仇容[1]2004年在《DCC与P53、VEGF基因在结直肠癌表达的相关性研究及DCC基因杂合性缺失的临床意义》文中提出结直肠癌缺陷基因(deleted in colorectal carcinoma gene，DCC)是位于18q21.3上的抑癌基因。其表达产物为190KD的跨膜磷蛋白，参与细胞间或细胞和基质间的相互作用。 血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是最重要的血管内皮因子，可诱导血管内皮细胞的增殖，在肿瘤的生长和转移中起着重要的作用，VEGF在许多肿瘤组织及培养的肿瘤细胞株中都有显着的高水平表达。 在人类肿瘤中，抑癌基因p53是突变最频发的基因，它位于17号染色体短臂上。P53蛋白是一种分子量为53KD的细胞核磷蛋白，它的产物调节细胞周期和细胞凋亡。 在恶性肿瘤的癌基因研究中，不少学者提出了多基因协同作用假说，认为在肿瘤的发生、发展阶段，至少有两个或两个以上功能不同的癌基因在各自发挥不同作用的同时，相互协同，促进了细胞的癌变。 癌变时DCC基因存在多种改变，杂合子缺失(loss of heterozygosity，LOH)即是其中之一。LOH反映了抑癌基因功能缺失的情况，并可能与肿瘤的分化及转移等都存在一定的关系。 国内外已有文献报道VEGF及P53表达的相关性研究，也提示两者的表达存在明显的关联。而DCC与肿瘤组织的VEGF及P53表达是否存在一定的相关性，则未晰仁大母硕士李位论义见报道。另外考虑到象P53及DCC基因在消化道肿瘤中的表达都非常明显，因此在本课题研究中侧重研究DCC与P53、vEGF在结直肠癌中表达的相关性及其与肿瘤恶性程度的关系，从而进一步为揭示肿瘤的发病规律提供分子生物学基础。 实验方法免疫组化(Immunohistoehemist叮)部分:1、标本的来派和选择 选择杭州市红十字会医院1999一2002年结直肠癌手术切除标本41例，各病例病理诊断明确，主要组织学类型包括腺癌、粘液腺癌、印戒细胞癌等。2、免疫组化 常规石蜡切片，应用免疫组化二步法检测结直肠癌的P53、VEGF及DCC蛋白表达，使用抗体为P53单克隆抗体及VEGF鼠抗人单克隆抗体，分别购自上海长岛和北京中山生物技术有限公司，DCC兔抗人多克隆抗体为武汉博士德公司产品，二抗使用通用型二步法免疫组化检测试剂。3、结果判定 P53蛋白位于细胞核内，阳性表达细胞多为弥漫分布;VEGF染色位于胞膜及胞浆内，癌组织内阳性细胞以弥散分布为主:DCC蛋白阳性染色主要位于细胞浆内，以上阳性染色均呈棕黄色细颗粒状。攘合醉链反应(po一ymerase ehain reaetion，PeR)部分:1、标本来源 选择杭州市红十字会医院新鲜手术标本，取材后于一20℃保存，提取DNA。取材部位包括癌变组织，正常粘膜及癌变淋巴结。2、PCR扩增 根据已有文献报道选择DCC基因VNTR位点进行PCR扩增，引物序列如下:上游5’一GATGACATTTTCCCTCTAG一3’，下游5’一GTGGTTATTGCCTTGAAAAG一3’。预计扩增的目的片段长度为Zoobp。PCR反应体系50林1，内含25pmol引物、2.smol几胡TP、2.5u几q酶、soong nNA模板和loxPeR缓冲液(MgZ+plus)。PeR反应晰江大李硕士李位份友参数:95℃smin，Xl;94oC405，52oC405，72oC605，X35:72℃10min，XI3、琼脂粉凝胶电泳井成像 直接在琼脂糖凝胶中电泳分离，澳乙锭染色，紫外光下观察电泳分离并进行照相。 结果1、免疫组化 在41例结直肠癌的病例中，通过免疫组化二步法检测几种蛋白的表达情况，其中因为野生型P53的半衰期短，我们检测到的P53为突变型P53。结果如下:突变型P53表达的阳性数为26例，占63.4%。VEGF的阳性表达共27例，占65.9%。其中，肿瘤大小、浸润的深度、淋巴结的转移情况及分化程度的不同在表达时都有不同程度的差异。