李周坤[1]2015年在《Corallococcus sp.EGB来源的糖苷水解酶的鉴定及其生物学功能研究》文中认为粘细菌是一类具有复杂多细胞行为的原核生物,在细胞生长、捕食、运动及发育等方面表现出显着的社会性特征,是目前原核生物中已知的唯一具有多细胞行为特征的类群。目前粘细菌的研究主要集中在两个方面,一方面粘细菌被认为是最高等的原核生物,其独特的多细胞行为以及复杂的发育调控机制已经被越来越多的研究者所关注,尤其是粘细菌的子实体发育过程中所涉及的细胞间信号传导过程的研究;另一方面粘细菌在生长的过程能够合成多种具有生物活性的次级代谢产物和分泌一些具有特殊活性的糖苷水解酶类,其中一些有着巨大的药物开发价值以及市场应用潜力。本研究将以实验室保存的一株粘细菌EGB为材料,对生长过程中分泌的具有特殊生物学功能以及实际应用价值的糖苷水解酶进行详细的研究。本研究发现粘细菌株EGB具有良好的抗真菌能力,经过生理生化和16S rDNA系统发育分析,将其初步鉴定为珊瑚球菌属(Corallococcus sp.)。菌株EGB具有广谱抗真菌活性,对稻曲病菌、稻瘟病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌等真菌以及辣椒疫霉、大豆疫霉等卵菌均具有很好的抑制效果,对峙生长过程中真菌菌丝坍塌,真菌生长明显受到抑制。盆栽实验结果发现,菌株Corallococcussp.EGB可以有效的降低黄瓜枯萎病的发病率,菌株EGB的胞外上清酶液能够有效的降低稻瘟病菌的感染能力。进一步研究发现菌株EGB抗真菌作用与已报道抗真菌次级代谢产物的作用机制不同,推测Corallococcus sp.EGB的胞外上清液中可能含有某种抗真菌蛋白。通过对Corallococcus sp.EGB胞外上清酶液底物谱分析和水解酵母细胞壁糖组分分析,发现菌株EGB胞外上清中可能存在一种β-1,6-葡聚糖酶,参与菌株对真菌的抑制作用。通过底物吸附解吸等多种蛋白纯化手段从Corallococcussp.EGB胞外上清粗酶液中纯化得到一个具有β-1,6-葡聚糖水解酶活性的蛋白GluM,比酶活力约为24 000 U·mg-1。底物谱分析发现GluM专一性的水解β-1,6-糖苷键连接的葡聚糖,尤其对短链β-1,6-葡聚糖活性最高。GluM具有较好的温度适应性,最适反应温度为50℃,最适pH值为7.0。纯化β-1,6-葡聚糖酶pGluM对稻瘟病菌菌丝和孢子均具有很好的水解作用,酶处理后菌丝和孢子变形,结构不完整。综合肽指纹图谱分析结果并参考Corallococcus corallococcus DSM 2259的全基因组序列设计相关引物,克隆了菌株Corallococcus sp.EGB P-1,6-葡聚糖酶GluM的完整ORF基因序列。gluM全长3222 bp,编码1073个氨基酸。GluM等电点为5.37,分子量大小为116.13 kDa,前26个氨基酸为一个典型的信号肽序列。对GluM进行区域表达发现其活性中心主要集中在N端500个氨基酸。NCBI上以Protein Blast进行比对发现GluM与来源于Ccoralloides DSM 2259的TonB通道蛋白(TonB-dependent receptor)一致性达到93%,与来源于Myxococcus xanthus DK 1622的Oar蛋白(OmpA-related protein)序列一致性达到80%,与具有β折叠桶状结构的膜蛋白以及铁离子运输蛋白具有一定的同源性,而与报道的糖苷水解酶没有任何的同源性。基于该蛋白功能以及序列分析结果,初步将该蛋白定义为一个新的糖苷水解酶家族GH136。对蛋白GluM在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行异源表达,通过底物吸附解吸的方式实现对重组蛋白rGluM的纯化。rGluM能够有效的抑制稻瘟菌孢子萌发,与直接从野生菌上清中纯化到的pGluM具有相同的抑制作用。综合上清酶液、截留分子量10 kDa超滤下液以及热失活上清液处理结果,表明菌株EGB的抗真菌能力主要是通过分泌一种可溶性β-1,6-葡聚糖GluM裂解真菌细胞壁来实现的。GluM序列分析结果表明,GluM与来源于Myxococcus xanthus DK1622的Oar蛋白(OmpA-related protein)的氨基酸序列一致性达到80%,据文献报道Oar蛋白参与粘细菌子实体的形成。本论文对Oar蛋白参与粘细菌发育过程的具体机制研究发现,Oar蛋白参于粘细菌子实体的形成和粘细菌捕食行为等过程。进一步研究发现Oar为一种外膜型通道蛋白,具有糖运输能力。对菌株DK1622上清组分分析发现,Oar蛋白参与形成一种活性组分,能够恢复oar缺陷菌株子实体的形成。通过初步的实验判断,该活性组分是一种分子量小于10 kDa的低聚糖。推测该低聚糖是作为一种信号分子参与到粘细菌细胞间细胞传导过程,进而影响粘细菌的发育过程。