周庆红[1]2004年在《化学方法克服甘蓝自交不亲和性及其机理研究》文中研究说明十字花科蔬菜作物甘蓝(Brassica oleracea L．)杂种优势显着，生产上应用很广。其杂交种子当前主要利用甘蓝自交不亲和品系(Self-incompatible lines)之间的互配而得。利用自交不亲和系配制甘蓝杂种遇到的主要问题之一是繁殖自交不亲和系需进行蕾期授粉，费时费工，大大增加了制种成本。 在繁殖甘蓝自交不亲和系过程中，为了在授粉期间降低自交不亲和性(self-incompatibility SI)，以利于繁殖和保存自交不亲和系，本实验精心选配了多种化学药剂对甘蓝自交不亲和品系进行花期或蕾期处理，在处理后的不同时间各授以同株系的花粉，待荚果成熟后分别采收，统计结荚率和亲和指数，与蕾期人工授粉效果相比较，以此判定各化学药剂克服甘蓝自交不亲和性的有效性。本实验还着重对克服效果特别显着的两种化学药剂(NaCl+硼酸溶液和槲皮素溶液)进行了克服机制的详细研究。本实验的研究结果如下所述： 试验结果可以看出，所有经化学药剂溶液喷花后花期自交的植株其结实指数都显着高于未经处理的植株，证明化学药剂溶液喷花处理对克服甘蓝自交不亲和性具有显着的作用。但综合分析授粉处理在叁个自交不亲和系(02-D1，02-A1，02-E1)上的表现，可以将授粉处理分为叁类，第一类克服自交不亲和性的效果最好的是NaCl溶液，平均亲和指数为5.56，仅略低于蕾期对照(亲和指数为6.25)而显着高于其它处理和花期对照；第二类为5％KH_2PO_4和0.1％植物凝集素，亲和指数分别2.61和2.19，显着高于花期对照；第叁类为0.1％KT、0.1％Ser和75％酒精，亲和指数都在2以下，处理效果虽与花期对照有差异，但效果并不理想，处理后亲和指数仅略高于花期对照。因此对此未做更深入的研究。另外对克服效果较为明显的NaCl+硼酸溶液进行了叁种浓度(3％NaCL+0.2％硼酸，5％NaCL+0.3％硼酸，8％NaCL+1％硼酸溶液)的处理实验，其中5％NaCl+0.3％的硼酸溶液处理效果尤为突出，经5％NaCl+0.3％的硼酸溶液处理过的甘蓝自交不亲和品系，其亲和指数一般可达6.0以上，最高可达7.68。同时处理效果还与处理后授粉的时间有密切关系，一般在处理后半小时左右授粉效果最好，于是在此基础上，本实验进一步研究了NaCl+硼酸溶液克服甘蓝自交不亲和性的克服机制，通过多方面的研究认为其克服机制如下：一-一一一-一一一-一一一四酬黔 NaCI+硼酸溶液克服甘蓝自交不亲和性的机理主要在于使柱头蛋白质极性改变而使之变性失去识别作用;另一方面通过甘蓝自交不亲和品系花粉和柱头互作的荧光显微观察发现在甘蓝自交不亲和系开放花的柱头上授于同株或同系统的花粉时，柱头表面乳突细胞就被激发产生拼服质，阻碍花粉发芽和花粉管发育。而经过5%Nacl溶液处理的柱头自交授粉后其表面乳突细胞中脐服质含量呈明显减少趋势，部分乳突细胞受损，花粉大多数都能萌发，且花粉管生长正常。 扫描电镜观察到甘蓝自交不亲和品系柱头上不能萌发的花粉在授粉后12小时内就会萎缩变小直至干瘪。能够萌发的花粉从一个萌发沟萌发后，另外两个萌发沟就自动萎缩，其花粉管有的扭曲不能伸入乳突细胞，仅少量花粉管能伸长进入花柱。经过5%NaCI溶液处理后的甘蓝自交不亲和品系的柱头表膜乳突细胞或皱缩或破裂，使花粉粒很容易萌发并长出花粉管，然后花粉管穿破乳突细胞壁而伸入花柱完成受精作用。 在实验中我们还发现NaCI克服自交不亲和性的效应似乎是可逆的，一般在处理后半小时左右授粉效果最好，处理时间超过1小时自交效果下降，以后间隔时间越长，效果越差。初步推测此种现象可能与甘蓝自交不亲和性中信号传导有关，具体传导机制本实验未能作进一步的研究。 对甘蓝自交不亲和品系开花前两周的花蕾进行叁种浓度的栅皮素(500协m。比栩皮素，1000林mo比棚皮素，150opmo比懈皮素)处理。田间实验统计得知，喷施1500林mol!L栅皮 布素溶液效果最好，其中02一EI品系的亲和指数由原来的0.03增至4.35，完全转化为了自交亲和系，相对于前两种浓度的处理田间效果有了显着的提高，有的处理株与人工蕾期授粉结果相当。这为甘蓝自交不亲和系的保持与繁育提供了简便途径。亲和指数提高的倍数差异可能与各株的基因型有关.也可能与棚皮素到达柱头乳突细胞的量的多少有关，还有可能是强自交不亲和系中的SRK活性太强和本试验用榭皮素浓度相对较低的缘故。 近年来，细胞转导学说认为，甘蓝自交不亲和性是通过s一受体激酶(s一receptor kinase，sRK)所控制的蛋白质磷酸化作用来实现的。懈皮素作为sRK的抑制剂，通过施用一定浓度的橄皮素可以降低SRK活性，阻止自交不亲和反应的信号转导。在甘蓝自交不亲和品系02一1中花前一天其sRK的活性为24cPm.抖犷左右。当用撇皮素溶液处理开花前两周的甘蓝花蓄时，其花前一天的sRK活性随着棚皮素浓度的增加其活性逐渐降低，当用巧oo”m。比榭皮素浓度处理时，其活性降低为1 .753。pm.件扩，几乎可以完全抑制SRK活性。因此1500林m。比栅皮?
