
| 2.2 流感病毒感染后机体的免疫应答 |
| 2.2.1 病毒如何进入宿主 |
| 2.2.2 病毒编码的几种蛋白 |
| 2.2.3 固有免疫反应 |
| 2.2.4 适应性免疫反应 |
| 2.3 人源化小鼠模型的发展和应用 |
| 2.3.1 人源化小鼠模型的发展 |
| 2.3.2 人源化小鼠模型在流感病毒研究中的应用 |
| 2.4 组织定居记忆性T细胞 |
| 2.4.1 概述 |
| 2.4.2 特征 |
| 2.4.3 发展 |
| 2.4.4 Trm与呼吸系统 |
| 第3章 人免疫系统-人肺小鼠模型的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 人胚胎组织来源 |
| 3.2.3 材料及试剂 |
| 3.2.4 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 人胚胎肺脏组织处理 |
| 3.3.2 人胚胎肝脏来源CD34~+细胞的分离 |
| 3.3.3 人胚胎胸腺组织处理 |
| 3.3.4 NCG小鼠皮下人肺组织移植模型的构建 |
| 3.3.5 HISL小鼠模型的构建 |
| 3.3.6 HISL小鼠构建后流式细胞术鉴定免疫系统重建水平 |
| 3.3.7 HISL小鼠取材检测 |
| 3.3.8 HISL小鼠各组织器官HE染色 |
| 3.3.9 流式细胞术染色方案 |
| 3.3.10 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 NCG小鼠皮下人肺组织移植模型的构建 |
| 3.4.2 HISL小鼠模型构建 |
| 3.4.3 HISL小鼠免疫系统的重建水平 |
| 3.4.4 HISL小鼠建立后HL结构及其中免疫细胞的水平 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 人免疫系统-人肺小鼠流感病毒感染后的免疫应答 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 SPF鸡蛋 |
| 4.2.3 甲型流感病毒和MDCK细胞 |
| 4.2.4 材料和试剂 |
| 4.2.5 仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 种蛋孵育 |
| 4.3.2 甲型流感病毒的扩增 |
| 4.3.3 甲型流感病毒血凝值的测定 |
| 4.3.4 甲型流感病毒TCID50测定 |
| 4.3.5 人免疫系统-人肺小鼠建立及鉴定 |
| 4.3.6 人免疫系统-人肺小鼠感染甲型流感病毒 |
| 4.3.7 感染甲型流感病毒后21天取材检测 |
| 4.3.8 流感病毒特异性IgM、IgG抗体ELISA检测 |
| 4.3.9 各器官组织化学染色 |
| 4.3.10 流式细胞术染色方案 |
| 4.3.11 转录组测序分析 |
| 4.3.12 统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 H1N1流感病毒效价及TCID50 |
| 4.4.2 HISL小鼠感染H1N1后免疫细胞的总体变化 |
| 4.4.3 HISL小鼠感染H1N1病毒后T细胞亚群的表达情况 |
| 4.4.4 HISL小鼠感染H1N1病毒后病毒特异性T细胞的产生 |
| 4.4.5 HISL小鼠感染H1N1病毒后血清特异性抗体的产生 |
| 4.4.6 HISL小鼠感染H1N1病毒后HL基因组测序分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 流感病毒预先接种对人免疫系统-人肺小鼠产生保护作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 材料和试剂 |
| 5.2.3 仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 甲型流感病毒的扩增及TCID50 测定 |
| 5.3.2 人源化小鼠模型建立 |
| 5.3.3 人免疫系统-人肺小鼠的建立 |
| 5.3.4 甲型流感病毒经鼻接种 |
| 5.3.5 统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 单次H1N1病毒接种未能给予人免疫系统-人肺小鼠良好的保护作用 |
| 5.4.2 多次H1N1病毒接种可延长致死剂量H1N1病毒经鼻接种小鼠的生存时间 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）CXCL13趋化型CAR-T细胞对骨肉瘤治疗及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 研究背景及文献综述 |
| 1.骨肉瘤及其治疗现状 |
| 1.1 骨肉瘤的危害 |
| 1.2 骨肉瘤的免疫微环境 |
| 1.3 骨肉瘤的免疫治疗概况 |
| 2.NK G2D配体在骨肉瘤中的表达 |