通过底物吸附解吸等多种纯化手段从Corallococcus sp.EGB胞外上清粗酶液中纯化得到一个高活性α-1,4-淀粉酶AmyM,产物分析发现该淀粉酶对淀粉的水解产物主要为麦芽六糖。根据肽指纹图谱肤段序列并参考Corallococcus coralloides DSM 2259基因组序列,成功获得该淀粉酶的完整序列。序列分析发现AmyM包含N端前23个氨基酸的典型信号肽,等电点为6.45,分子量大小为55.46kDa。BlastP序列比对结果显示淀粉酶AmyM属于淀粉酶GH13水解酶家族,为一个新的产麦芽六糖淀粉酶。AmyM的比酶活性高达14 000 U·mg-1,与文献报到的淀粉酶相比较AmyM的活性是最高的。酶学性质研究表明AmyM最适温度为50℃,最适pH为7.0,且活性不依赖于Ca2+。该酶在一些常见化合物存在和高盐浓度情况下有很好的稳定性,酶活性几乎不受影响。在应用于生淀粉的处理实验中,以诺维信商业化淀粉酶BAN800作为对照,发现与商业淀粉酶BAN800的复杂的寡糖产物相比较,淀粉酶AmyM水解产物单一,主要为麦芽六糖,其中麦芽六糖占总低聚糖含量的54%,显示出了较BAN800更好的优越性。
张武岗[2]2009年在《放线菌19G-317菌株及其代谢产物抑菌活性研究》文中进行了进一步梳理本研究以分离自叁江源生态环境中的一株放线菌(编号:19G-317)为研究对象,对其农用抑菌活性、生长特性、分类地位、发酵条件、抑菌活性成分的分离与鉴定方面进行了较为系统的研究,得出以下主要研究结果:1、采用菌丝生长速率法、活体组织法和盆栽试验测定了放线菌19G-317菌株发酵产物的农用抑菌活性。试验结果表明:放线菌19G-317菌株发酵产物(发酵液、菌体提取液和发酵液提取物)不但对22种供试植物病原真菌具有较强的抑菌活性,而且对4种细菌也有一定的抑制作用。菌丝生长速率法试验结果表明,在1 mg/mL浓度下,菌体提取液对8种供试植物病原真菌的菌丝生长抑制率大于90 %;发酵液提取物对11种供试植物病原真菌的菌丝生长抑制率大于90 %。孢子萌发试验结果表明,在5 mg/mL浓度下,发酵产物对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)孢子萌发的抑制率均大于80 %,发酵液、菌体提取液和发酵液提取物对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制率分别为97.30 %、98.99 %和100%。组织法试验结果表明,在10 mg/mL浓度下,发酵液、菌体提取液和发酵液提取物对番茄灰霉病的药效分别为72.17 %、76.95 %和88.63 %,高于对照药剂(50%速克灵);菌体提取液和发酵液提取物对油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)的药效均为100 %。盆栽试验表明,发酵产物对辣椒疫霉病(Phytophthora capsici)、番茄灰霉病、小麦白粉病(Blumeria graminis)、小麦全蚀病(Gaeumannomyces graminis)和小麦纹枯病(Rhizoctonia cerealis)均表现出一定的防治效果。在10 mg/mL浓度下,菌体提取液和发酵液提取物对小麦纹枯病的治疗效果分别为62.40 %和74.08 %;发酵液、菌体提取液和发酵液提取物对小麦白粉病的保护效果分别为63.35 %、59.47 %和71.77 %;发酵液提取物对辣椒疫霉病的保护效果和治疗效果为54.18 %和56.46 %。2、对放线菌19G-317菌株的生长特性和传代稳定性进行了测定。试验结果表明,该菌株的生长对氧气的需求比较高,属于专性好气型;菌落在pH6.8～8.4的生长环境下生长良好;菌落生长对渗透压的适应范围比较宽,在NaCl质量浓度为0.5～20 g/L的生长环境中均能生长,且生长情况基本一样;菌落生长对紫外线比较敏感,在紫外线照射1 h后,菌落生长明显减弱;菌株的遗传性状在试验范围内保持稳定。3、根据放线菌19G-317菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征以及16S rDNA序列研究结果,初步鉴定该菌株为链霉菌属黄色类群链霉菌。将其16S rDNA序列已注册于GeneBank,注册号为EU872020。4、综合单因素试验、Plackett–Burman设计和响应面等方法对放线菌19G-317菌株发酵工艺进行了优化。放线菌19G-317菌株优化后的发酵培养基组成为:麦芽糖50.3 g/L、胰蛋白胨9.6 g/L、NaCl 2.5 g/L、CaCO3 2.0 g/L;优化后的揺瓶发酵条件为:装液量125 mL/250mL、转速195 r/min、温度28℃、接种量7 %、初始pH 7。5、对放线菌19G-317菌株的发酵产物稳定性和发酵培养特性进行了测定。结果表明,该菌株发酵产物对热(20-100℃)比较稳定,对酸碱和紫外线的稳定性较差。