杨乔欣, 马文煜, 余颖, 任君萍, 黎志东[1]2001年在《单纯疱疹病毒囊膜糖蛋白模拟短肽的筛选》文中进行了进一步梳理为了获得可替代单纯疱疹病毒(HSV)囊膜糖蛋白作为该病毒亚单位疫苗免疫原的小片段短肽,我们将一株有强动物保护活性的抗HSV糖蛋白C型共同性单克隆抗体
杨乔欣[2]2000年在《单纯疱疹病毒糖蛋白模拟短片段抗原的研究》文中研究表明单纯疱疹病毒(HSV)是一类严重危害人类健康，引起人类多种疾病的常见病原体，由于其基因组中可能带有癌基因且有整合倾向，因此至今尚无安全有效的全病毒或减毒活病毒疫苗问世。近年来，利用可以刺激机体产生高保护免疫活性的HSV糖蛋白或蛋白片段研制亚单位或基因工程疫苗的研究取得了不少有益的进展，但是单一糖蛋白的保护活性还不能令人满意，因此HSV疫苗的研究正向着增加多种保护性免疫原组合以增强疫苗治疗和免疫效果的方向发展，充分认识HSV糖蛋白的抗原表位及其免疫学特性将有助于为HSV多组份疫苗和新型基因工程疫苗提供更多和更有效的备选免疫原，对HSV的治疗和发病机制的研究也有重要帮助。另外，HSV糖蛋白均较大，以gD为例，其基因序列为1182bP，编码394个氨基酸，很难将6、7种糖蛋白序列均导入一个基因工程载
杨乔欣, 马文煜, 余颖[3]2000年在《单纯疱疹病毒糖蛋白C模拟表位mgC真核表达载体的构建和表达》文中研究表明目的为鉴定单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白C(gC)一个短肽模拟表位mgC基因作为HSVDNA表位疫苗的可能性 ,需构建含此表位的真核载体。方法合成编码该表位的单链DNA ,经不对称PCR扩增后 ,克隆入真核表达载体pcD NA3.1中 ,并在CHO细胞中表达。用RT PCR法鉴定mRNA的表达。结果含mgC基因的真核表达载体在哺乳动物细胞中可以在mRNA水平表达外源蛋白。结论成功地构建了HSVgC中短肽模拟表位mgC基因的真核表达载体 ,为进一步探讨该HSV模拟表位的功能奠定了基础。
江海飞[4]2017年在《水痘—带状疱疹病毒ORF7的功能解析及基于单纯疱疹病毒的新型顺行神经环路示踪工具》文中进行了进一步梳理人Alpha疱疹病毒是嗜神经病毒非常重要的成员,其在人群中的感染和传播已经造成了沉重的社会负担。本课题围绕人Alpha疱疹病毒开展两个方面的工作。第一,解析出水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)基因组中的嗜神经因子对神经毒力的贡献;第二,利用Alpha疱疹病毒的嗜神经特性,基于单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)开发有用的新型神经回路示踪工具。水痘-带状疱疹病毒的减毒活疫苗已经被批准入市数十年,但VZV在神经组织内的潜伏性和持续性感染依然严重威胁着人类的健康。前期研究表明VZV的ORF7是一个潜在的嗜神经因子,但ORF7的功能尚不清楚。本研究系统地研究了ORF7对于病毒复制周期各阶段的调节作用,包括病毒进入、基因组复制及表达、核衣壳组装及出核、皮膜及包膜的组装和病毒粒子跨细胞运输,使用的细胞模型包括:ARPE-19上皮细胞、神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)、神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞及分化的神经细胞。在上述细胞中,首先证明了ORF7蛋白产物(protein ORF7,pORF7)在亚细胞水平定位于高尔基体,在病毒粒子内定位于皮膜层;进一步证明了ORF7的缺失对病毒复制周期中的侵入和基因组复制表达没有显著影响;最后证明了pORF7参与了细胞质中的病毒包膜装配,在ORF7缺失病毒VZV-7D(7D)感染的细胞胞质中分布有大量的包膜缺陷病毒粒子,并且7D表现出的包膜装配缺陷在分化的神经细胞中更加严重;ORF7的缺失也严重地影响了VZV在神经细胞之间的传播效率。本课题的研究结果表明:作为结构性的皮膜蛋白,pORF7参与了VZV的包膜装配过程,且对于VZV在神经细胞间的传播及所引起的神经损伤有至关重要的作用。同时,本课题基于单纯疱疹病毒1型H129株,分别构建获得了顺行跨多级和跨单级的神经环路病毒示踪工具。其中,H129-G4为顺行跨多级示踪工具,它可以高效地标记神经环路和神经元的细微结构;H129-ΔTK-tdT和辅助病毒一起组成了顺行跨单级示踪系统,可以标记出特定脑区和特定类型神经元的潜在下一级支配细胞。这些工具将补充现有的神经环路示踪工具集。
