张锁连 牛剑锋 孙华君
（山东烟台业达医院 264006）
【摘要】 宫颈癌的发病率和死亡率之高令人畏惧，早期发现和早期治疗宫颈癌是降低死亡率和发病率最为有效和必要的手段。目前筛查宫颈癌的方法很多，包括细胞学和病毒学检测等。病毒检测方法包括DNA和mRNA检测，而哪种检测方式能最有效地反应病变发展状态和进展趋势，值得我们深究。本文具体探讨高危型人乳头瘤病毒癌基因E6/E7mRNA检测对宫颈癌筛查的现状和意义。
【关键词】 宫颈癌；人乳头瘤病毒；E6/E7 mRNA
【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）23-0210-03
目前宫颈癌占女性恶性肿瘤的第二位，仅次于乳腺癌。绝大多数宫颈癌是由高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染引起。目前检测HPV感染方法主要以病毒基因组DNA为检测目标，以此判定待测宫颈细胞载有的HPV类型及数量。实际上宫颈细胞的病变程度不仅与HPV类型及数量相关，更和HPV的活动程度关系紧密，而以HPV癌基因组E6/E7 的转录子（mRNA）做为病毒活动程度的指标，其定量检测具有相当重要的临床意义。
1.宫颈鳞状细胞癌病因和HPV
宫颈鳞状上皮内病变（squamous intraepithelial lesion，SIL） 是与宫颈鳞状细胞癌密切相关的一组癌前病变，反映了宫颈鳞状细胞癌发生发展中的连续过程。20世纪70年代德国病毒学家Zur Hausen 提出HPV与宫颈癌发病密切相关的假设以来，大量研究表明HPV感染，特别是高危型HPV持续感染是绝大多数宫颈SIL和宫颈癌的主要原因[1]。HPV在自然界广泛存在，是一种无包膜的闭环、双链DNA病毒。HPV病毒分为两部分：外围的衣壳和内部的双链环状DNA，DNA早期编码区域的产物为E1、E2、E4、E5、E6、E7蛋白。高危亚型HPV感染宫颈上皮细胞后，病毒癌基因E6/E7 mRNA转录，生成2种癌蛋白E6/E7蛋白。癌蛋白可与宿主细胞的细胞周期调节蛋白p53和Rb蛋白等相结合，导致细胞周期控制失常，发生癌变。但是大多数情况下HPV被宿主清除，只有少数感染者发生SIL或者癌，从SIL发展为癌一般需要10～15年。因此，HPV感染后E6/ E7蛋白的表达与否与后期宫颈癌的形成高度相关，检测高危型HPV E6/E7 mRNA的转录有利于宫颈癌的早期诊断、早期治疗及预后监测。
2 宫颈癌筛查方法
目前，宫颈液基薄层细胞学检查（TCT）是宫颈癌筛查中应用最为广泛的方法，但是，细胞学是形态学检测，是高危型HPV感染宫颈移行带细胞这一必要因素作用下，综合各种因素最终导致的细胞形态学改变。因此，TCT不能单独用于区分那些小部分可能进展为浸润癌的病变（SIL）和绝大多数可能自然消退的病变[2-3]。HPV检测是病因学检测，可提高高级别SIL及宫颈癌的检出率，对细胞学检查结果可疑患者的分类及癌前病变治疗后随访均具有重要意义[4]。然而，大多数HPV感染都是无症状和一过性的，其可在2年内被清除[5]，这使得HPV DNA检测虽然具有较高的敏感度，但特异度相对较低[6]，意味着HPV DNA检测可能检测出过多临床无意义感染，不能更好地反应出宫颈细胞的病变程度。为了更准确的评估患者病情，还可对高危HPV的E6/E7 mRNA进行检测。E6/E7mRNA检测体现了HPV致癌基因E6/E7的转录情况，反映病毒活动程度。HPV E6/E7mRNA 在宫颈组织中表达，说明HPV表达出癌基因活性，故检测HPVE6/E7 mRNA的表达较之检测HPV DNA能更好地预测宫颈癌前病变进展，是对HPV致癌风险的评估，为临床筛查宫颈癌提供新依据。
3.HPV E6/E7 mRNA 检测技术原理及实验过程
HPV E6/E7mRNA 定量检测所使用的专利技术--bDNA 技术是利用专利的探针设计捕获待测目标，再经过杂交信号放大即可定量检测病毒，最终通过添加底物产生化学发光，以此对待测核酸做出定量检测。实验使用的标本可以与TCT共用一份取样细胞，避免重复取样，减少成本。实验过程较简易，无需RNA 抽提，无需反转录，无需PCR 扩增，在普通实验条件下简单快速完成目标的特异精确定量，一般1个工作日即可出结果。E6/E7 mRNA检测结果判读简单，以拷贝数>0为阳性，阳性表示：（1）宫颈细胞有高危HPV感染。（2）病毒癌基因E6/E7处于活动期，（3）宫颈细胞正处于病变转化活跃期。（4）患者有一定风险或风险正在增加。阴性表示：（1）宫颈细胞无癌基因E6/E7或E6/E7处于静止期。（2）宫颈细胞无病变转化风险或正处于病变转化静止期。（3）患者无风险或风险正在降低。