发酵液随着处理温度的升高和处理时间的延长对番茄灰霉病菌和枯草芽孢杆菌的抑制率略有下降,下降幅度不明显;发酵液在偏酸或偏碱条件下对番茄灰霉病菌和枯草芽孢杆菌的抑制率均明显低于中性条件(pH 7);紫外线照射45 min后,发酵液对番茄灰霉病菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性与照射5 min的抑菌活性相比,抑制率分别下降30.83 %、8.7 %。发酵培养特性研究结果表明菌株的生长符合微生物生长的一般规律,在0～48 h为生长延缓期,在48～72 h为对数生长期,培养72 h后菌株生长达到稳定期,168 h后进入衰亡期。6、从放线菌19G-317菌株发酵产物中分离纯化出14个化合物,最终确定出8个化合物结构,分别为1-甲基-9-羟甲基吩嗪(1-methyl-9-hydroxymethylphenazin)(A),β-谷甾醇(β-Sitosterol) (C),硬脂酸(Stearic acid,D),十六酸乙酯(Ethyl-hexadecanoate,H),4-烯-1,11-(1,5-戊二醇)-癸内酯(J),5-烯-1,18-十八烷二酸二甲酯(K),3,4,6-叁乙酸-1-环己烯(L),环(丙氨酰-苯丙氨酸) [cyclo-(Ala-Phe),M]。试验结果表明,菌株代谢产物的抑菌活性成分主要属于中等极性或高极性物质,对发酵产物分离纯化得到叁个活性较好的化合物。这3个化合物(M、N、O)对番茄灰霉病菌和枯草芽孢杆菌均有较好的抑制作用。在1 mg/mL浓度下,3个化合物对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为11 mm、13 mm和19 mm,对番茄灰霉病菌的菌丝生长抑制率分别为59.67%、84.43%和97.88 %,对番茄灰霉病菌的孢子萌发抑制率分别为77.9 %、100.0 %和100.0 %。
高芬[3]2008年在《抗真菌农用抗生素KA08的研究》文中指出本文针对近年来烟草生产上危害严重的烟草赤星病(Alternaria alternata(Freis)Keissler),筛选获得了多株具有自主知识产权的拮抗链霉菌,并对具有优良特性的拮抗菌进行了分类鉴定、发酵条件优化、抗菌物质的分离纯化、抑菌防病机理及温室盆栽防效和安全性测定等方面的系统研究,开发出了一种极富研究和应用价值,且性质显着不同于多氧霉素的广谱农用抗生素KA08,对解决生产上有效防治链格孢属真菌病害的生防制剂品种单一、病原菌对多氧霉素的耐药性等问题,具有重要意义。研究结果如下:1、从采自辽宁、黑龙江、河北、山西等地的36份土样中分离到371株链霉菌。以烟草赤星病菌为靶标,利用活体对峙拮抗、发酵液抑菌活性测定和离体叶片防效试验相结合的多重筛选法,得到4株抑菌效果明显、抑菌谱较广且效果稳定的拮抗链霉菌:菌株182-2、163、88和127。拮抗菌发酵液理化性质测定表明:4菌株对温度、紫外线、自然光、酸碱的耐受性,发酵液的耐贮性和菌株的遗传特性虽有差异,但均较为稳定。其中菌株182-2显示出了良好的抑菌防病效果和优良的稳定性,有开发应用价值。2、采用经典分类和分子分类相结合的方法,对菌株182-2和菌株163进行了分类鉴定,明确了两菌株的分类地位,菌株182-2为链霉菌属可可链霉菌辽宁变种(Streptomyces cacaoi var.liaoningensis),属灰褐类群;菌株163为链霉菌属细黄链霉菌辽宁变种(Streptomyces microflavus var.liaoningensis),属粉红孢类群,并首次报道了细黄链霉菌对烟草赤星病菌的拮抗作用。3、通过培养基优化设计,获得了菌株182-2的次生代谢产物抗生素KA08的最佳发酵培养基配方:可溶性淀粉100g,花生饼粉24.0 g,酵母粉2.0 g,NH_4NO_4 2.0 g,CaCO_32.7g,NaCl 2.7 g,水1000ml,pH7.2。抗生素KA08摇床发酵的最佳条件为:制备种子液的菌种种龄为斜面培养5d,接种量4.5%(种子液浓度10~8cfu/ml),初始pH7.0,装液量40ml/叁角瓶(250ml),发酵温度28℃,发酵时间5d。对代谢过程中菌体浓度、可溶性糖、pH变化的检测结果表明:抗生素KA08来自能量代谢所用的基质,但其形成是在与初级代谢分开的次级代谢中。同时,抗生素产生和菌丝体生长有各自的最适pH,应分别加以严格控制才能优化发酵过程。4、通过捷克Doskochilova 8溶剂系统及pH纸层析证明:抗生素KA08为一类碱性水溶性抗生素,含有多个活性组分;Betina溶媒系统纸层析证明:KA08极性大,极易溶于水,且随溶剂极性的减小,溶解度降低。分析纸电泳试验中各组分的移动距离和方向,可知抗生素KA08含有多个强碱或弱碱性活性组分,属于链霉素型或放线菌素型。根据上述性质,在活性追踪下,采用草酸酸化、丙酮沉淀、活性炭吸附、大孔树脂富集、离子交换柱层析和Pharmadex LH20柱层析精制,以及二次薄层层析分离,对抗生素KA08进行了分离纯化,得到一个抗菌活性较高的组分Ha,四个活性较弱的组分a、c、d和Be。