曹香林[5]2017年在《黄河鲤LGP2和STING基因的鉴定及其遗传多态性与鲤疱疹病毒感染的筛选》文中研究表明豫选黄河鲤(Cyprinus carpio haematopterus)是由河南省水产科学研究院采用野生黄河鲤做亲本,经过近20年、连续8代精心繁育而成。迄今已得到广泛推广,有着显著的经济和社会效益。然而,近几年,黄河鲤各类疾病的频发,使黄河鲤养殖风险大大增大,造成严重的经济损失,明显制约了该产业的可持续健康发展。感染锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)的黄河鲤具高度传染性和极高的致死率。直到目前仍没有好的防御措施和治愈手段。因而了解黄河鲤自身免疫系统对这种病毒的防御功能和培育抗病的优良品种显得尤为重要,也是维持健康水产养殖业的关键所在。先天免疫识别受体及信号通路相关基因在病毒检测、干扰素诱导、保护机体免受侵害等方面具有关键作用。LGP2作为RIG-I样模式识别受体的家族成员之一,首先识别存在于细胞质中的病毒DNA或RNA,随后下游系列信号级联反应被激活,诱导产生I型干扰素和促炎性因子。干扰素基因的刺激基因STING是宿主细胞中DNA病毒识别的感知器,通过RIG-TBK1-IRF3/IRF7信号级联来诱导产生干扰素,对DNA病原体做出先天免疫反应。为研究上述免疫相关基因的分子特性和抗病毒机制,本研究通过基因克隆及病毒感染,鉴定和分析了LGP2、STING基因和KHV病毒体内外感染后基因表达谱以及poly(I:C)和poly(d A:d T)配体刺激CFC(尾鳍细胞)后的基因表达情况,探究LGP2和STING在病毒识别及抗病毒级联反应中的作用。为进一步探究LGP2和STING基因与抗KHV的关联性及遗传特性,本研究提取感染KHV病毒的黄河鲤脾脏的DNA,利用特异PCR和染色体步移技术获得LGP2和STING基因全长及5’侧翼序列,并应用生物信息学和生物统计软件SPSS等工具对克隆所得目标基因的结构特征及遗传信息进行系统的比较分析;通过构建表达载体,验证启动子活性;以及利用基因池混合测序和PCR-RFLP方法,对目的基因的核苷酸多态位点与黄河鲤抗KHV感染进行关联分析,并对其表型关联位点进行验证。1.黄河鲤LGP2基因存在两个选择性剪接体,LGP2a c DNA全长为3061bp,ORF开放阅读框位于第127位到第2066位核苷酸,编码680个氨基酸的多肽,预测分子量为77,341.2Da,等电点为6.53。预测四个蛋白质结构域,包括细菌III型限制性内切酶的保守结构域,DEAD/DEAH盒解旋酶结构域,C末端解旋酶超家族结构域和调节结构域。LGP2b的全长为1928bp,编码346个氨基酸,5’-非翻译区(UTR)为114个核苷酸,3’UTR有603个核苷酸,其中包括AATAA终止信号。黄河鲤LGP2基因全长DNA为7655bp,有12个外显子,11个内含子,所有内含子均是由GT开头,AG结尾的,在LGP2 DNA全长与LGP2a和LGP2b m RNA比对结果显示,LGP2a和LGP2b来源于同一条DNA序列,在第七外显子处m RNA序列出现不同的选择性剪切,将第七内含子的部分序列转录为第七外显子,形成一条完整的m RNA序列。LGP2的5’侧翼序列预测有两个启动子,并且其活性均能被KHV诱导加强。病毒感染实验结果表明,LGP2有助于ds DNA病毒介导的细胞先天免疫应答的正调节。2.LGP2的16个有效的多态位点被探测到:其中包括12个SNP位点、4个有缺失核苷酸的位点;其中5’侧翼区的-294GCT三核苷酸缺失和414 GT二核苷酸缺失位点以及内含子中的3820 T/C和3836T/G位点的基因型和等位基因频率在抗性组和易感组间差异显著。经二次感染验证表明,-294 ins、414 ins、3820TT,3836TT基因型的黄河鲤分别比-294 del、414del,3820CC,3836GG型的黄河鲤死亡率低。因此该四个位点的突变可能是黄河鲤疱疹病毒病的遗传相关的危险因素。3.STING c DNA全长1528bp,编码402个氨基酸的多肽,分子量为46.184k Da,等电子点为6.08。推测的STING蛋白含有信号肽,N-末端区域中的三个跨膜基序和驻留的内质网蛋白中发现存在四个假定基序(RXR)。STING基因DNA全长为8068bp,由7个外显子和6个内含子组成,所有内含子均遵循GT开头,AG结尾的规律。