孙丽英[1]2003年在《水稻黑条矮缩病毒基因组片段S3和S9编码蛋白的表达分析》文中认为通过RT-PCR，获得了玉米粗缩病病原湖北分离物(Hbm)基因组片段S9的全长cDNA克隆，并测定了它的全序列。Hbm-S9全长1900bp，含有两个非重迭的开放阅读框(ORF)，ORF1起始于52-54 nt的AUG，终止于1093-1095 nt的UGA，推测编码一个由347个氨基酸组成、分子量约为40kDa的蛋白(P9-1)。ORF2起始于1160-1162 nt的AUG，终止于1786-1788 nt的UAA，推测编码一个由209个氨基酸组成、分子量约为24kDa的蛋白(P9-2)。序列分析表明，Hbm-S9与水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)中国不同分离物之间的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.4-98.9％和96.0-99.0％，且与日本RBSDVS9的序列同源性高于与玉米粗缩病毒S8的序列同源性。此结果进一步证明了引起我国玉米粗缩病的病原为RBSDV。 SDS-PAGE分析表明，经IPTG诱导，RBSDV Hbm-S9编码的蛋白可在大肠杆菌中高效表达。并以Hbm-S9 ORF1表达的蛋白为抗原，免疫家兔，制备了Hbm-P9-1抗血清。用Western blot方法，在感染Hbm病毒的玉米植株中可检测到Hbm-S9 ORF1编码的蛋白。 另外构建Hbm-S3-5＇端、Hbm-S3-3＇端的原核表达载体，分别在大肠杆菌中成功表达并纯化了目标蛋白，并以此为抗原免疫家兔制备了抗血清。Western-blot显示由P3-N端和P3-C端蛋白制备的血清都与感染RBSDV(Hbm)表现明显粗缩症状的玉米病叶产生特异性反应，并且免疫印迹位置与Hbm-S3核苷酸序列推测的蛋白分子量大小相符。而P3-C端蛋白制备的血清与粗提纯的RBSDV病毒粒子有特异的免疫学反应。据此推测Hbm-S3编码的蛋白可能为结构蛋白，其生物学性状有待进一步研究。
卢嫣红[2]2011年在《南方水稻黑条矮缩病毒和水稻黑条矮缩病毒RNA沉默抑制子鉴定分析》文中研究说明南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)和水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)同为呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)第2组的成员,可危害水稻、玉米、小麦、大麦等植物寄主,给农业生产造成了巨大的经济损失。两者均为dsRNA病毒,病毒侵染寄主植物后如何克服寄主RNA沉默机制进而完成复制和侵染有待深入研究。本研究对RBSDV和SRBSDV基因组编码蛋白的抑制子活性进行了鉴定,以期阐明病毒编码蛋白在抵抗寄主植物RNA沉默等防卫过程中的作用。利用农杆菌共浸润方法对SRBSDV第6基因组片段编码的SP6蛋白的抑制子活性进行分析,结果显示,SP6能抑制由正义RNA介导的局部和系统沉默,能阻止沉默信号的传导,回复由GFP引起的沉默,但不能抑制由dsGFP引起的沉默。结果表明SP6为SRBSDV编码的抑制子。SP6突变体(ORF第二个氨基酸突变为终止密码子)不能抑制由GFP引起的局部沉默,表明SP6抑制作用是通过蛋白而不是mRNA起作用。利用PVX在非转基因本氏烟上表达SP6增强了PVX的致病性,表明SP6可能是一个致病因子。有些病毒中存在不止一个沉默抑制子,因此本研究进一步对SRBSDV编码的SP7-1、SP7-2、SP8、SP9-1、SP9-2和SP10的抑制子活性进行了分析。SRBSDV S7编码的SP7-1和S9编码的SP9-1能抑制由正义RNA介导的局部沉默,但均不能抑制由正义RNA介导的系统沉默,也不能抑制由dsGFP诱导的沉默。SP9-1能阻止沉默信号传导,不能回复已建立的沉默,不能加重PVX引起的症状。以上结果表明,SP7-1和SP9-1可能也是病毒编码的抑制子。