刘璐[2]2010年在《化学药剂处理克服甘蓝自交不亲和性效应研究》文中研究表明利用自交不亲和系配制杂交种是甘蓝杂交种生产的主要技术手段之一,但由于自交不亲和系本身花期亲和力低、结籽能力差,因此需要人工蕾期授粉繁育亲本,费时费工,增加了制种成本。为了提高自交不亲和系的自交亲和指数,降低繁育成本,本试验选用了槲皮素、二甲基亚砜、木犀草素、碳酸酐酶以及钼磷酸钠共5种化学药剂对3个甘蓝自交不亲和系08A3、08C4和08370开花前两周进行花蕾处理,开花后花期自交调查结荚及结籽情况；同时采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对柱头中可溶性蛋白质和ATP、POD酶同工酶的变化进行分析,旨在寻找克服甘蓝自交不亲和性的有效方法,简化甘蓝自交不亲和系材料的繁殖,提高繁殖率,为生产应用提供必要的理论依据。研究结果如下：1.3个甘蓝自交不亲和系08A3、08C4和08370经槲皮素、二甲基亚砜、木犀草素和碳酸酐酶4种化学药剂处理后,其植株花期自交授粉得到的结荚率与亲和指数均高于同材料的花期对照,且与花期对照呈显着性差异,表明以上化学药剂在蕾期阶段处理对克服甘蓝自交不亲和性具有一定的效果。2.钼磷酸钠处理对甘蓝植株的叶片和花蕾的伤害较大。0.5%钼磷酸钠即可对植株造成伤害,表现为叶片和花蕾在两周内逐渐黄化,且伤害程度随着钼磷酸钠溶液浓度的提高而加重。3.试验结果表明,对提高甘蓝自交不亲和系结荚率的效果比较好的处理是槲皮素+二甲基亚砜、槲皮素+碳酸酐酶、木犀草素,其结荚率均显着高于同材料的花期结荚率(19.1%、26.47%和12.64%)。1500μmol／L槲皮素+2%二甲基亚砜处理08A3、08C4和08370的结荚率分别为52.17%、66.65%和40.96%,,也显着高于同材料经1500μmol／L槲皮素单独处理后的结荚率(37.65%、42.96%和32.18%),与同材料的蕾期对照结荚率(51%、66%和45%)相当；1500μmol／L槲皮素+6mg／L碳酸酐酶处理08A3的结荚率为67.05%,显着高于蕾期对照(51%),处理08C4的结荚率为62.96%,与蕾期对照(66%)相当,均显着高于同材料经1500μmol／L槲皮素单独处理后的结荚率(37.65%和42.96%)；100μmol／L木犀草素处理08A3、08C4和08370的结荚率分别为55.56%、58.13%和47.47%,均与同材料的蕾期结荚率(51%、66%和45%)效果相当。4.1500μmol／L槲皮素处理3个自交不亲和系08A3、08C4和08370的效果最好,自交亲和指数分别为1.18、1.24和1.05,虽低于同材料的蕾期亲和指数(分别为3.58、3.89、3.44),但显着高于其他药剂和花期对照处理的亲和指数,且差异较显着；1500μmol／L槲皮素+2%二甲基亚砜和100μmol／L木犀草素的效果较好,处理08A3、08C4和08370后的亲和指数分别为0.90、0.95、0.83和0.93、0.88和0.8,均显着高于同材料的花期亲和指数(分别为0.54、0.45、0.39)。5.对木犀草素(50μmol／L、100μmol／L木犀草素)、槲皮素+二甲基亚砜(1500μmol/L槲皮素+0.5%、2%二甲基亚砜)、槲皮素+木犀草素(1500μmol／L槲皮素+50μmol／L、100μmol／L木犀草素)处理后的3个自交不亲和系08A3、08C4和08370柱头蛋白和ATP以及POD酶同工酶谱带的分析结果显示,药剂处理过的柱头蛋白和同工酶谱带与同材料的花期对照相比,均有明显差异,且不同品种间也存在一定差异,说明这些药剂处理导致柱头蛋白和ATP、POD酶同工酶发生了相应的变化,可能是使花期亲和指数得以提高的生化基础。
刘璐, 李成琼, 任雪松, 宋洪元, 司军[3]2009年在《甘蓝自交不亲和性的化学控制》文中指出本文介绍甘蓝自交不亲和性的化学控制研究进展。