5’-侧翼序列为901bp,序列预测有启动子活性,其活性可被KHV诱导加强。STING被鉴定为由DNA病原体介导的黄河鲤先天免疫应答的组成部分,并且在体外和体内都证实了STING对下游反应的正向调节中起关键作用。4.STING的14个有效的多态位点被探测到:13个SNP位点、1个有缺失核苷酸的位点;其中5’侧翼区的-873G/C和-687CCT三核苷酸缺失位点;外显子中的6767G/A和7034C/T位点的基因型和等位基因频率在抗性组和易感组间差异显著。二次病毒刺激实验表明,STING基因的-873GG、-687ins、6767GG和7034CC基因型的黄河鲤分别比-873CC、-687del、6767TT和7034TT型的黄河鲤死亡率低(P<0.05),可以认为-873G/C、-687ins/del、6767G/A和7034C/T与黄河鲤抗KHV感染抗性-易感表型显著相关,可以作为抗病育种的分子标记。5.为了研究黄河鲤对KHV病毒的抗病防御机制和抗KHV的关联性,本研究将KHV病毒感染后黄河鲤抗性组和易感组的鳃和脾脏的RNA进行转录组测序,4个组织转录组测序共获得1.90亿个Raw reads,过滤后得到1.35亿Clean reads,经Trinity软件组装后,得到469,251个transcripts和366,783个unigene,unigene平均长度667,最长为18437bp,最短为201bp。其中长度在200-600 bp的序列有347659条,占74.08%。比对到Nr数据库的序列有31,837条,且与斑马鱼一致性最高,其次是墨西哥丽脂鲤和虹鳟,说明与鲤科鱼类的基因一致性最高。采用R with edge R package筛选差异表达基因,并对差异基因进行GO富集和KEGG通路富集分析,脾脏和鳃的抗性和易感组的差异基因数量相似,从天然免疫识别受体途径中选出78个基因在抗性组和易感组之间的表达差异表明,鱼类在脾中和鳃中抗KHV病毒的反应是不同的。本研究还对转录组文库中的基因进行SNP、SSR和选择性剪切进行概况分析。无论是鳃还是脾抗病组的SNP位点少于易感组;编码区SNP位点少于非编码区,但脾脏中编码区突变多于非编码区;每个组织转录组中,有意突变占总SNP的43.1%-50.58%,而无意突变仅占0.11%-0.13%。文库中由C转换为T的SNP最多,其次是由T转换为C,最少的是由C转换为G。本数据库中从检测序列168,510条中检测出31,084条存在SSR,而包含SSR的序列数为25,240,约占总检测序列数的15%,包含多于一个SSR的序列为4,549条,占所有SSR序列的18%;不同碱基SSR为1,401,含一个以上SSR的序列约占30.8%。重复的最大和最小长度分别为119和18,平均长度为24个核苷酸。SSR的模序类型主要以单核苷酸9-12重复最多,而4核苷酸及5核苷酸5-8重复最少。在本研究中,经transcripts与unigenes比对,共有16,491个unigenes含有多个转录本(29.88%),可能受选择性剪切调节。这些unigenes中,某些不同表达转录本的基因DET共4,183占总Unigene的7.58%。本实验结果提供易感组鳃和脾脏以及抗病组鳃和脾脏的转录组概况,为黄河鲤抗疱疹病毒病的免疫生物学的第一次评估、也为后续的抗病分子育种奠定了理论基础。
张雪莲[6]2003年在《表达血清1、3型马立克氏病病毒gB主要抗原表位的重组CVI988病毒构建及其免疫保护作用》文中进行了进一步梳理马立克氏病(Marek’s Disease，MD)是由马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus，MDV)引起的鸡的一种高度传染性，淋巴组织增生性疾病。自上世纪70年代，通过接种MDV非致瘤株或火鸡疱疹病毒(HVT)活疫苗以来，MD得到了很好的控制，当前，预防接种仍是控制该病的主要手段。但马立克氏病病毒毒力不断增强，降低了疫苗的免疫保护效果。50年代，温和MDV转变为强毒MDV(vMDV)，70年代，从vMDV转变为超强毒MDV(vvMDV)，90年代早期，出现超超强毒致病型(vv+MDV)，该致病型病毒的出现导致溶细胞活性增强，不同寻常的器官嗜性，而且免疫抑制和T淋巴细胞转化为肿瘤细胞能力增强并引起宿主早期死亡，给养禽业带来了更大的损失，养鸡业迫切需要更有效的MD疫苗。