王斌生 李强 柴琛
兰州大学第一医院 甘肃兰州 730030
【摘 要】目的 检测姜黄素对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制。方法 利用CCK-8技术检测不同浓度姜黄素刺激处理胃癌细胞系BGC823和SGC7901后对细胞增殖的影响。利用流式细胞术检测药物处理后胃癌细胞凋亡水平。采用Western blot技术检测药物处理后增殖和凋亡相关蛋白的表达情况。结果 姜黄素能够抑制胃癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，且呈剂量依赖性。WB结果显示姜黄素抑制细胞增殖相关蛋白的表达，促进凋亡相关蛋白的表达。结论 姜黄素能够抑制胃癌细胞系BGC823和SGC7901的增殖，其机制可能是通过激活caspase途径可诱导细胞凋亡，提示姜黄素在胃癌的治疗中具有潜在的应用价值。
【关键词】姜黄素；胃癌；细胞增殖；细胞凋亡
The Effect of Curcumin on Proliferation and Apoptosis of the Gastric Cancer Cell
Objective To investigate the anti-tumor effect of curcumin on gastric cell lines BGC823 and SGC7901 and mechanisms.Methods In this study，we employed CCK-8 assay to detect the effect of different concentrations of curcumin on the proliferation of gastric cancer cell lines BGC823 and SGC7901.Flow cytometry was used to detect the apoptosis of gastric cancer cell lines treated with drugs.The expression of proliferation and apoptosis related proteins were detected by Western blot.Results Curcumin could inhibit the proliferation of gastric cancer cells and induce apoptosis.WB results showed that curcumin inhibited the expression of cell proliferation related proteins，and promoted the expression of apoptosis related proteins.Conclusion Curcumin can inhibit the proliferation of gastric cancer cell line BGC823 and SGC7901，and its mechanism may be through activation of caspase pathway to induce apoptosis，which suggests that curcumin has potential application in the treatment of gastric cancer.
Keywords：Curcumin，Gastric cancer，proliferation，apoptosis
前言
胃癌是常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内居恶性肿瘤第四位，而死亡率居恶性肿瘤第二位[1，2]。手术是治疗胃癌的首选方式，但一部分进展期胃癌患者不能行手术切除，仅有一部分患者可以行姑息切除术，而且切除后大多数患者仍需要进行化疗，但长期使用毒性大、费用高又影响其疗效。近年来，一些中药被证实具有抗肿瘤活性，参与肿瘤细胞增殖与细胞凋亡，因此，高效低毒的中药有效成分的研究为胃癌的临床治疗提供一种新途径。
姜黄素（curcumin，Cur）是一种脂溶性酚类色素，是从姜黄、莪术等姜黄属植物的根茎中提取出来的有效化学成分，不良反应轻、价格低，是一种天然安全的食品添加剂和染色剂，在食品添加及染色中广泛应用[3]。大量的研究表明，姜黄素在多种恶性肿瘤中发挥重要作用如黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌和卵巢癌[3-11]。但是对于姜黄素对胃癌细胞增殖和凋亡及其机制的研究却鲜有报道。因此，本试验通过研究姜黄素对胃癌细胞增殖和凋亡的影响，探讨探讨姜黄素抗胃癌作用的分子机制，旨在为胃癌的生物学治疗提供更多一种可供选择的药物。
1 材料与方法
1.1 细胞株及实验用药
胃癌细胞系BGC823和SGC7901由本实验室保存。姜黄素（Curcumin，Cur）：购自陕西听泰生物科技发展有限公司，分子式：C21H20O6，分子量：368.37，纯度99%，用DMSO配成1mol/L的原液，-20℃冻存备用，临用时4℃解冻保存，用含5%小牛血清、l ml双抗的RPMI-1640培养液配制成所需浓度。
1.2 细胞培养