RBSDV知SRBSDV在病毒形态,基因组组成和进化关系上非常接近。已有研究表明RBSDV P6能抑制由GFP引起的局部沉默和系统沉默,为病毒编码的抑制子,而SRBSDV S6编码的SP6同样为病毒编码的抑制子,因此,SRBSDV知RBSDV对应基因组编码蛋白功能存在相似性。为进一步确认此结论,本研究对RBSDV P5-2、P7-1、P7-2、P9-1和P9-2的抑制子活性进行了分析。结果表明,RBSDV P7-1、P9-1与SRBSDV SP7-1、SP9-1的功能相似,能抑制由正义RNA介导的局部沉默,不能抑制由GFP引起的系统沉默和由dsGFP诱导的沉默。
胡秀弟[3]2012年在《南方水稻黑条矮缩病毒云南分离物基因组特征及其编码蛋白的功能预测》文中进行了进一步梳理近年来，由南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black streaked dwarf virus，SRBSDV）引起的南方水稻黑条矮缩病成为我国南方稻区暴发最为严重的病害之一，给我国水稻生产造成了巨大的损失。目前国内外学者对SRBSDV的发生和危害、发病症状、流行规律、检测技术、预测和防治、病原性质、传播介体和寄主、分类地位以及基因组结构和部分编码蛋白的功能开展了初步的研究。但迄今为止，南方水稻黑条矮缩病毒的分类地位、病毒的来源仍未完全确定，病毒的传播和致病机制也不清楚，对SRBSDV很多基因编码产物的功能也是一无所知。为此，确定南方水稻黑条矮缩病毒的来源，从蛋白功能分析水平上探讨病毒的致病机制对防治病害的发生有着十分重要的意义。本文从云南德宏州芒市感染南方水稻黑条矮缩病毒的水稻样本中提取总RNA，根据已报道的SRBSDV广东、海南和湖北分离物序列设计引物，利用RT-PCR技术，扩增获得了SRBSDV云南芒市分离物（SRBSDV-YNMShi）的S1—S10的全基因组序列，总长29123nt。序列分析表明，SRBSDV-YNMShi与SRBSDV-GD、SRBSDV-HN相应片段的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.1%-99.7%和96.7%-100%，它们之间核苷酸的变异主要是同类碱基的转换，即G-A或C-T；而且大多数变异发生在密码子的第叁位碱基上，很少引起蛋白质水平上的变化。在氨基酸水平上，也多是同类氨基酸的替代，仅有SRBSDV-HB S3片段编码的800aa处存在一个Asn的缺失。SRBSDV-YNMShi与其它叁个分离相应片段的GC含量、编码区和非编码区的长度、末端保守序列、基因组片段特异反向重复序列等基因组结构基本一致；末端保守序列特征与斐济病毒属第2组病毒（Fijivirus group2）相同，同源比对和进化分析都表明SRBSDV与水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）、玉米粗缩病毒（MRCV）同属一组。YNMShi编码的外层衣壳蛋白和P7-1与其它地区SRBSDV分离物的氨基酸序列的进一步比较分析结果表明，它们之间的同源性都在99%以上，系统进化分析发现都没有发生地域性的进化分离，暗示SRBSDV不同分离物都来源于共同祖先。最后，结合多种生物信息学分析软件对所获得的SRBSDV-YNMShi编码蛋白进行生物信息学分析并对其功能进行了预测。对保守结构域分析表明，斐济病毒属中，S1、S2、S3、S8、S10的编码蛋白具有保守结构域。P4可能在RNA形成mGpppAmpGp帽子结构中起作用，具有RNA鸟苷酰转移酶功能，可能是SRBSDV的外壳蛋白。P5具有跨膜区、Z-finger结构域、碳水化合物结构域以及可能的激酶结构域，还与P2和P8含有一个相同的inhibitor129结构域。另外，P5与吲哚嗜胨菌具有物质转运功能和ATP水解酶功能的叁磷酸腺苷结合盒转运体有24%的同源性，而且与长滩军团菌分离出的具有结合ATP和转移酶功能的假定丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶有28%的同源性。根据呼肠孤病毒结构和蛋白功能相似性可以推测P5为可能的核心衣壳蛋白，与P2和P8互作，共同构成核心框架。P7-2含有核酸结合位点和Ig样结构域，可能作为病毒转录调控因子。P5、P7-1、P9-2这叁个蛋白都含有跨膜螺旋区，可能与病毒的复制、转录、侵染有关。P7-2与只在昆虫体内复制的NLRV没有相对应的同源蛋白，暗示P7-2这叁个蛋白可能与病毒在植物细胞中的复制有关。