随着分子生物学的广泛使用，人们一直很看好MD基因重组疫苗的前景，MDV疫苗株被认为是最有潜力的病毒载体之一，通过构建表达外源基因抗原的多价活疫苗达到预防禽病的目的。本文利用MDV1疫苗株CVI988作为载体表达绿色荧光蛋白以及不同血清型MDV主要保护抗原基因的抗原表位，构建了几株重组病毒，分别并检测它们对SPF鸡抵抗超强马立克氏病病毒(vvMDV)攻击的免疫保护作用。研究主要从以下几个方面展开： 1．表达GFP的重组CVI988病毒的构建及其在体内外的生长状态 提取马立克氏病病毒Ⅰ型疫苗毒株CVI988／Rispens的总DNA为模板，利用PCR技术扩增出病毒生长非必需区US2基因，克隆入T-easy载体。将CMV启动子控制的含GFP基因表达盒克隆入US2基因中，成功构建了含GFP基因的转移质粒载体pGUS2GFP。用脂质体将其与CVI988株共转染CEF细胞，用96孔板稀释法得到纯化的表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒株rCVIGFP，并分别测定其在体内和体外的生长情况。表达EGFP基因的重组病毒在细胞上生长曲线与亲本毒CVI988类似，从观察重组病毒在感染细胞上的蚀斑数(PFU)来看，重组病毒在接种细胞后第5天的蚀斑数最高，随后则出现下降趋势。体内实验表明，1日龄腹腔接种该重组毒后，可以从鸡体内分离到表达绿色荧光的病毒。该重组病毒的获得，证实以CVI988病毒作为病毒载体在短独特区插入外源基因构建的重组病毒具有较好的稳定性，为探讨构建MD重组病毒疫苗奠定基础。 2．表达HVTgB主要抗原表位的重组CVI988病毒的构建 据报道，CVI988与HVT联合使用可以提高鸡群对MDV的免疫保护作用，同时有研张雪莲表达血清l、3型MDvgB主要抗原表位基因的重组cvI988病毒构建及其免疫保护作用究表明，MDV生长非必需区USIO基因是插入表达外源基因的最稳定区，且不会影响疫苗的免疫原性，因此我们选择HVTgB基因主要抗原表位作为靶基因，通过插入US10基因中构建CVI988重组病毒。扩增CVI988株MDV包括部分s。rfZ和sorf3基因及全部USI和US10基因约2.skb，构建包含重组臂基因的重组载体pBUS10。通过引物中添加外源短片段序列的方法，在火鸡疤疹病毒(HVT)gB基因主要抗原表位的前端及后端分别加上血凝素基因Tag(HA)及终止子TAA，并克隆到已构建好的质粒载体PIREgPtB多克隆位点，构建出在CMv启动子和增强子控制下包含gPt基因和gB3基因主要杭原表位的双顺反子基因表达盒。对含HA Tag和gB3主要抗原表位的融合片段进行测序，结果表明:目的片段中含有HA序列和gB3主要杭原表位基因，且两者融合后阅读框不变，基因序列与设计完全一致，未发生碱基的突变。将双顺反子基因表达盒插入重组臂载体paUS10质粒的US10基因中，获得转移质粒载体pBUSzogptgB3。该载体转染CHO细胞，用杭HvT的多抗与之反应，同时采取兔抗鸡工gY荧光二杭进行间接免疫荧光试验(IFA)，结果证实该转移质粒载体可有效地表达HVTgB基因。转移质粒载体转染已感染CVI988病毒的CEF细胞，在细胞培养液中存在霉酚酸一次黄噪吟一HAT(MXHAT)的条件下筛选出表达gpt和gB3基因的重组病毒::CVIUS10一g一gB3。对重组病毒在选择性培养基和正常培养基中生长滴度以及重组毒与亲本病毒在细胞上形成的病变大小比较表明:重组病毒的生物学特性没有因插入外源基因而发生改变。利用HA单克隆抗体进行IFA检测，结果显示该重组病毒可有效表达插入的外源基因。3.串联表达血清1型MDvgB主要抗原表位的重组CVI988病毒的构建 比较MDV三种血清型糖蛋白B的抗原性，选择编码血清1型GA株病毒糖蛋白B主要抗原表位2 50一460位氨基酸的核普酸序列作为目的基因，将该基因通过一个9个氛基酸(GSLAGALGL)的1 inker在SK(+)载体中重复串联一次，并对该串联片段测序结果进行分析，单个片段主要位于gBI基因的7 50一1 380 nt，将串联片段的基因序列转换为氨基酸和两片段之间的L 1 nker，转换成氨基酸后，经DNASta:生物学软件分析表明:此片段的杭原性较强，且富含a螺旋，p一折叠及转角，亲水区与疏水区交替出现，该Linker编码的9个氨基酸，是由丙氨酸、甘氨酸和亮氛酸组成，因为这三种氨基酸是结构比较简单的疏水性氨基酸，通过杭原性和结构分析，它几乎没有任何抗原性，对整个蛋白的结构和免疫原性不会产生影响，且由于这几种氨基酸的柔韧胜较好，对维持表达蛋白的空间结构有?