经HPLC纯度检测,组分Ha纯度较低,其两个主要成分的含量分别为62.90%和17.53%;组分a、c、d和Be的纯度分别为97.53%、98.79%、97.64%和96.06%,达到了结构测定的标准。紫外和红外谱图分析表明:组分a、c、d为氨基糖苷类物质,组分Be则更接近于核苷类物质的特点。官能团反应显示:组分Be和d含有醛基和不饱和键;组分a含有氨基酸、肽类或蛋白质结构;组分c含有不饱和键,及肽类或蛋白质结构。液质联用测定表明:组分c是分子量为269.0的小分子物质。总体分析:抗生素KA08不同于生产上广泛使用的可可链霉菌阿索变种产生的多氧霉素。5、抑菌防病机理研究表明:抗生素KA08能显着抑制病原菌菌丝生长和孢子萌发,并对菌丝和孢子萌发后的芽管有明显致畸作用。抗生试验表明:KA08对赤星病菌主要起抑菌作用,杀菌作用很弱或基本无杀菌效果。抑菌机理研究发现:该物质能导致菌丝体内电解质泄漏,同时,细胞膜上麦角甾醇的含量显着降低,菌丝内和培养液中脂质过氧化产物-丙二醛的含量明显升高,证明其作用位点在病菌细胞膜上。它还可显着抑制菌丝体内蛋白质的含量,但不能通过产生几丁质酶对菌丝细胞壁中的几丁质产生影响。抗生素KA08处理能诱导烟草防御酶系中POD、PPO、PAL、SOD、CAT活性的提高并在一定程度上诱导产生PR蛋白。同时,KA08处理还可以诱导抗病信号通路中NPR1和PR1基因的表达,且PR1基因的表达有持效性,推测其可能启动了水杨酸防御反应信号传导途径。但ERF1基因的表达未被检测到。6、温室盆栽防效试验证明:采用保护性处理时,抗生素KA08溶液(2.0mg/ml)对烟草赤星病的防效为60.63%,同时,对具有伤口的叶片有轻微损害。安全性测定表明:KA08有较好的体内运转能力。当浓度≥2.0mg/ml,通过根部吸收时,KA08对烟草3～4叶期幼苗有轻微致萎作用;浓度＜2.0mg/ml时表现安全。当浓度≥2.0mg/ml,KA08叶面喷施对成株期植株没有影响,同时具有一定的刺激生长作用。总之,抗生素KA08是一种具有优良特性的农用抗生素,它的开发和应用符合现代植物保护的生防理念,具有重要的实际应用价值。
林建朋[4]2011年在《拮抗植物病原真菌的海洋细菌筛选及其活性物质研究》文中研究指明对危害严重并难以控制的农作物病原真菌,急需寻找高效新型活性物质。在陆地寻找概率越来越低的情况下,本研究以油菜菌核病和棉花枯萎病病原真菌为指示菌,对1021株海洋细菌进行了抗菌筛选,从中得到了144株具抗菌活性的菌株,并对部分活性较好的假单胞菌株产活性物质进行了分子检测,同时详细研究了筛选得到的具有稳定拮抗油菜菌核病的海洋假单胞菌YZSN25和拮抗水稻纹枯病的海洋粪产碱杆菌WL24。分别对其抗作物病原菌谱,拮抗活性物质的分离、纯化和初步鉴定以及发酵培养条件进行了研究,结果如下：(1)在筛选的168个属中,活性菌株筛得率最高的属分别是芽胞杆菌属和假单胞菌属。筛选的1021株海洋细菌中包括海洋假单胞属菌株302株,得到了50株有活性的假单胞菌株。其中以不同来源的铜绿假单胞菌菌株筛选拮抗活性几率和拮抗活性最高。同时对筛选得到的部分活性较强的19株假单胞菌进行了活性物质的分子检测,分子检测结果显示：菌株1A06832和SH-46扩增获得了2,4-DAPG合成基因的目的片段；菌株1A04311、1A05429和1A01321扩增获得了吩嗪合成基因的目的片段；1A06832、1A00318和SH-46扩增获得了藤黄绿脓菌素合成基因的目的片段；而硝吡咯菌素合成基因片段没有获得。(2)筛选得到的海洋菌YZSN25,经生理生化鉴定和16S rRNA基因分子鉴定初步确认属于假单胞菌(Pseudomonas sp.),具体的种仍需进一步实验确定,菌株连续传代10次遗传稳定性良好,其抑菌谱结果显示对油菜菌核病菌、水稻纹枯病、玉米小斑病菌、小麦赤霉菌、棉花立枯等植物病原真菌有较强的抑制作用。(3)菌株YZSN25活性物质理化性质研究表明：对热具有良好的稳定性,对酸碱不敏感,在酸性条件下可形成沉淀,复溶后仍然具有原来的活性；经紫外、蛋白酶、有机溶剂处理都显示了较好的耐受性。硫酸铵盐析活性组分分子量介于30 kDa-100 kDa之间,活性物质经固相萃取初步分离,由薄层层析实验进一步分离纯化,经水和茚叁酮显色法初步确定为环脂肽类活性物质,同时获得两条Rf值分别为0.13(a)和0.29(b)的活性带,活性组分后又经高效液相色谱和质谱联用初步推测活性物质a和b可能为相同分子量的一类新型环脂肽类活性物质,其具体的分子量和结构有待进一步确定。(4)菌株YZSN25发酵培养基条件单因素优化实验初步确定了发酵条件组合：培养基初始pH值为自然pH值,种子液接种菌龄为12 h,接种量为3.0%,250 mL发酵摇瓶装液量为60 mL,发酵时间48 h,发酵温度28℃,摇床培养振荡频率为180r/min。对油菜菌核病离体叶片防治实验表明：活性物质粗提物的浓度为100μg/mL时对油菜菌核病的防治效果达到87.7%。