李祥宇[4]2013年在《RBSDV和SRBSDV安徽分离物全基因组特征及SRBSDV mp基因的功能分析》文中认为近年来，水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）和南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）引起的水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病在安徽省各稻区以及玉米种植区危害日益严重，生产上仅凭症状难以区分两种病毒，本研究利用RT-PCR方法能够实现一次性检测和鉴定RBSDV和SRBSDV2种病毒。为了深入了解安徽省RBSDV和SRBSDV起源及演化关系，本研究克隆了2个RBSDV和1个SRBSDV安徽分离物S1-S10基因组各个组分并测定序列全长，以期明确RBSDV和SRBSDV安徽省分离物的分子变异以及遗传进化特征。另外，植物病毒从侵染位点径向运动到临近细胞是成功建立系统侵染的关键，而病毒编码的运动蛋白（MPs）即参与病毒的转运。目前，协助SRBSDV在植物细胞间转移的运动蛋白尚不明确，本研究拟构建SRBSDV3个基因的植物表达载体，初步鉴定SRBSDV可能编码的运动蛋白。对明确SRBSDV系统侵染的分子机制以及分析其他基因的功能奠定了基础。1安徽省RBSDV和SRBSDV的分子鉴定根据RBSDV和SRBSDV S9保守序列设计3个特异性引物，不仅可以从单独感染RBSDV或SRBSDV的水稻样本中分别扩增出1条大小不同的特异性条带，而且还可以从感染RBSDV和SRBSDV的混合水稻样本中一次性扩增出2条大小不同的特异性条带。从安徽省4个县市水稻田采集矮缩水稻样本，RT-PCR检测发现，庐江和郎溪水稻样本受到RBSDV侵染，怀宁和宣州水稻样本受到SRBSDV侵染。将特异性条带克隆和测序，序列分析表明，庐江、郎溪2个样本的核苷酸序列与RBSDV山东和浙江分离物S9部分片段序列相似性高达99.3%~99.8%，且与RBSDV的亲缘关系最近，说明庐江和郎溪样本感染的病毒是RBSDV的2个分离物；怀宁、宣州2个样本的核苷酸序列与SRBSDV山东和海南S9部分片段序列相似性高达99.5%，且与SRBSDV亲缘关系最近，说明怀宁和宣州样本感染的病毒是SRBSDV的2个分离物。2RBSDV和SRBSDV安徽分离物S1-S10全序列的测定及其序列分析采集安徽省萧县玉米粗缩病样、庐江县和怀宁县水稻黑条矮缩病样，提取总RNA，设计特异性引物扩增了2个RBSDV安徽分离物以及1个SRBSDV安徽分离物（RBSDV-MX8，RBSDV-LJ，SRBSDV-HN2）全基因组序列，3个分离物S1-S10全基因组序列全长分别为29141nts、29142nts和29121nts。将RBSDV和SRBSDV安徽分离物S1-S10分别与斐济病毒属其他成员以及同种病毒分离物间进行序列比对，结果发现，RBSDV和SRBSDV与斐济病毒属其他成员S1-S10相似性分别为26.3%~84.8%、20.7%~74.8%、20.9%~99.5%、21.1%~99.5%、20.0%~99.5%、20.5%~99.6%、21.6%~100.0%、21.3%~99.8%、21.9%~99.7%和21.3%~99.8%，其中RBSDV分离物之间S1-S10相似性分别为53.1%~68.4%、65.3%~74.8%、72.2%~90.5%、94.6%~98.6%、93.3%~98.5%、91.6%~98.6%、93.7%~99.4%、94.0%~99.1%、88