王璐[7]2017年在《海洋真菌次生代谢产物Aspergillipeptide D的抗HSV-1活性及机理研究》文中指出目的:从海洋微生物次生代谢产物中筛选具有新结构、新机制的抗病毒先导化合物,并对其抗病毒活性及分子机理进行初步探讨,为开发新型抗病毒海洋药物奠定基础。方法:通过CPE实验从46种海洋微生物次生代谢产物中筛选出了具有抗病毒活性的结构新颖的多肽化合物Aspergillipeptide D,MTT检测了其细胞毒性,空斑减数实验检测了其对HSV-1病毒及其耐药株感染的治疗效果,并建立HSV-1病毒潜伏感染模型研究了Aspergillipeptide D对病毒潜伏感染的影响;通过空斑减数实验、qPCR和Western blotting检测了Aspergillipeptide D对HSV-1病毒不同作用方式的影响,并通过激光共聚焦、IP和质谱分析初步探讨了Aspergillipeptide D影响病毒感染的分子机制。结果:Aspergillipeptide D对Vero细胞的毒性较小,CC50值为208.723±9.717μM。Aspergillipeptide D对HSV-1正常株和耐药株均具显著的抗病毒效果,并能促进潜伏期病毒的裂解性相关基因表达;Aspergillipeptide D不能直接灭活病毒,对病毒吸附、穿刺没有明显影响,但对HSV-1具有显著的感染后治疗作用,呈浓度和时间依赖性,对病毒扩散也有抑制作用;Aspergillipeptide D对病毒DNA拷贝量无影响,但抑制病毒晚期基因表达,尤其对病毒晚期糖蛋白gB的表达及其在内质网和高尔基体的定位产生显著影响,并抑制gB蛋白与细胞蛋白的相互作用。结论:Aspergillipeptide D对HSV-1病毒正常株和耐药株均具有显著抗病毒效果,对潜伏期病毒也具有促再激活的潜力。Aspergillipeptide D抑制病毒晚期蛋白gB的表达及其与细胞蛋白的相互作用,从而影响病毒的感染和扩散,gB是Aspergillipeptide D的潜在作用靶点。
孟霞[8]2008年在《pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白的高效表达、分离纯化及其鉴定》文中指出目的人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染是引起宫颈癌的主要病因,高危型HPV16是主要的感染类型。而HPV并非宫颈癌发生发展的唯一因素,单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)可能作为协同因子在宫颈癌变发生发展的过程中起重要作用。用PCR法从HPV中扩增出L1基因片段及从HSV中扩增出gD基因片段作为目的基因,并将目的基因插入到pBV220原核表达载体中;为了获得pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白,故将上述重组载体在E.coli DH5α中进行诱导表达、蛋白纯化及其鉴定,以期为研制宫颈癌预防性疫苗奠定基础。方法重组质粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD转化E.coil DH5α,温控诱导,以包涵体形式获高效表达。在超声液中加入终浓度为2mol/L的尿素分离洗涤包涵体,然后将其溶于8mol/L尿素中,用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。将一定量的目的蛋白与免疫佐剂混合后免疫家兔。免疫方式采用皮下多点注射,经7次免疫后,取兔耳缘静脉血行双向琼脂免疫扩散法检测抗体滴度,滴度合适后,进行心脏采血。采集分离的血清进行双向琼脂免疫扩散,此外,用Western-blot检测和鉴定pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD目的蛋白。结果1、将重组质粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD转入大肠杆菌DH5α,分别经42℃诱导表达6小时和5小时,成功表达了相应的pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白。SDS-PAGE分析表明:两者均以包涵体形式存在,pBV220-HPVL1重组蛋白的分子量约为64KD,pBV220-HSVgD重组蛋白的分子量约为13KD。2、将包涵体超声裂解、分离洗涤后,获得了较纯的目的蛋白,经8M尿素处理后,紫外吸收法测定HPVL1与HSVgD蛋白浓度分别为5.9mg/ml与4.6mg/ml。3、以pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白分别免疫家兔,制备了抗HPVL1、HSVgD多克隆抗体,以重组蛋白为抗原,用双向琼脂免疫扩散法检测HPVL1、HSVgD抗血清的效价均达到1:16,且HPVL1、HSVgD抗体与免疫原之间形成单一沉淀线,表明所制备的多抗具有良好的纯度。4、免疫印迹分析HPVL1抗血清在分子量约64KD,HSVgD抗血清在分子量约13KD处与相应的原核表达蛋白呈现特异性结合条带,表明所表达的蛋白均为目的蛋白。结论应用基因工程技术,将重组质粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD转入大肠杆菌DH5α,成功地高效表达了pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白。经免疫家兔获得的抗HPVL1和抗HSVgD两种多克隆抗体都具有良好的特异性和较高的抗体效价,为进一步动物实验的研究奠定了基础。