(5)筛选得到海洋菌WL24,经生理生化鉴定和16S rRNA基因分析鉴定为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis),经连续传代10次抑菌活性稳定,其抑菌谱实验表明对水稻纹枯病、柿子炭疽病、玉米小斑病及蔬菜灰霉病等多种植物病原真菌有较强拮抗效果。(6)菌株WL24活性物质的理化性质研究结果表明：对热不具有较好的稳定性,60℃以上处理30 min活性下降迅速,对酸碱敏感在中性环境中较为稳定,对紫外处理敏感,经紫外光照射30 min时活性即下降37.2%,经蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶处理后,其相应的抑菌活性分别下降了31.6%、23.9%和21.3%。经测定活性物质在发酵周期为24 h达到最大值,而且抗菌活性的产生并不需要高浓度氯化钠的诱导。活性物质经硫酸铵盐析沉淀、凝胶过滤层析以及蛋白胶实验初步分离确定为分子量为40 kDa左右的蛋白。抗菌蛋白的生防实验及结构鉴定和抗菌机理的研究等相关工作有待进一步研究。
张弘弛[5]2007年在《无花果内生真菌次生代谢产物及抑菌活性的研究》文中提出本文以无花果为研究对象,针对其根、茎、叶等不同组织的内生真菌进行了分离和纯化,共获得了64株内生真菌,根据菌株形态及显微结构特征鉴定,64株内生真菌分属于3目,6科,13个属。其中链格孢属(Alternaria sp.)、镰孢霉属(Fusarium sp.)共25株,为无花果内生真菌的优势种群,共占已鉴定总株数的39.1%。不同部位分离内生真菌的数量、种类和分布不尽相同,这就表明无花果的不同部位内生真菌的数量、分布和种群存在差异。以2种细菌、2种酵母菌和6种植物病原真菌为测试菌种,对64株无花果内生真菌进行活菌及代谢产物活性筛选。确定FL24(链格孢属)、FL25(链格孢属)为活性筛选实验的目的菌种。并且从叶部分离到的链格孢属真菌FL24对所有测试菌具有很强的广谱抗菌活性。对具活性的菌株FL24进行液体发酵,提取其代谢产物粗品(51.2g)。运用硅胶柱层析、C18柱层析、Sephadex LH-20柱层析、薄层制备层析及重结晶等各种分离纯化手段,共分离得到14个化合物,通过理化性质分析和光谱分析(UV,MS,IR,NMR,DEPT,HMQC和HMBC),最终确定了其中5个化合物的结构:麦角甾醇(化合物6),环(2-甲基-丙氨酸—2-羟甲基-苯丙氨酸)二肽(化合物7),啤酒甾醇(化合物9),环(苯丙-丝)二肽(化合物12)和D-甘露醇(化合物14)。其中环(2-甲基-丙氨酸—2-羟甲基-苯丙氨酸)二肽为新化合物,环(苯丙-丝)二肽在内生真菌代谢产物中首次发现。测定了各个单体化合物对2种细菌,2种酵母菌和6种植物病原真菌的最小抑菌浓度(MIC),抗菌活性实验结果显示,化合物1,3,7,8与阳性对照结果表明对所有测试菌具有很强的抗菌活性,化合物5对细菌有很强的抗菌活性,化合物2,4,6,9,10,11,12具有一般的抗菌活性,仅对细菌和部分真菌在所测试的浓度范围具有抑制作用。化合物8对大肠杆菌(Escherichia coli)的MIC值为3.13μg/ml (硫酸卡那霉素的MIC值为3.13μg/ml),化合物7对西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)和辣椒疫霉病菌(Phytop hthora capsic)的MIC值都为6.25μg/ml(酮康唑的MIC值均为3.13μg/ml)。
汪少芸[6]2005年在《绿豆生物活性物质的研究》文中研究表明本论文是关于绿豆中生物活性物质的分离纯化、表征、蛋白质晶体培养、X-衍射及其结构与功能关系的研究。利用硫酸铵沉降、弱阳离子色谱CM-Sephadex C-50、POROS 20HS高效液相强阳离子交换色谱和Sephadex-G75凝胶色谱等方法从绿豆中分离纯化出包括苹果酸脱氢酶、几丁质酶、溶菌酶和非特异性脂转移蛋白等四个生物活性物质。并经SDS-PAGE、ClC反向色谱、质谱及N-端氨基酸测序鉴定了各活性物质的纯度。苹果酸脱氢酶由SDS-PAGE 鉴定为单倍体蛋白,分子量为38.0 kDa,等电点为9.7。最适pH 为7.2,最适温度为35℃,Km为112μM。N-末端序列为N-ASEPGPERKVAVLGAAGGIG-20,与其它植物来源的MDHs 的同源性75%～95%不等。K~+ 对酶有激活作用,Ca~(2+) 和Mg~(2+)对酶活影响不大,Zn~(2+), Pb~(2+) 和Cu~(2+)抑制酶活作用,Zn~(2+)的抑制类型为非竞争性抑制。几丁质酶由SDS-PAGE 鉴定是单倍体蛋白,分子量为30.8 kDa,等电点为6.3。最适pH 值为5.4,最适反应温度为40～50℃。对菜豆根腐病菌、棉花枯萎病菌、瓜果腐霉病菌、花生褐斑病菌和水稻白绢病菌表现出抑菌活性。溶菌酶是分子内存在二硫键的单倍体蛋白,分子量为14.4kDa。