.6%~99.7%和93.2%~99.0%，SRBSDV分离物之间S1-S10相似性分别为83.3%~85.3%、67.8%~70.1%、80.5%~99.4%、97.5%~99.5%、98.3%~99.5%、97.4%~99.6%、99.1%~100.0%、98.9%~99.8%、98.6%~99.7%、98.7%和99.8%，RBSDV分离物与SRBDV分离物之间S1-S10的相似性分别为56.8%~75.3%、58.3%~68.9%、21.2%~23.6%、20.5%~22.1%、63.2%~65.8%、59.6%~62.8%、66.3%~67.2%、65.0%~67.8%、67.7%~70.2%和73.5%~75.9%。进一步构建S1-S10不同组分的系统关系树，RBSDV与SRBSDV分别聚成各自独立的分支，说明RBSDV和SRBSDV的亲缘关系较远。3SRBSDV mp基因的初步鉴定克隆SRBSDV S9-2、S7-2和S5-2基因，构建重组表达载体pBin-S9-2、pBin-S7-2和pBin-S5-2，分别与运动缺陷型PVX载体（pPVX-GUS-BSP）共轰击本氏烟叶片。 pBin-S7-2与pPVX-GUS-BSP共轰击本氏烟（Nicotianabenthamiana）叶片，组织化学染色后直接观察，可见蓝色斑点，在显微镜下观察，发现GUS基因编码的蛋白已扩展到多个细胞。而pBin-S9-2、pBin-S5-2分别与PVX-GUS-BSP共轰击本氏烟则观察不到蓝色斑点。说明pBin-S7-2在35S启动子驱动下能够互补PVX-GUS-BSP的运动功能，因此可以初步认为SRBSDVS7-2可能编码运动蛋白。
王增辉[5]2016年在《水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）进化分析及基因表达调控研究》文中进行了进一步梳理水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的成员,可引起水稻黑条矮缩病、玉米粗缩病等。RBSDV基因组有10条双链RNA(S1-S10),共编码13种蛋白,其中S1编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),S10编码外壳蛋白(CP);S5,S7,S9是双顺反子,各编码两个蛋白。RBSDV基因组5’端有帽子结构,而3’端无poly(A)尾。利用RT-PCR方法克隆了水稻黑条矮缩病毒江苏玉米分离物的全基因组序列。RBSDV江苏玉米分离物(RBSDV-JS)基因组中最长的为4 501bp,最短的为1 801 bp。软件预测表明S5,S7,S9也含有两个开放阅读框(ORF),其余基因组片段均含有一个ORF,RBSDV-JS基因组的10条片段的大小与蛋白编码情况与GenBank中的已报道RBSDV信息基本一致。基因组序列一致性分析显示,RBSDV-JS各基因组片段与GenBank中大部分RBSDV分离物对应片段的序列一致率均在94%以上。系统进化树显示,各基因组片段呈现单独进化的特征,存在RNA重排现象。综合基因组序列一致性和系统进化树分析,表明江苏玉米分离物与湖北玉米分离物和河北小麦分离物的整体亲缘关系较近,而与安徽水稻分离物(AH-MX8)的整体亲缘关系最远。RNA重组分析显示,RBSDV基因组不同片段的进化中RNA重组的作用不同:S1、S2和S4中未发现RNA重组;S3、S5、S6、S8和S10中存在低频率重组;S7和S9中存在较高频率重组,其中S7中尤为显着。RBSDV的10条双链RNA末端存在保守的序列,5’末端为5-AAGTTTTT,3’末端为CAGCTA(G)T(C/A)T(C)GTC-3;另外在保守序列内还存在7-11个反向碱基互补。为研究这些元件对翻译的调控作用,将RBSDV基因组的S3和S10的5’非编码区(5’UTR)和3’非编码区(3’UTR)分别插入到萤火虫荧光素酶(Fluc)的上下游,通过测定Fluc读数分析不同片段对翻译的调控。