郑绮菡[9]2010年在《HSV-2gD模拟抗原表位P6、HBsAg、IL18重组核酸疫苗的构建及免疫效果观察》文中进行了进一步梳理目的构建包含单纯疱疹病毒HSV-2gD模拟抗原表位P6、乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg(S)、白细胞介素18(IL18)三基因的真核表达重组克隆,并从中筛选出优势组合及观察优势组合的动物免疫效果,为开发多抗原核酸疫苗提供新的理论和实践资料。方法1.重组质粒pc-IL18-S、pc-S的构建将含有Xhol I和EcoR I酶切位点的IL18片段亚克隆入pcDNA3.1(-)中,经鉴定正确后,再用EcoR I和BamH I同时酶切pc-IL18和sT-S,并将酶切片段S回收后亚克隆入酶切回收后的pc-IL18质粒中,构建重组质粒pc-IL18-S。将含有EcoR V和BamHI酶切位点的S片段亚克隆入pcDNA3.1(-)中,构建真核表达质粒pc-S。pc-IL18-S质粒和pc-S质粒均为阳性对照组。2.含有重叠区S片段的扩增以测序正确的S基因为模板,以含有另一模板部分序列的上下游引物为引物,采用简并引物PCR方法扩增含有重叠区的S片段。3.重组质粒pc-IL18-P6-S、pc-IL18-NP6-S、pc-S-P6-IL18、pc-S-NP6-IL18的构建以前期获得的融合片段IL18-P6、IL18-NP6、P6-IL18和NP6-IL18[1]为第一模板,以含有重叠区的S基因为第二模板,采用重叠PCR方法扩增IL18-P6-S、IL18-NP6-S、S-P6-IL18、S-NP6-IL18三基因融合片段。鉴定正确后,将其插入pcDNA3.1(-)中,构建真核表达质粒pc-IL18-P6-S、pc-IL18-NP6-S、pc-S-P6-IL18、pc-S-NP6-IL18。4.间接免疫荧光筛选优势质粒及Western blot验证靶抗原的表达重组质粒pc-IL18-P6-S、pc-IL18-NP6-S、pc-S-P6-IL18、pc-S-NP6-IL18、pc-IL18-S、pc-S经阳性脂质体介导转染CHO细胞,并进行多次间接免疫荧光(IFA)检测。根据检测结果筛选出优势质粒。Western blot验证筛选出的优势质粒中S抗原和P6或NP6抗原的表达。5.优势质粒免疫BALB/c小鼠并观察免疫效果优势质粒pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18经扩增、纯化后分别待免疫4-6周龄的雌性BALB/c小鼠,并增设pcDNA3.1阴性对照组和生理盐水NS空白对照组。其中,首次免疫前三天(d)用普鲁卡因在质粒待免疫处进行预处理。在第0d、14d、30d于小鼠双下肢股四头肌处注射重组质粒50ug/只,且首次免疫辅加弗氏完全佐剂(质粒:弗氏佐剂=1:1),阴性对照组加弗氏完全佐剂而空白对照组不加。在首次免疫后第20d、45d、60d分别对小鼠进行尾动脉采血。ELISA法检测各组免疫小鼠血清中抗-S水平和抗-P6或抗-NP6水平。末次加强免疫后四周脱臼处死小鼠,并无菌取脾分离淋巴细胞,经计数后于96孔板培养,48小时后MTT法检测淋巴细胞增殖情况。结果⒈重组质粒的构建及筛选:①利用重叠PCR方法成功获得IL18-P6-S、IL18-NP6-S、S-P6-IL18、S-NP6-IL18三基因融合片段;利用酶切连接方法得到IL18-S片段。②通过不同的限制性内切酶酶切及连接,获得重组质粒pc-IL18-P6-S、pc-IL18-NP6-S、pc-S-P6-IL18、pc-S-NP6-IL18、pc-IL18-S、pc-S。③通过多次间接免疫荧光实验,证实各重组质粒所携带的HBsAg基因、P6或NP6基因在真核细胞中均可成功表达,且所要筛选的重组质粒pc-IL18-P6-S、pc-IL18-NP6-S、pc-S-P6-IL18、pc-S-NP6-IL18,其荧光亮度位于pcDNA3.1阴性质粒组和pc-IL18-S、pc-S阳性质粒组之间。