解莉楠[4]2003年在《羽衣甘蓝叶色、叶型遗传及自交不亲和性机理的研究》文中研究表明本研究采用日本引进的16个羽衣甘蓝品种，首先利用亲和指数法选育出自交不亲和株系，通过荧光显微法对其自交不亲和表现进一步验证；之后利用纯化的品系进行叶色、叶型的遗传分析，选育高观赏性的品系；并利用Northern杂交技术和双向电泳技术，检测了选育出的自交不亲和品系与自交亲和品系的柱头上特异表达的SLG和SRK基因、及花粉外壁上特异表达的雄性不亲和决定因子SCR和SP11基因的表达量的差异及蛋白图谱的差异，以探讨其自交不亲和性的分子机理。 在每个品种中选择3～5株进行自交，以测定其亲和指数。第一年有5个株系、第二年有3个株系符合花期自交亲和指数小于1，蕾期自交亲和指数大于5的选择标准。第一年有32个、第二年有13个株系符合花期自交亲和指数小于1，蕾期自交亲和指数大于1的标准。有1个株系花期和蕾期亲和指数均大于1，可以进一步选择作为自交亲和系，用于制种。经过2年的自交选择，各品系自交不亲和性更趋于稳定，选择出6个自交不亲和品系和1个自交亲和系。 利用荧光显微法观测花粉在柱头上的萌发情况。自交不亲和性强的‘赤兔’品系花期授粉时，花粉萌发率低且花粉管生长迟缓；而蕾期授粉时，花粉萌发正常。自交亲和的‘白波’品系的花期和蕾期授粉，花粉萌发情况均正常。形态学观察进一步验证了根据亲和指数得到的结论。 利用高压液相色谱分析，检明试材中红色品种的色素种类为花青素(Cyanidin)。自交及杂交后代色素含量(吸光度值OD)的测定结果与田间观测的颜色表现一致。杂交后代叶片的色素种类没有改变，但不同叶层的花青素含量有所变化，叶色表现出从里到外由深变浅的梯度变化。‘红雀’(红色叶)品系和‘白雀’(白色叶)品系的杂交组合的红色叶与白色叶分离比例接近于3∶1，说明其叶色可能由一对基因控制，红色为显性。‘红女士’(红色叶)品系和‘白波’(白色叶)品系的杂交组合的红色叶与白色叶分离比例接近于15∶1，说明其叶色可能由二对基因控制，红色为显性。对另一项主要观赏特性叶型的遗传研究表明，皱叶、圆叶、裂叶叶型之间杂交的F_1叶型，均近似趋中变异，但略偏向母本叶型。 对自交亲和的‘白波’品系和自交不亲和的‘赤兔’品系分别自交授粉后的48h内，间隔一定时期取柱头及花药提取总RNA，利用Northern杂交法，检测SLG、SRK、SCR、SP11基因的表达量。结果发现SLG、SRK基因在成熟的柱头上大量表达，其表达量不受性行为的影响。但SLG基因的表达量与授粉时间有关，在授粉48h柱头中表达量明显下降，这与开花当天自交不亲和反应比较强是一致的。‘赤兔’品系从幼蕾、开花至授粉后48h内柱头上SRK基因大量表达，并呈现出增加趋势，表现出很强的自交不亲和性。‘白波’品系授粉后SRK基因表达同样比较明显，但是在授粉48h后其表达量有所下降从而表现出一定程度的自交亲和性。SCR基因只在‘白波’品系幼蕾和开花前2~3d的蕾花药中表达，且开花前2~3d蕾花药比幼蕾表达量明显多，但在开花后其表达量降低至检测不到的程度。另外，SLG、SRK、SCR、SPll基因在叶片中没有检测到表达，这进一步表明上述基因是生殖器官及生殖反应中特异表达的基因。 利用自交亲和性的‘白波’品系和自交不亲和性的‘赤兔’品系的开花当天未授粉柱头、开花当天授粉柱头，开花前2一3d柱头，以及开花当天和开花前2~3d花药，提取总蛋白进行双向电泳，分析蛋白质图谱，找到了对应品种及不同时期的特异蛋白点，但对特异蛋白点与自交不亲和反应的关系仍需进一步验证。
傅强[5]2006年在《羽衣甘蓝杂交育种前期研究及其它芸薹属观赏品系的培育》文中指出我国花卉产业长期存在“重引轻育”的现象，对引进后的种类及品种如何有计划的选育或进一步进行遗传改良的工作做得极少，现在秋冬观赏栽培的羽衣甘蓝其所用的种子就是国外引进的杂种一代，国内无法制种，必须依赖进口。本研究通过对引进后的羽衣甘蓝杂种进行自交分离自交系或自交不亲和系；将优良的自交系转育成雄性不育系，为选育羽衣甘蓝杂交种创建基础材料；对甘蓝型油菜进行辐射诱变，筛选矮杆可观赏品系，以便用于大面积生产。主要结果如下：引进的羽衣甘蓝商品杂交种经过3—4代的剥蕾自交定向选择，已得到40个左右的自交不亲和系。许多重要的观赏性状得到一定程度的纯合，但还未完全稳定，为以后配制羽衣甘蓝杂种打下基础。用食盐水溶液(NaCl)克服羽衣甘蓝自交不亲和性的研究表明，3％-6％的食盐水在花期处理与人工剥蕾辅助授粉的效果相当或更好，花期喷洒食盐水溶液完全可以代替人工剥蕾在选育和繁殖羽衣甘蓝自交不亲和系中应用。羽衣甘蓝小孢子培养实验发现在诱导和分化培养基NLN添加16％的蔗糖浓度可以大大促进胚的发生，而在诱导培养基中加入低浓度的秋水仙素不影响出胚率。