以此载体为基础,同时构建一系列突变体,深入分析RBSDV的5’UTR和3’UTR对翻译的调控作用。研究表明:(1)S3,S10的5’UTR对Fluc的翻译起正调控作用;其中将S3的5’UTR的1-4位,9-10位,11-12位或9-12位碱基突变,均明显降低Fluc读数;而S10的5’UTR的1-4位,9-12位或15-18位突变,也明显降低Fluc读数,表明S3和S10的5’UTR的细微突变均明显影响其对翻译的正调控作用;反式竞争实验初步表明5’UTR可能通过结合核糖体亚基或翻译起始因子起作用,属于一类结构简单的核糖体内部起始位点(IRES);(2)在5’UTR存在的情况下,3’UTR可抑制5’UTR的正调控作用;突变实验表明这种抑制来自于5’和3’末端反向碱基互补。为构建RBSDVRdRp介导的体外复制体系,构建MBP融合型原核表达载体。分别表达完整的RdRp、RdRp N端和C端多肽。经IPTG诱导,RdRp N端和C端多肽可获得表达,而完整的RdRp无法表达。下一步将利用亲和层析法纯化有活性的RdRp N端和C端多肽,进而建立RBSDV RdRp介导的体外复制体系。
朱俊子[6]2012年在《南方水稻黑条矮缩病毒湖南分离物全基因组及分子检测》文中进行了进一步梳理水稻南方黑条矮缩病首次在广东省阳江市阳西县发现,随后在我国大面积爆发,造成严重的经济损失。水稻南方黑条矮缩病在湖南省于2002年在汉寿县首见,在2009年至2010年间,该病在湖南省内大规模爆发,给我省造成了巨大的经济损失。目前只测定了南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)海南分离物和广东分离物的全基因组序列,而对于湖南分离物研究还是空白。本研究试图测定出SRBSDV湖南分离物的全基因组序列,并将其进行生物信息学分析；并对SRBSDV检测方法进行改进,并应用于水稻南方黑条矮缩病症状以及SRBSDV的寄主研究方面,主要研究结果如下：1)已测定SRBSDV湖南株系的全基因组序列,通过生物信息学分析得知,该病毒具有斐济病毒属的典型特征,与SRBSDV海南分离物和广东分离物的差异不大。2)研究发现SRBSDV SP6蛋白有亮氨酸拉链结构。并对SRBSDV S6,S10的氨基酸序列进行了糖基化位点、磷酸化位点及B细胞抗原表位的预测,对研究这些蛋白的表达后的蛋白修饰有重要的参考价值。3)改变的传统的巢式RT-PCR检测SRBSDV的方法,通过对SRBSDV的S10序列设计一对新引物能够一步法RT-PCR快速检测SRBSDV。该法能够将阳性样品和非阳性样品进行准确区分,相对减少了实验步骤,缩短了检测时间,适合大规模、快速、准确的检测。4)通过症状研究表明,水稻拔节后看茎杆上白色突起物,在极个别重病株的叶背上白色突起,是水稻南方黑条矮缩病特有的症状,但高位分蘖和气生倒生根不是水稻南方黑条矮缩病特有的症状,可由其他原因引起。在确认未发生齿叶矮缩病的地区如湖南省,叶尖旋迭、叶片螺旋、叶脉扭曲、叶片上窗格状皱缩、整叶螺旋紧裹,甚至部分有锯齿状缺口等症状可以诊断水稻感染SRBSDV。5)发现SRBSDV新的自然寄主牛筋草,高梁,野燕麦,扩大了SRBSDV的自然寄主范围。
倪海平[7]2015年在《不同寄主中RBSDV基因组表达分析及RBSDV P7-1互作寄主因子筛选》文中认为水稻黑条矮缩病毒(Pice black streaked dwarf virus,RBSDV)通过灰飞虱(Laodelphax striatellus)以持久性方式传播,为水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病等的病原。RBSDV基因组由10条dsRNA组成,含有13个开放阅读框(Openreading frame,ORF)。RBSDV可侵染水稻、玉米和小麦等植物引起矮缩、叶色深绿等症状。目前,RBSDV在不同植物寄主中的表达是否存在差异以及RBSDV在植物寄主与介体昆虫中的表达是否存在差异均不清楚。本研究利用quantitative real-time PCR(qRT-PCR)技术分析了 RBSDV基因组编码的13个基因在水稻、玉米、小麦和介体灰飞虱中的表达。