其中,pc-S-P6-IL18、pc-S-NP6-IL18组与pc-IL18-P6-S、pc-IL18-NP6-S组相比较,无论是S抗原还是P6或NP6抗原,前两组的荧光亮度均明显强于后两组,且pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18比较组间没有显著差异,故认为所构建的四种重组质粒中pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18在真核细胞中的表达情况优于pc-IL18-P6-S和pc-IL18-NP6-S,选择pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18为优势质粒。④Western blot实验结果显示,优势质粒pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18在CHO细胞中表达的S抗原可以检测到,但表位抗原P6和NP6并未检测到。2.优势质粒对小鼠的免疫效果观察:①ELISA法检测各组免疫小鼠抗-S水平。结果显示,pc-S-P6-IL18组(0.10)同pcDNA3.1组(0.04)比较,有显著性差异,P=0.000<0.05;pc-S-NP6-IL18组(0.09)同pcDNA3.1组(0.04)比较,有显著性差异,P=0.000<0.05;pc-S-P6-IL18组(0.10)同pc-S-NP6-IL18组(0.09)比较,差异不显著,P=0.167>0.05。②ELISA法检测各组免疫小鼠抗-P6或抗-NP6水平。结果显示,pc-S-P6-IL18组(0.09)同pcDNA3.1组(0.03)比较,有显著性差异,P=0.000<0.05;pc-S-NP6-IL18组(0.08)同pcDNA3.1组(0.03)比较,有显著性差异,P=0.001<0.05;pc-S-P6-IL18组(0.09)同pc-S-NP6-IL18组(0.08)比较,差异不显著,P=0.314>0.05。③MTT法检测脾细胞刺激指数SI。结果显示,pc-S-P6-IL18组(1.38)同pcDNA3.1组(0.92)比较,有显著性差异,P=0.000<0.05;pc-S-NP6-IL18组(1.35)同pcDNA3.1组(0.92)比较,有显著性差异,P=0.000<0.05;pc-S-P6-IL18组(1.38)同pc-S-NP6-IL18组(1.35)比较,差异不显著,P=0.210>0.05。结论1.重叠PCR法是体外获得多序列、短片段串联产物的有效方法。2.成功构建重组质粒pc-IL18-P6-S、pc-IL18-NP6-S、pc-S-P6-IL18、pc-S-NP6-IL18、pc-IL18-S、pc-S,并筛选出优势质粒pc-S-P6-IL18、pc-S-NP6-IL18。3.BALB/c小鼠接种重组质粒可有效提高其体液免疫应答和细胞免疫应答,且IL18有免疫佐剂功能,可提高靶抗原在机体中的免疫原性。质粒pc-S-P6-IL18组同pc-S-NP6-IL18组比较免疫效果相似,提示HSV-2gD模拟抗原表位12肽P6具备天然抗原表位12肽NP6的免疫原性,pc-S-P6-IL18可作为候选疫苗替代pc-S-NP6-IL18。4.携带多个外源基因的串联重组克隆具有良好的体内外表达活性;且串联基因的相对位置差异,会影响靶抗原的表达。本研究发现,IL18位于S抗原的羧基端其免疫效果优于位于S抗原的氨基端,这可为新型核酸疫苗的开发研究提供一点思路。
张春江[10]2007年在《藏药抗菌抗病毒作用及机制研究》文中认为目的：对甘肃甘南采集的清热解毒类藏药异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜、乌奴龙胆、五脉绿绒蒿、铁棒锤、蒺藜、兔耳草提取物进行了抑菌活性试验；对异叶青兰，甘青乌头，獐芽菜提取物进行了的体内外抗HSV-2的作用研究，并探讨了这些提取物的抗病毒作用机制。最终希望通过上述基础研究获得抗菌抗病毒活性强的藏药。方法：1．藏药体外抗菌活性研究：采用琼脂扩散法和微量稀释法，以抑菌圈和最小抑菌浓度为评价指标对八种藏药的水提取物和醇提取物以及异叶青兰挥发油和甘青乌头生物碱进行了体外抑菌活性的初步研究。2．挥发油成分分析：以GS-MS联用技术分析异叶青兰挥发油化学成分及相对含量。3．藏药体外抗病毒活性研究：MTT法测定藏药对Vero细胞的毒性，以阿昔洛韦为阳性对照药物，采用细胞病变法、蚀斑法和透射电镜观察考察了异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜体外抗病毒活性。4．藏药体内抗病毒作用：用HSV-2分别建立小鼠脑炎模型与小鼠生殖器感染模型，以阿昔洛韦作为阳性对照药物，对异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜体内抗单纯疱疹病毒的抗病毒活性进行评价。5．藏药抗HSV—2的作用机制：采用定量荧光PCR法、扫描电镜观察和蚀斑法考察了异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜体外抗病毒作用机制。结果：1．藏药体外抗菌活性研究：a．藏药水提取物和醇提取物对所选菌种都具有一定的抑制作用，形成抑菌圈直径范围为8～22cm，MIC范围为1.56-50.00mg／ml。