先后对20个材料的小孢子培养中，在6个材料中共获得了404个胚，再生植株正在培养中。初步将甘蓝萝卜细胞质(ogu cms)不育系‘R_3 cms 625’转育到了羽衣甘蓝大阪系列、名古屋系列分离的自交系中。对自交多代叶色稳定的红叶和绿叶芥菜叶色进行遗传分析，结果表明，红叶芥叶色由一对显性基因控制，红叶对绿叶为显性。在种间杂种(甘蓝x白菜)的F_4代进行~(60)Co辐射处理的M_4中获得优良的矮杆油菜‘矮8500’株系，具有开花早(2月上旬)、花期长(45—50d)、植株矮(40—50cm)、分枝多(3—4分枝)、开花量大、花色鲜艳(亮黄色)的优点，可作为早春观花花卉而大面积种植。
张桂玲[6]2003年在《甘蓝自交不亲和性快速鉴定方法的研究》文中研究说明甘蓝在我国的栽培面积很大，对我国的蔬菜供应起到了重要的作用，而甘蓝新品种的及时供应对“菜篮子”工程建设起到积极的推动作用。在甘蓝的新品种培育中，杂优育种占有重要的地位。利用自交不亲和系生产杂种一代，是甘蓝等十字花科蔬菜作物杂种优势利用的一个重要途径，而快速、准确的鉴定自交不亲和性，是这一育种工作的基础性工作，对加快杂优利用进程具有重要的意义。本试验是以甘蓝的强自交不亲和系、弱自交不亲和系和自交亲和系的各12个单株为材料对亲和指数法、荧光显微法和等电聚焦电泳法等鉴定方法进行了比较研究，同时又对甘蓝的花粉离体培养基进行了筛选、对不同授粉条件下亲和指数的变化进行了研究。本试验得出如下结论： 利用荧光显微法花期授粉后24h能准确地鉴定出甘蓝的自交不亲和性，而且这种方法操作简单方便，快速、准确，仪器容易安装，易于掌握。 利用等电聚焦电泳法可以准确、快速地鉴定甘蓝的强自交不亲和系，但不能鉴定甘蓝的弱自交不亲和系，且强自交不亲和系的特征带在PI8.9～9.1之间。 甘蓝花粉离体培养基的最佳条件为：蔗糖16.62％，硼酸126.04ppm，琼脂1％，培养时间以2h为宜。 甘蓝亲和指数的大小与花粉管的条数呈明显的正相关，其一元线性方程为：Y=-2.657355+1.150017 X(Y为亲和指数，X为花期24h花粉管数量) 不同授粉方式对亲和指数的影响为：不同花枝部位花期授粉，以上部亲和指数最高、中部其次、下部最低，蕾期授粉以中、上部的蕾亲和指数较高，下部的较低；不同花龄中，花期授粉以开花后5d的亲和指数较高，蕾期授粉以开花前1～2d的亲和指数较高；一次授粉和连续授粉中，连续授粉的亲和指数较高。因此，在杂优育种过程中，要注意选择中、下部的花枝且花期授粉时间以开花后1～2d为宜；在亲本材料的保持过程中，要注意选择中部花枝的大蕾，且以开花前1～2d为宜。
宋钊, 陈汉才, 李桂花, 张艳[7]2010年在《应用NaCl溶液克服芸薹属蔬菜的自交不亲和性》文中研究表明在花期喷洒一定浓度的NaCl溶液可以很好地克服芸薹属自交不亲和性,从而促进自交不亲和系的结实,此方法使用简单、成本较低、效益高、经济简便。对于不同作物、不同地区之间所需NaCl溶液的最适宜浓度是不同的。
乌云塔娜[8]2003年在《中国白梨自交不亲和基因的分离鉴定》文中研究表明植物自交不亲和性是植物生殖过程中的一种普遍现象。它作为防止近亲繁殖和物种退化的异花授粉机制，为物种的生存、发展以及种群的相对独立性提供了有力的保障。梨是一种配子体自交不亲和的世界性果树，生产栽培中必须配置授粉品种或通过人工授粉等措施来保证高产稳产。配置授粉品种时，首先要考虑品种间的亲和性，而品种间的亲和性取决于两个品种的S基因型，S基因型相同则为杂交不亲和，否则为杂交亲和。白梨是我国主要的梨栽培系统之一，而且是优良品种最多的梨系统。国内外对白梨自交不亲和基因及其品种S基因型方面的研究未见报道。本研究以白梨品种S基因的分离鉴定和S基因型的确定为目标，开展了分子生物学和杂交亲和力的研究，为梨丰产栽培和遗传改良提供重要的科学依据，为全面开展梨及其它果树的自交不亲和性研究提供理论依据和实践指导。主要研究结果如下： 用PCR-RFLP系统检测法确定了部分白梨品种的S等位基因和S基因型。利用梨S_(1-8~-)等位基因引物‘FTQQYQ’和‘IIWPNV’对白梨64个品种基因组DNA进行了S基因特异性PCR扩增，每个品种分离到了1～3条特异性DNA片段。