4.HPV E6/E7 mRNA 检测在宫颈病变中的临床应用
2006 年欧洲生殖器感染及肿瘤研究组织认为HPV E6/E7mRNA 检测应作为宫颈癌筛查的重点研究对象[7]。有研究显示，HPV E6/E7 mRNA在宫颈组织中表现癌基因活性[8]。E6/E7 mRNA水平与宫颈病变的严重程度相关[9]。有研究者提出HPV E6/E7 mRNA检测可能更好地预测病情的进展[10-11]。Molden [12]等对宫颈病变患者进行几年随访发现，HPV mRNA较HPV DNA具更高特异性及阳性预测值。徐瑛[13]等发现HPV mRNA拷贝数的均数随着病变等级的升高而明显增加，高拷贝数的病例大部分集中在高级别SIL组。HPV mRNA的高拷贝可能提示高级别SIL的存在或向高级别发展趋势的存在。这一结果显示HPV E6/E7基因对SIL的发生、发展具有促进作用。这与刘桐宇[14]和王华[15]等研究发现基本吻合，即随着细胞学级别增高，E6/E7 mRNA表达相应增加，不同细胞学分组间mRNA拷贝值差异有统计学意义。单独使用HPV E6/E7 mRNA检测，在普通人群筛查中，特异度优于HPV DNA检测[6]。刘佳佳等[16]对25例宫颈TCT结果为ASC-US患者进行分析，结果证实高危型HPV E6/E7 mRNA检测的特异度为91.7%，明显高于HPV DNA分型检测的50.0%。高危型HPV E6/E7 mRNA检测相对更高的特异度决定了其排除可疑或低级别SIL的能力更强，能够把更多可能无进展性的病变重新归入常规的筛查程序中，有效减少对疾病程度的误判，避免过度检查、治疗给患者带来的经济负担和心理负担。此外，研究发现HPV E6/E7 mRNA对今后进展为≥CIN2预测能力优于TCT检查，但没有与DNA检测的对比[17]。黄宝英[18]等研究发现，E6/E7 mRNA检测联合TCT极大提高了临床筛查敏感度与阴性预测值，但特异度下降，阳性预测值并无明显提高。该研究认为联合两种指标筛查时，ASC-US患者如果E6/E7 mRNA检测阴性可以不用立即做阴道镜检查，这和赵方辉等[19]提出的观点类似。周星等[20]研究结果显示，40岁以下者高危型HPV DNA的感染率高达50％，但HPV E6/E7 mRNA的检出率较低，说明此年龄段大部分HPV感染可以消退，只有少部分有恶性进展的风险；对于40岁以上妇女的HPV E6/E7 mRNA检测相对更有意义。随着年龄增加，高危型HPV DNA的阳性率有降低趋势，HPV E6/E7 mRNA的阳性率逐渐升高，40岁以上者中二者阳性率相近且差异无统计学意义，说明年龄较大者感染HPV后进展为恶性病变的风险相对较大，应尽早采取措施。
5.初步探讨
目前的问题是如何在宫颈癌筛查中最好地使用病毒检测这一技术。在临床实践中，存在HPV感染但未发生E6/E7癌基因的复制转录时，HPV DNA阳性但E6/E7mRNA阴性。还存在有些高级别SIL患者HPV检测为阴性，有些宫颈炎患者HPV检测则为阳性。考虑到试验方法的敏感度和特异度，对DNA结果阴性而阴道镜或TCT检查异常的患者也要引起注意。高危HPV阳性的患者在治疗前需在阴道镜下进行仔细评估，尤其是对想生育的育龄期女性，因为她们可能是HPV一过性感染[21]。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆熊光武等[22]对宫颈癌标本进行HPV16 E6/E7基因DNA测序，发现E6/E7基因在癌症标本上的突变，这样可导致DNA探针失效，结合多顺反子转录原理，也许可以解释DNA检测阴性而mRNA检测阳性这一现象。bDNA 技术是一种全新的基于杂交信号放大的核酸检测技术，是否应该把E6/E7mRNA当作风险预测的指标，值得进一步研究。但是，有大量研究提出HPV E6/E7 mRNA检测可能更好地预测病情的进展，黄宝英等[23]研究认为E6/E7mRNA检测更适合筛查和随访观察。相信HPV E6/E7 mRNA 检测技术作为国际上HPV检测试剂的最新一代检测靶标，是一项很有前途的、值得推广的检测技术，尤其是对高危型HPV持续性感染者宫颈病变的诊断更具有实际的临床应用价值。随着国内外对HPV E6/E7mRNA 检测技术不断的深入研究，高危HPV E6/E7mRNA检测可能成为宫颈癌筛查的最首选方式之一。
【参考文献】
[1]Baussano I, Elfstrǒm KM，Lazzarato F,et al.Type-specific human papillomavirus biological features: Validated model-based estimates estimates[J].PLoS One, 2013,8(11): e81171.