其中异叶青兰和甘青乌头抑菌活性最强，五脉绿绒蒿基本没有抑菌作用。b．异叶青兰精油能抑制细菌和酵母样真菌的生长，抑菌圈和最小抑菌浓度MIC范围分别为18-25mm，和0.039-0.156mg／ml。c．甘青乌头脂溶性生物碱的最小抑菌浓度MIC除对白色念球菌为0.313mg／ml，对其他菌均为1.25mg／ml，水溶性生物碱的最小抑菌浓度MIC除对粪肠球菌为0.625mg／ml，对其他菌均为5.0mg／ml。2．异叶青兰精油化学成分46.17％属单萜类，28.82％属倍半萜类。从精油中共鉴定出83种主要成分，总含量占全油的89.83％。3．藏药体外抗病毒活性研究：异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜、阿昔洛韦对Vero细胞的半数中毒浓度(CC_(50))分别为8.43mg／mL，5.54mg／ml，3.23mg／ml，11.02mg／ml。细胞病变法测得异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜、阿昔洛韦抑制HSV-2的EC_(50)分别为1.13mg／ml，0.53mg／ml，1.51mg／ml，1.64mg／ml。蚀斑法测得异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜和阿昔洛韦的EC_(50)分别为0.99mg／ml，1.43mg／ml，3.60mg／ml，0.29mg／ml。治疗指数TI则分别为8.91，6.36，1.05，37.4。用透射电镜观察Vero细胞的超微结构和病毒，发现给药后病毒被明显抑制。4．藏药体内抗病毒作用：异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜腹腔注射的LD_(50)值分别为15.00，0.85，19.13g／kg。在小鼠脑炎模型中，甘青乌头只延长了小鼠的平均存活时间，对小鼠的死亡未显示出明显的保护率。异叶青兰在剂量为0.5，1.00g／kg治疗时，对小鼠的保护率分别为20％，10％，獐芽菜在剂量为1.00，2.00g／kg治疗时，对小鼠的保护率分别为40％，20％。5．藏药抗HSV—2的作用机制：a不同给药方式下蚀斑减少试验结果表明：异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜均能直接灭活HSV-2，能够显著抑制HSV-2的感染性；异叶青兰可显著抑制HSV-2对Vero细胞的吸附侵入作用，獐芽菜对病毒的吸附抑制作用弱，而甘青乌头没有抑制作用；异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜均能抑制HSV-2大分子的增值。b扫描电镜观察异叶青兰抑制HSV-2对Vero细胞吸附的情况，进一步证实异叶青兰可显著抑制HSV-2对Vero细胞吸附。c荧光定量PCR结果表明异叶青兰、甘青乌头和獐芽菜抑制HSV-2 DNA合成的抑制倍数分别达10~6、10~2、10~3。结论：1．抑菌测定结果表明：八种藏药水提取物，抑菌活性异叶青兰＞甘青乌头＞獐芽菜＞兔耳草＞铁棒锤＞蒺藜＞乌奴龙胆＞五脉绿绒蒿；而对于醇提取物，异叶青兰＞甘青乌头＞铁棒锤＞兔耳草＞蒺藜＞獐芽菜＞乌奴龙胆＞五脉绿绒蒿。甘青乌头脂溶性生物碱抑菌作用强于水溶性生物碱。异叶青兰挥发油具有很强的抑菌活性，而且其抑菌活性与高含量的单萜和倍半萜有关。2．异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜具有较强的抗HSV-2的活性，CPE法和蚀斑法测定结果一致。蚀斑法更为准确敏感。3．异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜对HSV-2引起的小鼠脑炎表现出不同程度的疗效，存活率提高，平均存活时间(MTD)延长。4．异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜的抗病毒作用是通过抑制病毒复制循环的各个环节起作用的。5．异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜抗病毒活性的发现为其在藏医药临床中治疗肝炎和其他病毒性疾病提供了理论依据。
参考文献：
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[4]. 水痘—带状疱疹病毒ORF7的功能解析及基于单纯疱疹病毒的新型顺行神经环路示踪工具[D]. 江海飞. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所). 2017
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[9]. HSV-2gD模拟抗原表位P6、HBsAg、IL18重组核酸疫苗的构建及免疫效果观察[D]. 郑绮菡. 泰山医学院. 2010
[10]. 藏药抗菌抗病毒作用及机制研究[D]. 张春江. 兰州大学. 2007