PCR—RFLP(S_(1-9~-)等位基因)分析结果显示，馨香、鸭梨、大鸭梨、苹果梨、赵县大鸭梨、宝山酥、甜鸭梨、海棠酥、济南小黄梨、酥梅、恩梨、黄县长把、金梨等13个品种含有S_(1~-)等位基因，其中金梨含有两个S_(1~-)等位基因，有可能是S_(1~-)等位基因的纯合体，而其它12个品种只含有一个S_(1~-)等位基因。锦丰、新梨一号、冬黄等3个品种含有一个S_(8~-)等位基因。库尔勒香梨、香椿和黄梨等3个品种含有一个S_(3~-)等位基因。冬果、冬黄含有一个S_(7~-)等位基因。白梨64个供试品种中，均不含S_(2-)、S_(4~-)、S_(5~-)、S_(6~-)、S_(9~-)等位基因。 DNA序列测定和生物信息学分析鉴定了7个新的S等位基因，并确定了15个品种的S基因型。对用PCR-RFLP方法无法确定S等位基因和S基因型的海棠酥等15个品种的S基因片段进行了测序。DNA序列分析结果显示，这些片段与沙梨S_(1-16~-)等位基因具有很高的同源性，其相似性达80％～100％。但其中有7个S基因片段与已报道的S_(1-16~-)等位基因有差异，经分析鉴定为新的S等位基因，分别记S_(17~-)、S_(19~-)、S_(20~-)、S_(21~-)、S_(22~-)、S_(26~-)、S_(27~-)等位基因(GenBank中的接受号分别为：AY249432、AY250987、AY250988、AY250989、AY250990、AY339396、AY339397)。上述7个新S等位基因的信号肽+P1+C1+C2+HV+内含子+P2区域的DNA序列大小分别为439 bp、542 bp、458 bp、433 bp、442 bp、441 bp、449中南林学院博士学位论文中国白梨自交不亲和基因的分离鉴定bp。内含子大小分别为142 bp、251 bp、167如、139bp、148bp、144bp、152bp。推导氨基酸的长度大小分别为99、97、99、98、98、99、99个氨基酸。HV区氨基酸序列大小分别为16、13、16、15、15、15、15个氨基酸。信号肤大小均为27个氨基酸，Cl大小为11个氨基酸，CZ为10个氨基酸，HV区大小为13一16个氨基酸。分离片段除了信号肤、Cl区、CZ区、内含子和HV区外，还包括与S.RNase结构有关的3个半胧氨酸残基和与RNase功能有关的一个组氨酸残基。其中信号肤、Cl区、CZ区的变异较少，而HV区和内含子中插入、缺失的碱基较多。HV区中通常有4一10个氨基酸存在差异，内含子的同源性也很低，相似性通常低于60%。据我们目前的研究结果，白梨品种至少存在15个S等位基因，它们分别是S一、53一、57一、55一、S一2一、513一、S一6一、S一7一、S一s，、S一9·、520一、52:一、522一、526一、527一等位基因。 用杂交试验验证和确定了部分白梨品种的S基因型。品种间的杂交果实的饱满种子数平均为4.7一1 0.0，能够形成正常形态的果实，表明所形成的果实是授粉后形成的真正的果实，供试品种中不存在单性结实现象，杂交座果率能够反映品种间的亲和程度。结合PCR一盯LP分析、DNA测序技术和杂交试验亲和力分析，进一步确定了海棠酥、金花、冬黄、青梨、硬枝青、恩梨、大凹凹、济南小黄梨、大鸭梨的S基因型分别为S一5125一9、S一35一s、55520、S:95:9、S一25一2、S一519、S，25，2、515:25，9、S:S一52.52:。结合PCR一盯LP分析和杂交亲和力试验，确定T金梨、金花四号、鸭梨、赵县大鸭梨、甜鸭梨、宝山酥等品种的S基因型分别为S:S:、S一3515、S:52:、S:S:52152:、S一 52:、S一52一。同时进一步验证T用分子生物学方法确定S基因型的准确性。 本文通过PCR一盯LP分析、DNA序列分析和杂交亲和力试验共确定了22个白梨品种的S基因型。海棠酥(叁倍体)和济南小黄梨(倍数未确定)的S-基因型相同，为S，S，25:9;大凹凹、硬枝青的S基因型相同，为S:2512;金花和金花四号的S基因型相同，为S:35，s。冬黄的S基因型是5552。、香椿为535:9、新梨一号为S:522、恩梨为S一S，9、博山池为S:9527、红皮酥为S;2526、大核白为S:65，9、六瓣为S:75:9、青梨为S:95:9、大鸭梨(四倍体)为S，S:52:52，、赵县大鸭梨(四倍体)为S:S:52152:、鸭梨为S:52:、宝山酥为S，52:、甜鸭梨为5.52，、金梨为S:S:、耀县银梨为52，·。这些品