BGC823和SGC7901细胞培养于含10%胎牛血清、1000U/ml青链霉素的RIMP1640培养基，放置于37℃，5% CO2的恒温细胞培养箱内，每2-3d更换培养液待细胞融合大于80%后使用胰蛋白酶消化细胞，种板培养或传代。
1.3细胞增殖实验
BGC823和SGC7901细胞以105/ml密度接种于96孔板中，加入200μＬRIMP1640完全培养液，加入不同浓度姜黄素（5μM、10μM、50μM）处理BGC823和SGC7901细胞24h，每孔加入20μL CCK-8溶液，继续培养4h后，终止培养。酶标仪450nm测定吸光度，连续检测5d，绘制肿瘤细胞生长曲线。
1.4细胞凋亡检测
收集经药物作用48h的各组细胞，PBS洗2次，离心机800r/min，离心5min，弃上清。加入195μL AnnexinV-FITC结合液重悬细胞。加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育10分钟。800r/min离心5min，弃上清，加入190μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞。加入10μL PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光孵育。流式细胞仪检测。
1.5 Western Blot检测凋亡相关蛋白
收集不同浓度姜黄素孵育的胃癌细胞，加入蛋白裂解液RIPA（含终浓度为1mM的PMSF及1%的蛋白酶抑制剂），冰上裂解30 min，收集细胞，4°C 12000r/min离心20 min，取上清BCA测蛋白浓度，取40μg蛋白样品，进行12% SDS-PAGE电泳，然后用15 V转印1 h至硝酸纤维素薄膜，转印结束后将膜放入封闭液中37℃封闭2 h；加入一抗4℃过夜，PBST洗膜3次后，加入二抗孵育，室温轻摇1 h，洗膜后用ECL化学发光。图像经扫描后，用图像分析软件Band Scan 5.0进行吸收度积分值分析，计算相对表达率（实验灰度值/内参灰度值）。实验重复3次。
1.6统计学分析
采用Spss17.0软件进行统计学分析。MTT法检测抑制率和流式细胞术检测细胞凋亡率行Kolmogorow-Smirnov正态检验，呈正态分布的结果以均数±标准差表示。p＜0.05为显著性差异。
2 结果
2.1 姜黄素对胃癌细胞增殖的影响
不同浓度的姜黄素作用BGC823和SGC7901细胞48h后，细胞的生长受到不同程度的抑制，与对照组相比均有显著性差异，随药物浓度的增大，细胞受到抑制程度逐渐增高，呈现时间与剂量依赖性关系（P<0.05）（见图1-1）。
3 讨论
近年来，姜黄素作为一种新药，具有可观的开发前景，药理方面的研究较为广泛而深入，抗肿瘤作用的研究内容相对偏多。例如，张立[12]等人研究发现，姜黄素能显著抑制人喉癌Hep-2细胞的增殖，RT-PCR显示，姜黄素使Bcl-2的mRNA表达水平下降，而使Bax的mRNA表达水平上升，并且呈剂量和时间依赖性。此外，研究证实姜黄素通过上调p53的表达使肿瘤细胞线粒体膜电位连续散逸，细胞色素C释放，激活caspase-3，诱导肿瘤细胞凋亡[13-17]。陈剑华等使用流式细胞术研究姜黄素对食管癌细胞Eca-109细胞周期的影响，作用24h后，随姜黄素浓度增加，Eca-109细胞的G0/G1期细胞比例明显下降而G2/M期细胞比例明显提高，提示姜黄素可通过阻滞细胞周期抑制细胞增殖[18]。
本实验通过研究不同浓度姜黄素体外（BGC823和SGC7901细胞）对胃癌细胞增殖与凋亡的影响。结果发现姜黄素能显著抑制胃癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，且呈剂量依赖性。为了进一步探讨姜黄素抑制胃癌细胞增殖的分子机制，本实验对与增殖相关基因的表达进行了检测，结果姜黄素能够促进相关基因的表达。上述结果表明姜黄素能够抑制胃癌细胞的增殖，但对于其机制的探讨仍需要进一步的研究。
Caspase蛋白激酶家族的级联反应在凋亡的调节和控制中起着非常重要的作用。PARP是细胞凋亡核心成员胱天蛋白酶（caspase）的切割底物，是存在于多数真核细胞中的一个多功能蛋白质翻译后修饰酶，它在细胞凋亡中发挥着重要作用。PARP剪切被认为是细胞凋亡的一个重要指标，也通常被认为是Caspase 3激活的指标[19]。为进一步说明姜黄素抑制胃癌细胞增殖是否与细胞凋亡有关，本研究对凋亡相关蛋白的表达进行了检测。结果发现姜黄素能够显著提高了激活型Cleaved-PARP与Cleaved-caspase 9蛋白的表达，呈剂量依赖性。结合上述结果，我们推测姜黄素可能通过激活caspase凋亡通路，诱导细胞凋亡，进而抑制胃癌细胞的增殖。
综上所述，姜黄素能够抑制胃癌细胞系BGC823和SGC7901的增殖，其机制可能是通过激活caspase途径诱导细胞凋亡有关。是否与其它作用机制有关，还需要进一步的研究。
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作者简介：
王斌生（1981.10.22-），籍贯：甘肃平凉，普外科，主治医师，单位：兰州大学第一医院.
李强（1982.3.13-），籍贯：甘肃庆阳，普外科，主治医师，单位：兰州大学第一医院.
论文作者:王斌生,李强,柴琛
论文发表刊物:《航空军医》2016年第1期供稿
论文发表时间:2016/4/12
标签：姜黄论文; 细胞论文; 胃癌论文; 凋亡论文; 抑制论文; 浓度论文; 蛋白论文; 《航空军医》2016年第1期供稿论文;