在所有41例病人中，DCC表达阳性者有10例，占24.4%。在不同肿瘤大小。浸润深度及淋巴结转移情况下的表达情况亦有不同。2、PCR 在收集的23例新鲜结直肠癌标本中开展PCR实验，有18例分别在ZoobP和160bp位置出现两个条带，即为信息个体，其中有7例出现DcC基因的杂合缺失，占实验病例数的30.4%，占信息个体的38.8%。浙卜大李硕士李位伦义结论1、P53与VEGF在结直肠癌中的表达存在明显的相关性，提示P53可通过刺激VEGF表达以促进肿瘤组织的生长。2、DCC与P53及VEGF表达无明显相关性。3、在P53一vEGF共同表达的情况下，DcC蛋白表达缺失较为明显。提示结直肠癌中，在突变型P53与VEGF共同呈现阳性表达的同时，也存在抑癌基因DCC的表达下调，因此可推断结直肠癌的发生发展是癌基因和抑癌基因协同作用的结果。4、结直肠癌中DCC基因存在杂合缺失的情况，显示与肿瘤的淋巴结转移情况有明显的相关性，从而提示其对肿瘤的转移起促进作用。
佚名[2]2004年在《肿瘤生物标志物与肿瘤转移》文中指出14—3—3zeta蛋白对肿瘤转移抑制作用的探讨陈惠华’王妍徐元基杜芝燕陆应麟军事医学科学院基础医学研究所,北京,100850 摘要目的:探讨14—3—3zeta蛋白与肿瘤转移的关系。, 方法:通过联合抑制消减杂交和基因芯片技术筛选在肺巨细胞癌高、低转移株中表达水平存在显着差异的序列,其中一条与14—3—3zeta高度同源。在RNA和蛋白水平对其表达水平进行验证;构建14—3—3zeta的正反义真核表达载体并分别转染肺巨细胞癌高、低转移株;并对转染后细胞的增殖能力、黏附能力以及迁移能力等生物学行为进行研究。
刘建, 罗时敏, 曹杰[3]2012年在《结直肠癌肝转移相关高危因素的研究进展》文中研究说明我国结直肠癌的发病率和病死率近30年来呈上升趋势,居癌症病死率的第5位[1]。肝脏转移是影响结直肠癌患者生存率及死亡率的重要因素。就目前的研究而言,还没有发现某个基因或蛋白与结直肠癌肝转移存在确定的特异性关系。因此,在没有可靠生物标志物的前提下,如何结合其他临床病理特征对结直肠癌肝转移提早预警就显得尤为重要。本文就结直肠癌肝转移相关高危因素研究进展作一综述。
刘明辉[4]2004年在《DPC4和VEGF在胆管癌中表达的相关性研究》文中进行了进一步梳理目的：研究DPC4和VEGF在胆管癌组织中的表达及其与胆管癌临床病理因素的关系。方法：采用免疫组织化学方法，检测44例胆管癌患者的手术切除标本DPC4和VEGF的表达，并用FⅧ因子抗体标记癌组织血管内皮细胞，计数肿瘤内微血管密度(microvessel density，MVD)。结果：1．DPC4在胆管癌组织中的阴性表达率和VEGF在胆管癌组织中的阳性表达率明显高于正常胆管组织中的相应指标(P＜0.05)。DPC4在胆管癌组织中的阴性表达率和VEGF在胆管癌组织中的阳性表达率在淋巴结转移组、周围浸润组、UICC分期Ⅲ—Ⅳ期组、中下段胆管癌组均高于相应对照组的相应指标(P＜0.05)；2．胆管癌的MVD值在淋巴结转移组、周围浸润组、UICC分期Ⅲ—Ⅳ期组、中低分化组明显高于相应对照组的相应指标(P＜0.05)；3．在胆管癌中，DPC4阴性表达组的MVD值显着高于DPC4阳性表达组(P＜0.01)，DPC4的表达与MVD呈显着负相关性(r=-0.752，P＜0.001)；同时，VEGF表达阳性组的MVD值显着高于VEGF表达阴性组(P值＜0.001)，VEGF的表达与MVD呈显着正相关性(r=0.468，P=0.001)；4．DPC4和VEGF在胆管癌组织中的表达呈显着负相关(r=-0.49，P＜0.01)。结论：1．DPC4的阴性表达和VEGF的阳性表达可能在胆管癌发生发展中起了重要的作用；2．DPC4的阴性表达可能在中下段胆管癌发生发展中起了尤为重要的作用；3．DPC4的表达下降可能增加了VEGF的表达，导致肿瘤血管生成增多，从而促进胆管癌的发生和发展；4．DPC4的阴性表达和VEGF的阳性表达可能促进胆管癌的浸润和转移；5．DPC4的表达缺失在胆管癌的发病过程中可能是晚期事件。