施松梅[9]2016年在《甘蓝S-位点受体激酶互作相关蛋白的研究》文中研究说明自交不亲和性(self-incompatibility,SI)是植物为了限制自交衰败和促进杂交优势,在长期进化过程中形成的一种复杂而完善的重要遗传机制。芸薹属植物表现为孢子体自交不亲和性(Sporophytic self-incompatibility,SSI),当前国际前沿对于SSI的分子研究内容主要集中在SI信号转导元件协同作用以抑制自体花粉萌发或花粉管生长的机制上。早期普遍认为在自花花粉落到干性柱头上后,花粉S-位点半胱氨酸富集蛋白(S-locus cysteine-rich protein,SCR)与柱头S-位点受体激酶(S-locus receptor kinase,SRK)胞外结构域结合,从而导致SRK的构象发生改变,使其释放原本结合在SRK激酶结构域的类硫氧还蛋白1/2(Thioredoxin-h-like protein 1/2,THL1/2),激发SRK激酶活性,而后激活的SRK与M-位点受体激酶(M-locus protein kinase,MLPK)发生某种瞬间的相互作用,将SI信号传递到柱头乳突细胞的胞内。接着SRK与臂重复蛋白1(Arm repeat containing 1,ARC1)结合引发ARC1的磷酸化作用与细胞质定位,随后ARC1泛素化Exo70A1,进而致使柱头乳突细胞中水分和一些小分子物质不能正常分泌,最终实现SI反应。然而介导SRK与ARC1互作的核心结构域是怎么样的,ARC1在自交不亲和反应中如何介导亲和因子Exo70A1的泛素化降解还是未知的,甚至ARC1是否是SRK唯一下游底物还存在质疑。虽然近年来人们在甘蓝等芸薹属作物孢子体型自交不亲和信号传导机理研究方面取得了显着进展,但是关于SRK下游信号传导通路组成蛋白的分离与鉴定的研究要滞后得多。自从1998年ARC1被鉴定为SRK的下游靶蛋白后,直至2009年才发现Exo70A1作为自交亲和因子与ARC1发生泛素作用被降解。然而转基因试验发现反义抑制B.napus和A.lyrata中ARC1基因表达,以及过量表达B.napus中Exo70A1基因,均只能部分打破材料的不亲和性,由此说明ARC1-Exo70A1组成的信号通路可能只是SRK下游信号传导途径的其中一个分支。植物受体激酶下游信号传导途径通常都是由多个信号元件和信号分支组成的信号网络。对于自交不亲和信号传导过程,当前国际上普遍认为柱头内还存在其他未知信号元件和信号分支,它们可能与ARC1-Exo70A1分支一起共同参与下游信号传导,在芸薹属和拟南芥不同生态型中,不同的信号分支参与信号传导的效应不同,因此当前研究工作的重点就是分离和鉴定这些未知的信号元件和信号分支并探讨其功能。基于此,本研究以高度自交不亲和甘蓝“A4”为材料,扩增SRK激酶域、ARC1和Exo70A1全长序列,通过酵母双杂交技术筛选SRK-ARC1-Exo70A1的核心互作模体,基于转录组测序筛选与SRK下游响应自交不亲和反应的泛素靶蛋白,同时克隆得到SRK下游MLPK的新转录本MLPKn1,通过生物信息学分析、q RT-PCR、瞬时表达及转基因等技术研究其功能。获得主要研究结果如下:(1)SRK-ARC1-Exo70A1核心作用结构域的确定利用分子克隆技术从高度自交不亲和甘蓝材料中扩增得到SRK激酶域、ARC1和Exo70A1全长序列,通过生物信息学分析发现SRK激酶域包含DUF3660、Tyrkc和DUF3403结构域,ARC1包含亮氨酸拉链、卷曲螺旋、U-box及4个ARM结构域,Exo70A1包含亮氨酸拉链、高变区、反式SUMO化修饰模体及一个典型的Exo70结构域。构建21个包含所有不同结构域的截短体,将SRK及其截短体,Exo70A1及其截短体分别亚克隆到p GADT7载体中,ARC1及其截短体分别亚克隆到p GBKT7载体中,用PEG/Li Ac法将获得的重组质粒两两组合分别共转化到酵母AH109感受态中,观察融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-a-gal/25 m M 3-AT平板上的菌落生长情况和颜色变化情况,进一步通过β-半乳糖苷酶活性检测相互作用强度。