N-末端序列为N-DMPGKVALTAQSF-13,与鸡蛋清溶菌酶(HEWL)同源性为23%。最适pH 值为5.5,最适反应温度为55℃。对菜豆根腐病菌、棉花枯萎病菌、瓜果腐霉病菌、水稻白绢病菌、立枯丝核菌和葡萄灰霉病菌六种真菌和金黄色葡萄球菌具有很明显的抑菌活性。对菜豆根腐病菌的IC50 值为11μM,对金黄色葡萄球菌的MIC 值为0.26μM。非特异性脂转移蛋白nsLTP 是分子内存在二硫键的单倍体蛋白,分子量为9292Da;具有脂结合活性;对真菌菜豆根腐病菌、棉花枯萎病菌、瓜果腐霉病菌、水稻白绢病菌和金黄色葡萄球菌表现出抑制作用,对金黄色葡萄球菌的MIC 值为0.06 mmol/ml;N-端序列为N-MTCGQVQGNLAQCIGFLEKGG-21,与其他植物来源的同种蛋白具有较高的相似性。根据Crystal Screen 配制结晶缓冲液筛选结晶条件,确定以硫酸铵为沉淀剂,辛基-β-D-喃葡萄糖为去污剂,0.1mol/L Tris-HCl,pH8.5 的条件下晶体生长。在297K,约7天时间长出尺寸0.3×0.15×0.15mm的单晶。该晶体属于斜方晶形,晶胞参数为a =38.671, b = 51.785, c = 55.925A|°,α=β=γ=90℃,空间群为P2_12_12_1, 分辩率达2.4A|°。假定一个不对称单位含一个分子,Z = 4,则V_M 值约3.0A|°~3 Da~(-1),水溶液含量约58%。非特异性脂转移蛋白nsLTP 的结构存在着由4 个α-螺旋通过柔性环连接所形成的一个相对紧密的可以结合油脂的内陷的疏水空腔,该结构由8 个高度保守的半胱氨酸残基所组成4 个二硫键所稳定。NsLTP 抑菌机制的重要分子基础是具有脂结合活性、分子结构中存在一个由4 个α螺旋组成的疏水空腔结构和α螺旋具有两亲性。
朱茂山[7]2014年在《番茄灰霉菌拮抗放线菌及抑菌活性物质研究》文中认为放线菌是农业微生物的重要类群,其代谢产物是农用抗生素的重要来源。本文从土壤样品中筛选得到对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)具有高抑菌活性的拮抗放线S-091菌株,并对其进行了种类鉴定、抑菌活性评价、发酵条件、抑菌机制以及抑菌活性物质的分离、纯化及结构解析等研究。从采自不同地区的33份土壤样品中分离得到了112个放线菌菌株,并从中筛选出1株对番茄灰霉菌具有强烈抑菌活性的S-091菌株,该菌株还对多种植物病原真菌均表现出强烈的拮抗活性。采用传统放线菌分类方法和分子生物学相结合的鉴定方法对S-091菌株进行了种类的鉴定。结果表明S-091菌株的菌丝表面光滑,孢子丝成螺旋卷曲形态,孢子为椭圆形,表面长有丰富的疣刺,结合菌株的形态、培养特征及生理生化指标及16srDNA遗传分析,鉴定S-091菌株为链霉菌属不吸水链霉菌武夷山变种(Streptomyces. ahygrocopicus var. wuyishan)。采用单因子测定和正交试验方法对S-091菌株的发酵条件进行了筛选优化。结果表明：可溶性淀粉显着影响活性物质产量,花生饼粉次之,微量元素中KC1显着影响活性物质产量。最优培养基配方：以花生饼粉1%、可溶性淀粉4.5%、氯化钾0.4%、酵母粉0.2%及硝酸铵0.1%为最佳配比。最适宜发酵温度为32℃、摇床转速为140r·min-1,pH值7.0,空气量以250mL叁角瓶装液100-125mL为最适。采用显微观察方法研究了S-091菌株发酵液活性成分的粗提物对灰霉菌的抑菌机制。用S-091菌株发酵液粗提物分别处理灰霉菌菌丝和分生孢子3hr和0.5hr后,菌丝停止生长,孢子停止萌发,菌丝体的细胞和分生孢子的内溶物产生浓缩凝集现象,并被处理的幼嫩菌丝体细胞在生长点处出现畸形膨大,但未见细胞壁和细胞膜破损、内溶物外溢,电导率测定表明支持无电解质外渗结论。对S-091菌株发酵液活性成分理化性质研究结果表明发酵液活性成分对可见光、紫外光及热等环境因子具有很好的稳定性,对pH5以下的酸性条件下活性不稳定。有机溶剂萃取试验表明发酵液活性成分不溶于乙酸乙酯等有机溶剂；草酸沉淀法、丙酮沉淀法处理发酵液后沉淀部分无活性。通过pH纸层析、捷克八溶剂系统和Betina溶剂系统纸层析及纸电泳试验初步确定活性成分为两种或多种组分的混合物,并且活性成分极性中等或偏大,其中一部分为弱碱性,一部分强碱性。用大孔吸附树脂柱、硅胶柱层析等分离方法对发酵液的活性物质粗提物进行去杂分离后,再采用制备型高效液相色谱仪对样品纯化,获得了主要活性成分的纯化合物,种白色无定形粉末状物质。将获得的纯化合物进行质谱与核磁谱的测定及结构解析,确定该活性化合物分子量为695,分子式为C35H53NO13,化学名称为：(1S,3R,5R,7E,13E,15E,17E,19ES,21S,23R,24S,25R)-11-甲基-12-乙基-1,3,5,25-四羟基-21-((2R,3S,4S,5S,6R)-四氢-6-甲基-3,5-二羟基-4-氨基-2H-吡喃-2-烷氧基)-10,27-二嗯-9-氧代-二环[21.3.1]二十七-7,13,15,17,19-五烯-24-羧酸,确定该化合物四烯类大环内酯类活性物质。通过文献检索发现该化合物为Tetramycin A,Tetramycin A在农用抗生素研究方面未见文献报道。