时强[5]2012年在《通过改变Smad4的表达研究BMP7-Smad4-Id2信号通路在大肠癌发生发展中的作用及其机制》文中研究指明第一部分Smad4蛋白在大肠癌组织中的表达及临床意义目的：探讨Smad4蛋白在大肠癌组织中的表达及其与患者临床、病理之间的关系。方法：利用免疫组化S-P法检测60例大肠癌组织、27例癌旁正常组织中Smad4的表达；回顾性收集相应患者的临床病理资料。结果：Smad4在大肠癌原发灶中的免疫组化切片评分,与癌旁正常组织相比,采用Mann-Whitney检验,U=294.50,有显着性差异(P<0.001)；Smad4的表达情况与肿瘤的浸润层次,淋巴结转移,Dukes分期有关(P<0.05)。结论：Smad4的低表达可能与大肠癌发生发展有关,Smad4可以作为大肠癌的预后指标和基因靶向治疗的有效靶点。第二部分Smad4表达下降对大肠癌细胞HCT116增殖性、迁移性、侵袭性以及BMP7-Smad4-Id2通路的影响(体外实验)目的：本部分实验研究HCT116细胞中的Smad4被小干扰RNA沉默后,是否影响了该细胞的增殖性、迁移性、侵袭性及细胞周期,是否影响了BMP7-Smad4-Id2信号通路的作用。方法：构建Smad4-shRNA质粒,并通过转染和筛选形成该质粒稳定转染的HCT116细胞。通过PCR, Western实验来验证Smad4-shRNA质粒的作用,并测量Id2的表达情况。通过MTT来评价细胞的增殖性的改变,通过Transwell实验来评价细胞迁移性和侵袭性的改变,通过流式细胞技术来评价细胞周期的改变。结果：成功构建Smad4-shRNA质粒,并形成该质粒稳定转染的HCT116细胞株。通过PCR和Western实验分别验证了Smad4在基因和蛋白水平的降低。同时,通过Western实验,得到干扰质粒对Smad4蛋白的抑制率为47.17%。干扰后的HCT116细胞,增殖性、迁移性和侵袭性均增强(P<0.05),细胞周期发生改变。干扰后的HCT116细胞中Id2的表达增加,但在该类细胞中BMP7增多不能引起Id2的改变。结论：在HCT116细胞中,Smad4的降低可以使细胞的增殖性、迁移性、侵袭性增加,Smad4是一种抑癌基因。BMP7通过Smad4改变Id2的表达来影响细胞的活性。BMP7-Smad4-Id2在大肠癌的发生发展中发挥作用。第叁部分Smad4表达下降对大肠癌细胞HCT116裸鼠植瘤生长以及BMP7-Smad4-Id2通路的影响(体内实验)目的：研究Smad4表达降低的HCT116细胞在裸鼠皮下植瘤后肿瘤的生长情况以及BMP7细胞因子对各种细胞所植肿瘤的影响。方法：用HCT116细胞,HCT116-HK细胞,HCT116-Smad4-shRNA细胞构建裸鼠皮下成瘤模型,5天后肿瘤形成,将裸鼠分为(1)HCT116组：(2)HCT116-HK组：(3)HCT116+BMP7组：(4)HCT116-Smad4-shRNA组：和(5)HCT116-Smad4-shRNA+BMP7组。五个实验组,每个实验组每隔2天瘤周注射0.2ml100ng／ml的BMP7或生理盐水,重复4次。观察肿瘤的大小和重量。通过PCR和免疫组化,测量每组肿瘤中Smad4、Id2在基因和蛋白水平上的表达量。通过TUNEL实验,评估每组肿瘤细胞凋亡的情况。结果：5天后,裸鼠植瘤均成功,肿瘤5-7mm大小,HCT116-Smad4-shRNA组肿瘤生长明显快于HCT116组和HK组。PCR提示HCT116-Smad4-shRNA组肿瘤中Smad4mRNA表达降低,Id2mRNA表达增加。对于OT116-Smad4-shRNA组细胞所成肿瘤,有无BMP7作用,不影响Id2的表达和肿瘤的生长。TUNEL实验提示HCT116-Smad4-shRNA组肿瘤中细胞凋亡降低。结论：Smad4-shRNA可以在体内实验中抑制大肠肿瘤的生长。