结果发现,在SRK-ARC1互作组合中,SRK激酶域和ARC1含C端臂重复区截短体组合的β-半乳糖苷酶活性最大,说明它们是构成二者互补界面的核心区段,缩短SRK激酶域中的任何结构域,或减少ARC1任意一个臂重复区,都会影响二者的相互作用。在ARC1-Exo70A1的互作组合中,ARC1含亮氨酸拉链和蜷曲螺旋的截短体与Exo70A1含高变区和反式SUMO化修饰模体的截短体组合的β-半乳糖苷酶活性最大,二者是构成ARC1-Exo70A1互作界面的的核心区段;此外,比较SRK-ARC1-Exo70A1之间的β-半乳糖苷酶活性发现SRK-ARC1的作用强度小于ARC1-Exo70A1的作用强度。(2)基于转录组测序筛选出3个新的与S-位点受体激酶互作的泛素蛋白对比未授粉和授粉30 min甘蓝柱头转录组数据,筛选出5个显着差异表达的Bo PUB蛋白基因:Bo PUB3、Bo PUB9、Bo PUB34、Bo PUB43和Bo PUB44。其中Bo PUB3和Bo PUB9在自花授粉处理30 min后显着下调表达,Bo PUB34,Bo PUB43和Bo PUB44在自花授粉处理30 min后显着上调表达。对5个Bo PUB蛋白基因的克隆和序列分析发现,5个Bo PUB蛋白均属于植物泛素家族成员,其中Bo PUB3、Bo PUB9、Bo PUB43、Bo PUB44与ARC1一样属于PUB-ARM家族,Bo PUB34属于Ser/Thr kinase家族。进化分析发现ARC1与Bo PUB9遗传关系最近,Bo PUB3次之,与Bo PUB34遗传关系最远。通过酵母双杂交和GST-pull down检测发现,SRK激酶域与Bo PUB3、Bo PUB9、Bo PUB43及ARC1的臂重复结构域发生相互作用,且相互作用强度为Bo PUB9>Bo PUB3≈Bo PUB43>ARC1。SRK与Bo PUB44和Bo PUB34均不能发生相互作用。表达分析发现Bo PUB3基因主要在柱头中表达,在自花授粉15 min,30 min和60 min处理后,表达量显着降低,而Bo PUB9和Bo PUB43在所有组织中都表达,我们推测Bo PUB3极有可能作为SRK下游靶蛋白参与自交不亲和反应。(3)甘蓝MLPK同源基因MLPKn1的克隆及表达分析以甘蓝“A4”材料gDNA和柱头cDNA为模板,通过高保真DNA聚合酶扩增得到MLPK的叁个转录本Bo MLPKf1、Bo MLPKf2和Bo MLPKn1。Bo MLPKf1cDNA大小为1215bp,编码404个氨基酸,Bo MLPKf2 cDNA大小为1233bp,编码410个氨基酸。Bo MLPKn1为新获得的转录本,其cDNA大小为1257bp,编码418个氨基酸。Bo MLPKf1和Bo MLPKf2编码的氨基酸之间只有N端不同,Bo MLPKf1和Bo MLPKn1N端均存在典型的豆蔻酰化模体,Bo MLPKf2 N端为疏水结构域。和Bo MLPKf1/2相比,Bo MLPKn1有两个插入序列,一个是在1,102-1,114bp之间有12 bp的插入,另一个是在1,152-1,182 bp之间有30 bp的插入。甘蓝叁个MLPK转录文本均具有一个高度保守的Ser/Thr蛋白激酶结构域。利用半定量分析发现Bo MLPKf1和Bo MLPKn1基因在甘蓝的叶片、花瓣、萼片、雄蕊和柱头中均有表达,Bo MLPKf2在柱头中特异表达。q RT-PCR检测发现自花授粉后Bo MLPKf2相对表达量急剧升高,而15 min后开始急剧下降。Bo MLPKf1和Bo MLPKn1在自花授粉后表达量均略有升高,但变化不显着。利用瞬时表达检测Bo MLPKn1和Bo MLPKf1一样定位在细胞膜上,通过Bi FC技术检测Bo MLPKn1与SRK、ARC1均能在细胞膜上发生相互作用。通过线性分析发现芸薹属MLPKn1基因是拟南芥At APK1b的直系同源基因,而不是以前报道的MLPKf1/2基因。MLPKf1/2基因是在芸薹属和拟南芥物种分化之后出现的,在芸薹属物种中通过与SRK互作引起自交不亲和级联反应,MLPKn1基因在整个十字花科进化中是高度保守的,且不参与自交不亲和反应。