王 楠
盐城卫生职业技术学院基础医学部 江苏盐城 224005
摘要：目的 利用油菜花粉过敏原粗提液建立间接ELISA检测方法。方法 油菜花粉过敏原粗提液为抗原包被酶标板，通过对间接ELISA各反应条件的优化，确定了最佳反应条件。结果 油菜花粉过敏原浓度稀释度为1：200（即浓度为10ug/ml），血清血清稀释度为1：100。采用已建立的间接ELISA反应条件，对10份阴性血清的检测结果进行统计学分析，确定间接ELISA的判定标准，D450值大于等于0.254为阳性。本试验建立的间接ELISA检测法敏感度为89.7%。
Abstract：Objectives To establish an ELISA technique to detect oilseed rape pollen allergen.Methods An indirect ELISA technique was developed using oilseed rape pollen allergen as a capture antigen.By optimizing the reaction conditions for each indirect ELISA，we determine the optimal reaction conditions.Results With oilseed rape pollen allergen as a capture antigen，the proper dilution of coating antigen was 1：200 and the proper dilution of serum was 1：100.The cut-off value of the assay was determined by statistics analysis based on 10 negative samples，with OD equal to or higher than 0.254 being considered positive.The test established indirect ELISA assay sensitivity was 89.7%.
前沿
花粉过敏是由花粉引发的过敏性疾病，可引发鼻粘膜、眼结膜、支气管，甚至哮喘的发生。油菜是我国大面积种植的农业经济作物，粉源广，花期长，是我国春季主要花粉之一。有研究表明目前对花粉过敏的患者中有7.1%的患者对油菜花粉过敏[1]。油菜花粉过敏的准确诊断，能有效的控制油菜花粉过敏的发生。因此，建立一种低成本，且具有较高特异性的油菜花粉过敏的诊断方法，具有重要的意义。故而，本实验以油菜花粉过敏原粗提液为抗原建立间接ELISA方法，用于对油菜花粉过敏的诊断。
材料与方法
1.材料
1.1 实验仪器与试剂 油菜花粉采自江苏盐城市郊，辣根过氧化物酶标记抗人IgE抗体（anti-human IgE/HRP）为美国Sigma公司产品，TMB显色液、牛血清白蛋白等试剂均为国产试剂。iMark酶标仪，美国Bio-Rad公司。
1.2 血清 待测阳性血清采自本市各医院诊治的39例哮喘患者，其中男性20例、女性19例，年龄3~52岁，平均（29.5±15.0）。患者的入选标准[2]：用油菜花粉粗提浸液进行皮肤点刺试验（SPT）阳性，风团直径≥3mm，无花粉特异性免疫治疗史。阳性参考混合血清为油菜花粉粗提浸液SPT试验（风团直径≥5mm）的5位患者，阴性参考血清为母亲无遗传过敏史脐带血清10份。
2.方法
2.1 油菜花粉过敏原粗提液 油菜花粉过敏原的提取参照参考文献[3]的方法，用Bradford法测定过敏原总蛋白量。
2.2 抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定 按照方阵滴定法，用0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液将油菜花粉过敏原抗原包被液稀释，稀释度1：800、1：200和1：50，纵向包被酶标板，200ul/孔适当稀释的油菜花粉过敏原，水浴37℃ 2h，用PBS洗涤液（含20%的Tween20）洗涤5次，每次5min；每孔加入200ul含有3%BSA封闭液，4℃封闭过夜；涤液（方法同上）；每孔加入200ul稀释血清，血清稀释度分别1：200、1：100和1：50，水浴37℃ 2h，涤液（方法同上）；加入100 ul/孔anti-human IgE/HRP，稀释度为1：1000，水浴37℃ 2h，涤液（方法同上）；加入100 ul/孔TMB显色液，水浴37℃ 30min；加入100 ul/孔 2mol/l硫酸终止液；在450nm处，用酶标仪检测实验结果，实验均设置3个附孔。
2.3 间接ELISA阴性和阳性临界值的确定 按上述建立的间接ELISA方法，对10份阴性血清进行检测。每份样品重复4孔，结果取其平均值，计算样本的D450平均值和标准方差（SD）。阳性临界值=阴性D450平均值+3* SD，当样品D450值大于等于阳性临界值即判定为阳性，小于此值为阴性。
2.4 敏感性试验 对39份阳性血清进行100倍稀释后进行检测，同时设置1个空白孔，2个阳性血清和2个阴性血清对照。阳性血清的检出率将反映间接ELISA方法的敏感性。
3.结果
3.1 抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定
按照方法2.2进行实验，考察抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度从而确定间接ELISA的最优条件。
方阵滴定显示，当血清的稀释度为1：100，油菜花粉过敏原稀释度为1：200，即浓度为10ug/ml，阳性血清的D450值可达0.893，阴性血清的D450为0.085，阴性与阳性血清的D450值相差最大（P/N=10.506）。因此，选择1：100为最佳血清稀释度，1：200为油菜花粉过敏原最佳稀释度。
表1 间接ELISA 方阵滴定结果
Table 1 Result of the indirect ELISA cheek board titration
3.2 间接ELISA阴性和阳性临界值的确定
用建立的间接ELISA方法，对10份阴性血清进行检测，得到阴性血清D450平均值为0.110，标准差为0.048，阳性临界值为0.254。
3.3 敏感性试验
对39例SPT阳性血清进行100倍稀释后检测，其中35份血清值为阳性，本试验建立的间接ELISA检测法敏感性为89.7%。
4.结论
本研究根据经典ELISA的实验原理，以油菜花粉过敏原作为包被抗原，通过方阵滴定法确定间接ELISA法的最优检测条件，即油菜花粉过敏原浓度稀释度为1：200（即浓度为10ug/ml），血清血清稀释度为1：100。对10份花粉过敏阴性血清进行测定，确定D450=0.254为ELISA方法的临界值。本试验建立的间接ELISA检测法敏感性为89.7%。
参考文献：
[1]陈小文，尧荣凤，李建春，等.油菜花粉过敏原的分析鉴定与纯化[J].免疫学杂志，2011，27（3）：225-231
[2]Zhang C，Gjesing B，Spangfor MD，et al.The allergen-specificities Ig E reactivity pattern of Chinese house dust mite allergic patients[J].Allergy，2008，63（12）：1640-1641
[3]乔秉善.变态反应学实验技术[M].中国协和医科大学出版社.2002.30-32
作者简介：王楠（1988-），籍贯：江苏省盐城，女，硕士研究生，助教，主要从事分离纯化方面的研究，E-mail：biowangnan@126.com。
论文作者:王楠
论文发表刊物:《健康世界》2015年17期供稿
论文发表时间:2016/4/13
标签：血清论文; 花粉论文; 油菜论文; 过敏原论文; 阳性论文; 阴性论文; 方法论文; 《健康世界》2015年17期供稿论文;