李亚玲[8]2007年在《乳酸片球菌细菌素的分离纯化及理化性质研究》文中认为细菌素是食品级微生物的代谢产物,有的细菌素已作为食品防腐剂用于提高食品的安全性。本研究的目的是以从国内发酵食品中分离出的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)为研究对象,探索提高其片球菌素产率的培养条件,研究片球菌素的分离纯化技术和活性测定方法,并阐明其抗菌物质的本质和理化特性。本研究对乳酸片球菌所产的抑菌物质进行H2O2酶处理、酸性产物抑菌作用排除试验和胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K的处理试验,证明该菌所产的抗菌物质,不是H2O2和酸性产物,并且对蛋白酶敏感,因而确认该菌产生的抑菌物质为蛋白质性质的细菌素。将乳酸片球菌接种于MRS培养基,对产生细菌素的条件进行优化,确定其有最大细菌素产量时培养基的初始pH为6.5,静置培养温度为37℃,培养时间为16h。本研究对几种分离体系进行了摸索比较,最终建立了叁步法体系对片球菌素Pediocin进行分离纯化。根据细菌素在pH6.0时与菌体的吸附力最强,pH2.0时吸附力最弱,通过调节pH和离心来收集细菌素。透析并冷冻干燥浓缩后经过SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析和Sephadex G-50凝胶层析进行纯化,收集有活性的峰。经过分离纯化叁步法后,与培养上清液相比,细菌素的最终得率为0.19%,比活为5.17×104AU/mg,纯化了34.54倍。提纯的细菌素样品经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,出现了单一的条带,这就证明已得到了较纯的细菌素,其大小约为4600Da。本研究还对片球菌素Pediocin的理化性质作了全面的观察。试验表明,细菌素在20℃—100℃的条件下保温20min活性没有太大变化,具有很高的热稳定性;在pH1—pH14的条件下20℃处理3h抑菌效果稳定,具有良好的耐酸碱特性;经有机溶剂处理过的细菌素样仍能保持较好的抑菌活性,有机溶剂对细菌素活性的影响不显着;冷冻、冷藏后细菌素仍能具有很好的抑菌活性,且冷冻后的活性还要优于冷藏后的效果。乳酸片球菌细菌素具有被开发为安全和高效生物食品防腐剂的巨大潜力,本研究建立的乳酸片球菌细菌素的分离纯化技术及关于其理化性质探索的研究将为乳酸片球菌细菌素的工业化生产和实际应用提供理论依据。
张学敏[9]2014年在《融合肽hEGF-AWRK6的原核表达、纯化及功能研究》文中研究表明抗菌肽AWRK6（SWVGKHGKKFGLKKHKKH）是经Dybowskin-2CDYa（SAVGRHGRRFGLRKHRKH）设计改造而得的新型抗菌肽，由18个氨基酸残基组成，预测分子量为2130.5，等电点为10.78，不稳定系数为-6.74。抗菌肽AWRK6与以往发现的其它蛙类抗菌肽相比相似性小，它富含赖氨酸，具有亲水性强，稳定性高，抑菌活性强和抑菌谱广等特点，有开发成为肽类抗生素的潜能。人表皮生长因子（hEGF）是促生长因子家族成员之一，具有促新生血管形成和表皮细胞增殖的作用，是上皮细胞、表皮细胞和间充质等敏感细胞的丝裂原。hEGF在皮肤创伤以及烧伤、烫伤等方面已有广泛应用。本文利用大肠杆菌表达系统，通过IPTG诱导，获得稳定表达的融合多肽hEGF-AWRK6，并从体外和体内两个方面研究融合多肽的抗菌和促愈合功能，进而为下一步研究融合多肽的其他生物学功能奠定基础。研究方法：根据大肠杆菌密码子的偏好性，设计并合成了抗菌肽AWRK6和人表皮生长因子hEGF融合多肽的基因序列，并与原核表达载体pET-30a(+)连接，构建重组表达质粒pET-30a(+)-hEGF-AWRK6。经PCR、双酶切和测序验证后，将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，对重组菌株进行诱导表达，WesternBlot验证融合多肽表达情况。在其它条件一致的情况下，从诱导时间、IPTG诱导浓度及诱导温度叁个方面对目的蛋白表达条件进行优化。菌体经超声破碎离心后，收集上清和沉淀，进行蛋白电泳分析，确定融合多肽的表达形式。将收集的包涵体进行洗涤、溶解、复性后，利用镍离子金属螯合亲和层析方法分离纯化目的蛋白，除盐冻干后，获得组分单一的含有His标签的融合多肽。使用TEV蛋白酶将His标签去除，经过二次过柱获得融合多肽hEGF-AWRK6。采用菌落计数法检测融合多肽的抑菌活性，采用MTT法和细胞划痕实验检测融合多肽促细胞增殖活性。建立小鼠烫伤模型，在动物水平检测融合多肽抑菌及促进伤口愈合的功能。