(4)MLPKn1拟南芥同源基因At APK1b的功能研究MLPKn1基因是拟南芥AtAPK1b的直系同源基因,根据AtAPK1b的gDNA序列特征在第一个外显子和第叁个外显子处设计两个sg RNA位点,并合成sg RNA引物,构建p UC119-At U6-g RNA载体,进而将重组载体连接到Cas9-p G626表达载体中,转化农杆菌GV3101感受态细胞,通过花序侵染法转化拟南芥,获得T0代种子,用0.03%Basta筛选获得T1代转基因植株。经过T1代筛选和PCR测序检测共获得13个拟南芥At APK1b突变单株系。其中有碱基缺失长度为21-509 bp的突变,也有额外碱基插入和碱基突变的现象。观察T1代转基因拟南芥初步表型,发现转基因拟南芥较野生型相比,植株矮小,长势较弱,但能够正常开花结子。(5)S-位点受体激酶相关因子在亲和突变材料中编码序列分析以高度自交亲和“Yellow sarson”材料和不亲和结球甘蓝“A4”材料柱头cDNA为模板,扩增其SRK、MLPK、ARC1和Exo70A1基因编码序列,并以花药cDNA为模板扩增SCR基因编码序列。结果发现各个材料中S-位点受体激酶相关因子均具有完整的编码序列,通过对SCR和SRK基因序列比对发现,甘蓝“A4”材料与甘蓝S28单倍型序列一致,“Yellow sarson”材料与白菜f2单倍型序列一致。氨基酸序列比对发现Bo SRKA4与Br SRKB的一致性为99%,与Br SRKQ之间的一致性为97%。Bo SCR与Br SCRB和Br SCRQ之间的一致性均为92%,有5个氨基酸的差异,Bo ARC1与Br ARC1Q和Br ARC1B的一致性均为93%,Bo Exo70A1与Br Exo70A1B和Br Exo70A1Q之间的序列一致性均为99%,只有一个氨基酸的差异。说明SCR、SRK、ARC1和Exo70A1基因在甘蓝“A4”材料和“Yellow sarson”材料中具有较高的保守性。比较两种材料MLPK氨基酸序列发现,“Yellow sarson”材料的Br MLPKf1/2与甘蓝的Bo MLPKf1/2相比,有6个氨基酸的差异,即Bo MLPKf1中K116-R,L183-I,G194-R,S288-N,T350-N,A365-E。根据前人的研究报道,MLPK的G194突变为R后MLPK不具有自体磷酸化活性。因此,两类材料自交亲和性与SCR、SRK、MLPKn1、ARC1和Exo70A1基因序列差异没有直接的关联,但是否是由MLPK基因的突变引起有待进一步研究。(6)恢复MLPKf2基因的表达对“Yellow sarson”材料自交亲和性的影响由于“Yellow sarson”材料中MLPK发生突变,MLPKf2在柱头中特异表达。为了检测恢复MLPKf2基因的表达对“Yellow sarson”材料自交亲和性产生的影响,我们根据MLPKf2基因的全长序列,结合植物双元载体p CAMBIA1300多克隆位点,设计含酶切位点的引物,构建SLR柱头特异性启动子的超表达载体p CAMBIA1300-MLPKf2,通过农杆菌介导法将上述表达载体转化“Yellow sarson”下胚轴和子叶,经预培养、侵染、暗培养、愈伤分化、不定芽增值、生根、移栽等过程,获得“Yellow sarson”转基因植株。提取转基因植株基因组DNA进行PCR检测,结果均能检测到正确的目的片段。通过q RT-PCR检测MLPKf2在转基因植株中的表达水平,结果均能检测到MLPKf2基因的超量表达,说明MLPKf2成功整合到转基因植株中DNA。表型观察发现野生型植株所结种荚正常生长伸长,且多数种荚中可见明显突起,而转基因植株种荚短小、干瘪,几乎看不见突起的籽粒,并且种荚死亡情况严重。说明恢复MLPKf2的表达能部分恢复“Yellow sarson”材料的自交不亲和性。
李凤淑, 张巍巍, 王卫民, 张成合[10]2011年在《芸薹属蔬菜自交不亲和性克服方法研究进展》文中研究指明芸薹属自交不亲和性较为普遍,花期自交则不能结籽或结籽率极低,在育种中影响种子产量。为了提高种子产量,综述了近年来克服甘蓝、大白菜和油菜自交不亲和的物理和化学方法,以为相关技术人员参考。
参考文献：
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[10]. 芸薹属蔬菜自交不亲和性克服方法研究进展[J]. 李凤淑, 张巍巍, 王卫民, 张成合. 天津农业科学. 2011