| 3.趋化因子CXCL13与CXCR5 在肿瘤中的作用 |
| 4.肿瘤微环境 |
| 4.1 肿瘤浸润的MDSCs细胞 |
| 4.2 肿瘤浸润的巨噬细胞 |
| 4.3 肿瘤浸润的Tregs细胞 |
| 5.嵌合抗原受体T细胞免疫疗法及其研究进展 |
| 5.1 CAR-T概述 |
| 5.2 嵌合抗原受体的结构 |
| 5.3 CAR-T细胞治疗研究进展 |
| 6.NFAT信号通路及其作用机制 |
| 第二章 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞治疗骨肉瘤的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 CXCL13 与骨肉瘤的关系 |
| 2.3 Mock-CAR、NKG2D-CAR、CXCR5-NKG2D-CAR的构建和T细胞的感染 |
| 2.4 CAR-T细胞的制备 |
| 2.5 CAR-T细胞体外活性研究 |
| 2.6 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞机制研究 |
| 2.7 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞治疗骨肉瘤体内研究 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 CXCL13 的表达量与骨肉瘤病人免疫和生存期的关系 |
| 3.2 Mock、NKG2D、CXCR5-NKG2D CAR表达载体、病毒包装和T细胞的感染 |
| 3.3 Mock-CAR-T、NKG2D-CAR-T和 CXCR5-NKG2D-CAR-T体外活性 |
| 3.4 CXCR5增强NKG2D-CAR-T细胞活性的机制研究 |
| 3.5 CXCR5 增强了NKG2D-CAR-T的体内抗肿瘤活性 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三章 mCXCR5-NKG2D-CAR-T对骨肉瘤肿瘤免疫微环境的影响 |
| 1.引言 |
| 2.实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞的体外活性研究 |
| 2.4 CXCR5-NKG2D-CAR-T细胞对BALB/c骨肉瘤小鼠的治疗 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 鼠源CAR-T细胞和鼠源靶细胞的制备 |
| 3.2 mCXCR5-NKG2D-CAR-T细胞体外活性检测 |
| 3.3 mCXCR5-NKG2D-CAR-T细胞的体内活性检测 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 简历 |
| 已发表文章 |
| 发表专利 |
| 获得奖励 |
| 致谢 |
| 附件一 RNA测序后定量PCR引物序列 |
（8）ITP中骨髓T细胞转录组图谱构建及免疫检查点单核苷酸多态性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 中文正文 |
| 第一部分: 免疫性血小板减少症中骨髓T细胞的转录组图谱构建及亚群特征研究 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: T细胞免疫检查点单核苷酸多态性与免疫性血小板减少症相关性研究 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 补充图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文及参加学术会议 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文正文 |
| Part Ⅰ: Construction and Characterization of the Transcriptome Map of Bone Marrow T Cells in Immune Thrombocytopenia |
| Abstract |
| Introduction |
| Materials and Methods |
| Results |
| Discussion |
| Figures |
| Tables |
| References |
| Part Ⅱ Immune Checkpoint-Related Single Nucleotide Polymorphisms Are Associated with Immune Thrombocytopenia |
| Abstract |
| Introduction |
| Materials and Methods |
| Results |
| Discussion |
| Figures |
| Tables |
| Supplementary Materials |
| References |