研究结果：成功构建了原核表达重组质粒pET-30a(+)-hEGF-AWRK6。阳性重组菌株经IPTG诱导后，成功表达了融合多肽。在其它条件一致的情况下，37℃、1mmol/L IPTG、发酵时间为4h为融合多肽的最佳表达条件。融合多肽以包涵体形式表达，经分离纯化后，获得目的蛋白干粉（0.05~0.1g/L）。去除标签的融合多肽hEGF-AWRK6对大肠杆菌O157和金黄色葡萄球菌均有良好的抑制活性，MTT实验及细胞划痕实验证明融合多肽在一定浓度范围内，具有促细胞增殖和迁移作用。体内实验结果初步说明融合多肽具有抑制伤口处细菌生长、提高机体免疫力、促进伤口愈合的功能。本研究获得了具有生物学活性的融合多肽，为进一步研究融合多肽hEGF-AWRK6的皮肤修复功能及新药开发奠定一定的理论及实验基础。
贾锐[10]2016年在《高产杆菌肽地衣芽胞杆菌的鉴定与选育》文中研究说明抗菌肽(Antimicrobial peptide)是一类广泛存在于自然界生物体中的小肽类物质,它是机体先天性免疫系统的重要组成部分。抗菌肽具有独特杀菌机制和广谱抗菌性,不易造成病原菌的耐药性。一些抗菌肽对肿瘤细胞有广谱杀灭活性,为癌症患者提供了一类新型的抗癌药物,其在医药、养殖、食品、生物防治等方面有很高的应用价值。本实验拟从天然界筛选得到1株抑菌活性较强、抑菌谱较广的芽胞杆菌,并通过分离纯化得到其主要抑菌活性物质,再通过全基因组改组方式提高其主要活性物质产量。主要研究结果如下:1.抗菌活性芽胞杆菌的筛选与鉴定:从天然原桃胶中分离到一株有抑菌活性物质的芽胞杆菌TJ12。其发酵产物对金黄色葡萄球菌(StapHylococcus aureus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、蜡样芽胞杆菌(Bacallus cereus)和串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)有抑菌活性。结合菌落形态、生理生化指标、16S rRNA序列和gyrB序列将TJ12菌株鉴定为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)。2.抑菌活性物质的分离纯化与鉴定:通过硫酸铵分级沉淀、有机溶剂萃取、羟丙基葡聚糖凝胶层析、高效液相色谱分离纯化,得到其主要活性物质。该物质对pH、温度和叁种蛋白酶(胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶)有较好的稳定性。经电喷雾电离质谱分析,初步鉴定该株地衣芽胞杆菌TJ12的主要抑菌物质为杆菌肽A。3.基因改组选育高产杆菌肽地衣芽胞杆菌及改组菌株差异分析:为了提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量,采用全基因组改组技术进行菌株选育。以地衣芽胞杆菌TJ12为原始菌株,通过紫外(UV)诱变、亚硝基胍(NTG)诱变、常压室温等离子体(ARTP)诱变构建了 TJ12菌的突变体库。在优化其原生质体制备和再生条件的基础上,以其中4株诱变菌株(U11、U23、H1、L71)作为亲本,采用聚乙二醇(PEG)介导的方法进行叁轮多亲本的全基因组改组,同时,结合双亲灭活的筛选方法,最终选出1株杆菌肽产量提高并能稳定遗传的优良菌株F3,其摇瓶水平发酵36 h,杆菌肽A产量达760mg/L,为野生菌株TJ12的1.7倍。与野生菌株TJ12相比,改组株提前进入生长稳定期,两者发酵过程pH几乎无差异;最终菌体生长量虽低于野生菌,但单位菌体还原糖产量及杆菌肽产量都高于野生菌株;其合成基因和调控基因表达量相对野生菌株都上调,其中合成基因上调幅度较大。推测改组菌株自身有了更强大的杆菌肽耐受机制,且合成基因相关部位可能发生了改变。
参考文献：
[1]. Corallococcus sp.EGB来源的糖苷水解酶的鉴定及其生物学功能研究[D]. 李周坤. 南京农业大学. 2015
[2]. 放线菌19G-317菌株及其代谢产物抑菌活性研究[D]. 张武岗. 西北农林科技大学. 2009
[3]. 抗真菌农用抗生素KA08的研究[D]. 高芬. 沈阳农业大学. 2008
[4]. 拮抗植物病原真菌的海洋细菌筛选及其活性物质研究[D]. 林建朋. 华中农业大学. 2011
[5]. 无花果内生真菌次生代谢产物及抑菌活性的研究[D]. 张弘弛. 西北农林科技大学. 2007
[6]. 绿豆生物活性物质的研究[D]. 汪少芸. 福州大学. 2005
[7]. 番茄灰霉菌拮抗放线菌及抑菌活性物质研究[D]. 朱茂山. 沈阳农业大学. 2014
[8]. 乳酸片球菌细菌素的分离纯化及理化性质研究[D]. 李亚玲. 天津大学. 2007
[9]. 融合肽hEGF-AWRK6的原核表达、纯化及功能研究[D]. 张学敏. 辽宁大学. 2014
[10]. 高产杆菌肽地衣芽胞杆菌的鉴定与选育[D]. 贾锐. 南京农业大学. 2016