[2]Monsonego J, Hudgens MG, Zerat L,et al. Risk assessment and clinical impact of liquid-based cytology，oncogenic human papillomavirus (HPV)DNA and mRNA testing in primary cervical cancer screening (theFASE study)[J].Gynecologic Oncology, 2012 ,125(1): 175-180.
[3]徐玉萍，苏慧茹，王峰.TCT结合阴道镜检查在宫颈病变中的应用价值[J].河北医药，2010,32(16):2211.
[4]Matah M, Sareen S. Detection of HPV by PCR-A novel step in the prevention of cancer cervix [J].The Journal of Obstetrics and Gunecology of India,2012, 62(2): 188-191.
[5]Jaisamrarn U, Castellsagué X, garland Sm, et al. Natural history of progression of HPV infection to cervical lesion or elearance: Analysis of the control arm of the large, randomized PATRICIA study [J].PLoS One, 2013, 8(11):e79260.
[6]Burger EA, Kornor H, Klemp M, et al. HPV mRNA tests for the detection of cervical intraepithelial neoplasia: A systematic review [J]. Gynecologec Oncology, 2011, 120(3):430-438.
[7] Cuschieri K, Wentzensen N. Human papillomavirus mRNA and p16 detection as biomarkers for the improved diagnosis of cervical Neoplasia [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2008,17(10): 2536-2545.
[8]Lie AK, Kristensen G. Human papillomavirus E6/E7 mRNA testing as a predictive marker for cervical cancinoma[J].Expert RevMol Diagn, 2008, 8(4):405-415.
[9]Andersson s, Hansson B,Norman I, et al.Expression of E6/E7 mRNA from high risk human papillomavirus in relation to CIN grade,viral load and p16INK4a[J].Int J Oncol,2006,29(3):705-711.
[10]Argyri E, Tsimplaki E, Daskalopoulou D, et al. E6/E7 mRNA xpression of high-risk HPV types in 849 Greek women[J].Anticancer Research, 2013, 33(9):4007-4011.
[11]Tjalma WA, Depuydt CE. Cervical cancer screening:which HPV test should be used—L1 or E6/E7 ?[J]. European Journal of Obstetrics ＆Gynecology and Reproductive Biology,2013,170(1):45-46.
[12]Molden T，Nygard JF，Kraus I，et al. Predicting CIN2+ when detecting HPV mRNA and DNA by PreTect HPV-proofer and consensus PCR:A 2-year follow-up of women with ASCUS or LSIL Pap smear[J]. Int J Cancer. 2005，114(6):973-976.
[13]徐瑛，黄丽丽.高危人乳头瘤病毒DNA及其E6/E7 mRNA对宫颈病变的影响[J].浙江医学，2013，35（21）：1897-1899.
[14]刘桐宇，谢榕，郑雄伟，等．TCT标本检测高危HPV E6/E7 mRNA及在宫颈病变中的应用研究[J]．中华妇幼临床医学杂志（电子版），2011,7(3):202-205.
[15]王华，陈亚宝，叶丽华，等．应用支链DNA技术检测人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA在宫颈疾病筛查中的价值[J]．中华临床医师杂志（电子版），2011,5(15):4362-4366．
[16]刘佳佳,冯姝,瞿全新,等.高危型人乳头瘤病毒E6/E7 mRNA在宫颈病变筛查中的作用研究[J].中国全科医学，2014,17(10): 1140-1143.
[17]S?rbye SW, Arvyn M，Fismen S, et al.HPV E6/E7 mRNA testing is more specific than cytology in post-colposcopy follow-up of women with negative cervical biopsy [J] .PLoS One,2011,6(10):e26022.
[18]黄宝英,周伦顺,富显果,等. HPV E6/E7 mRNA检测对宫颈癌筛查意义的初步评价[J].中华肿瘤防治杂志，2013，20（14）：1061-1064.
[19]赵方辉，章文华，潘秦镜等．宫颈癌多种筛查方案的研究[J]．中华肿瘤杂志，2010,32(6):420-424.
[20]周星，刘丽华，张金库等.宫颈脱落细胞HPV E6／E7 mRNA、HR—HPV DNA在宫颈病变筛查中的应用[J].山东医药，2014，54（6）：54-56.
[21] Liverani Ca, Clavattini A, Monti E, et al. High risk HPV DNA subtypes and E6/E7 mRNA expression in a cohort of colposcopy patients from Northern Italy with high-grade histologically verified cervical lesions[J]. AmJ Transl Res,2012,4(4):452-457.
[22]熊光武,袁杨,李萌,等．北京地区宫颈癌HPV16上游调控序列、E6、E7癌基因序列初步分析[J]．遗传,2010,32(4):339-347.
[23] 黄宝英，周伦顺，富显果等.HPV E6/E7mRNA检测对宫颈癌筛查意义的初步评价[J].中华肿瘤防治杂志，2013,20(14):1061-1064.
论文作者:张锁连,牛剑锋,孙华君
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第23期供稿
论文发表时间:2015/10/19
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