（9）转录因子Zhx2抑制NK细胞的成熟及抗肿瘤功能的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 一、Zhx2缺失促进NK细胞成熟 |
| 1. Zhx2高表达于不同来源NK细胞 |
| 2. Zhx2敲除导致成熟NK细胞比例升高 |
| 3. Zhx2内源性抑制NK细胞发育成熟 |
| 二、Zhx2抑制NK细胞的功能 |
| 1. Zhx2敲除NK细胞的活化性受体表达升高、抑制性受体表达降低 |
| 2. Zhx2敲除NK细胞具有更强的细胞因子分泌及杀伤分子表达能力 |
| 3. Zhx2敲除NK细胞具有更强的细胞毒作用 |
| 4. Zhx2敲除NK细胞对体内肿瘤具有更强的杀伤能力 |
| 5. ZHX2抑制人NK细胞系NK92细胞功能 |
| 三、Zhx2缺失明显促进NK细胞抵抗凋亡 |
| 1. Zhx2缺失不影响NK细胞的增殖 |
| 2. Zhx2缺失促进NK细胞的凋亡抵抗能力 |
| 四、Zhx2缺失促进NK细胞对IL-15的应答 |
| 1. Zhx2缺失促进NK细胞IL-15信号通路活化 |
| 2. Zhx2缺失促进IL-15介导的NK细胞功能增强 |
| 3. Zhx2通过IL-15信号通路调控NK细胞存活及功能 |
| 五、Zhx2通过抑制Zeb2转录,抑制NK细胞发育 |
| 1. Zhx2缺失导致NK细胞转录调控网络发生改变 |
| 2. Zhx2调控NK细胞成熟相关基因转录 |
| 3. Zhx2与Zeb2启动子区域结合并转录调控Zeb2 |
| 4. Zhx2通过Zeb2抑制NK细胞的成熟及功能 |
| 六、Zhx2缺陷NK细胞能够更好的抑制体内肿瘤生长 |
| 1. 肝癌患者Zhx2表达与NK细胞在肿瘤中的浸润负相关 |
| 2. Zhx2缺陷NK细胞能够更好的抑制肿瘤生长转移 |
| 3. 干预ZHX2有效提升人NK细胞抗肿瘤治疗效果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 NK细胞研究新进展及其在肿瘤细胞治疗中的意义 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 英文文章 |
| Western Blot原始数据 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）嵌合抗原受体T细胞疗法的优化策略研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分:IL-21增强T细胞的慢病毒转染和CAR-T细胞的抗肿瘤杀伤作用研究 |
| 第一节 IL-21 增强T细胞的慢病毒转染 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二节 IL-21 增强CAR-T细胞的抗肿瘤杀伤 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分:CD4/CD8 独特的半胱氨酸结构域增强CAR-T细胞的抗肿瘤杀伤 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 嵌合抗原受体 T 细胞在实体肿瘤免疫治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间发表的论文和参与的科研项目 |
四、CD45—淋巴细胞活化的重要调节分子（论文参考文献）
- [1]老年人群接种四价灭活流感病毒裂解疫苗免疫机制的系统生物学研究[D]. 杨景. 武汉生物制品研究所, 2021(01)
- [2]1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究[D]. 孙琳. 吉林大学, 2021(01)
- [3]基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性及促造血功能的研究[D]. 李兰洲. 吉林大学, 2021(01)
- [4]CpG 685针对不同类型急性B淋巴细胞白血病的作用及其差异分子机制的研究[D]. 白玲. 吉林大学, 2021(01)
- [5]Th17细胞中SOX-5介导RORγt基因新的增强子RORCE2与启动子相互作用的机制研究[D]. 韩超. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [6]利用人源化小鼠模型研究人肺脏对于甲型流感病毒感染后的免疫应答[D]. 王亦心. 吉林大学, 2021(01)
- [7]CXCL13趋化型CAR-T细胞对骨肉瘤治疗及其机制的研究[D]. 张利. 华东师范大学, 2021(12)
- [8]ITP中骨髓T细胞转录组图谱构建及免疫检查点单核苷酸多态性研究[D]. 王姝文. 山东大学, 2021(10)
- [9]转录因子Zhx2抑制NK细胞的成熟及抗肿瘤功能的作用及机制[D]. 谭思雨. 山东大学, 2021(11)
- [10]嵌合抗原受体T细胞疗法的优化策略研究[D]. 杜丽. 重庆医科大学, 2021(01)