BMP7-Smad4-Id2细胞信号通路在大肠癌的发生发展中起作用。第四部分Smad4再表达对大肠癌细胞SW480增殖性、迁移性、侵袭性以及BMP7-Smad4-Id2通路的影响(体外实验)目的：研究Smad4再表达对大肠癌细胞SW480增殖性和侵袭性的影响；探索BMP7是通过BMP7-Smad4通路,还是直接对Id2起调节作用,从而使Id2发生改变而影响细胞的活性。方法：成功构建Smad4-cDNA质粒并形成该质粒稳定转染的SW480细胞。通过Western实验来验证Smad4的再表达,并测量Id2的蛋白表达情况。通过MTT来评价细胞的增殖性的改变,通过Transwell实验来评价细胞迁移性和侵袭性的改变,通过流式细胞技术来评价细胞周期的改变。结果：成功构建Smad4-cDNA质粒,并形成该质粒稳定转染的SW480细胞株。通过Western实验验证了Smad4在蛋白水平的再表达。再表达后的SW480细胞,增殖性、迁移性和侵袭性均减弱(P<0.05),细胞周期发生改变,静止期细胞增多。再表达后的SW480细胞中Id2的表达降低,而且在该类细胞中BMP7增多可以使该类细胞的活性增强且引起Id2的增加。结论：在SW480细胞中,Smad4的再表达可以使细胞的增殖性、迁移性、侵袭性降低,进一步证实Smad4是一种抑癌基因。BMP7通过Smad4改变Id2的表达来影响细胞的活性。BMP7-Smad4-Id2在大肠癌的发生发展中发挥作用。
谢忠士[6]2008年在《DPC4基因转染对结肠癌细胞的抑制作用》文中研究表明大肠癌是一种常见的严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤,在我国的各类恶性肿瘤中,大肠癌的发病率及死亡率居第四位。大肠癌的发生发展是多个基因事件共同作用的结果,其中既有癌基因的激活,也有抑癌基因的失活。在肠道肿瘤的发生、发展中,最重要的基因事件之一是人类染色体18q2的基因改变,18q2是肠道肿瘤中基因改变最频繁的区域,在这一部位已发现多个与大肠癌密切相关的抑癌基因,譬如DCC(deleted in colorectal cancer),APC(adenomatous polyposis coli gene)等,而DPC4(deleted in pancreatic carcinoma,locus4)基因是位于人类染色体18q21.1发现的基因。本课题通过研究抑癌基因DPC4在结肠癌中的表达,证实在结肠癌组织中,DPC4蛋白表达下降,其分布及着色程度呈异质性,其中高分化腺癌尚有部分表达,低分化腺癌及转移癌表达明显下降,有的甚至无表达,表明DPC4在结肠肿瘤中的表达情况与肿瘤分期、分化程度及转移有关。通过DPC4/Smad4逆转录病毒pLXSN载体的构建,为DPC4/Smad4基因治疗肿瘤创造了条件。通过DPC4基因转染结肠癌细胞,MTT实验均提示结肠癌细胞SW480的生长受到明显抑制,说明野生型的DPC4基因的转染可以显着抑制结肠癌细胞的生长。
参考文献：
[1]. DCC与P53、VEGF基因在结直肠癌表达的相关性研究及DCC基因杂合性缺失的临床意义[D]. 仇容. 浙江大学. 2004
[2]. 肿瘤生物标志物与肿瘤转移[C]. 佚名. 第叁届中国肿瘤学术大会论文集. 2004
[3]. 结直肠癌肝转移相关高危因素的研究进展[J]. 刘建, 罗时敏, 曹杰. 广东医学. 2012
[4]. DPC4和VEGF在胆管癌中表达的相关性研究[D]. 刘明辉. 昆明医学院. 2004
[5]. 通过改变Smad4的表达研究BMP7-Smad4-Id2信号通路在大肠癌发生发展中的作用及其机制[D]. 时强. 复旦大学. 2012
[6]. DPC4基因转染对结肠癌细胞的抑制作用[D]. 谢忠士. 吉林大学. 2008
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