结果显示,在水稻、玉米和小麦中P7-1和P10基因相对表达量较高,而P7-2和P8基因相对表达量则较低;在灰飞虱中P7-1相对表达量最高,P8基因相对表达量则最低,表明RBSDV在植物和介体昆虫中的表达模式具有相似性。P7-1在植物和介体灰飞虱中的表达量均较高,可作为病毒检测的靶基因。P5-1、P6和P9-1为RBSDV病毒基质组分,其在不同寄主中的表达量不同,病毒有可能通过调整病毒复制相关的病毒基质基因的表达而在不同寄主体内复制。RBSDV侵染水稻后致使其内源激素ABA含量升高,且对8 d～24 d的RBSDV基因组实时表达分析表明,P7-1在侵染后8 d～24 d均为较高表达量,在侵染8 d时基因表达量显着高于其他病毒基因的表达。P7-1在不同寄主中的高表达水平表明其在RBSDV与寄主的相互作用中起着重要作用,而那些在不同寄主中的差异表达的病毒基因可能参与病毒与寄主的特异性互作。已有研究表明RBSDV P7-1定位于植物的胞间连丝,在植物和介体昆虫中可形成管状结构,可能参与病毒的细胞间运动。P7-1还是一个致病因子,在拟南芥中过量表达P7-1蛋白导致植物不育。此外,我们对病毒在不同寄主中的表达量分析表明,P7-1在植物和介体昆虫中的表达量均很高。为分析RBSDV P7-1与灰飞虱的互作机制,本研究以P7-1为诱饵筛选了灰飞虱cDNA文库。首先通过RT-PCR扩增获取RBSDV P7-1基因序列,然后构建酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-P7-1,通过顺序转化方法筛选灰飞虱cDNA酵母文库,筛选获得阳性克隆的cDNA插入片段大小通过PCR进行分析,将PCR产物大小大于500 bp的质粒转化大肠杆菌后进行测序,序列在GenBank数据库中进行Blast比对分析。测序结果分析发现,筛到的阳性克隆分别编码15种不同的互作蛋白,包括ATP酶B亚基、40 S核糖体蛋白、烯醇化酶、羧酸酯酶和蛋白磷酸酶等。研究结果为进一步分析病毒与介体互作机制奠定了基础。为分析P7-1与植物的互作关系,本研究构建了水稻cDNA文库,并以RBSDV P7-1为诱饵筛选了水稻中的互作因子。水稻cDNA文库的构建以日本晴(Nipponbare)为材料,通过同源重组技术制备叁框型cDNA入门文库,再通过gateway技术将入门文库转移到杂交载体pGADT7-DEST上,构建了水稻酵母双杂交cDNA文库。检测结果表明,文库容量为1.3×107cfu,扩增文库滴度为4.34×109cfu/mL,重组率为大于95%,cDNA插入片段平均长度大于1kb,均达到标准cDNA文库的要求。以P7-1蛋白为诱饵筛选水稻cDNA文库,获得28个阳性克隆。经序列分析后,共获得11种在酵母中与P7-1互作的水稻因子,包括半胱氨酸蛋白酶合成前体、超氧化物歧化酶、蛋白酶抑制子、Myb转录因子、转录因子IIH亚基和过氧化氢酶等。研究结果为病毒与植物互作机制奠定了基础。
张恒木[8]2001年在《水稻黑条矮缩病毒分子生物学》文中进行了进一步梳理以浙江省的水稻黑条矮缩病、河北省的小麦绿矮病和湖北省的玉米粗缩病的病毒分离物为材料，对我国3个病毒分离物进行了系列比较研究。3个病毒分离物粒子大小形态相似，且在血清学上密切相关；叁者的介体、寄主相同，并引起相同的症状。提纯3个病毒分离物的基因组片段，凝胶电泳显示它们相应的基因组片段之间大小极其相似，推测3个病毒分离物可能是同一种病毒。然后根据水稻黑条矮缩病毒（rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）日本分离物的S10设计一对引物，利用RT-PCR技术，以3个中国分离物基因组片段S10为模板，均特异扩增到预期大小的片段。克隆3个中国分离物基因组片段S10并测定其全序列，比较分析发现：3个中国分离物基因组片段S10相应部分之间的核苷酸同源性为97.9％～98.9％，和日本RBSDV分离物基因组片段S10的相应部分核苷酸同源性为92.8％～93.1％，和意大利的玉米粗缩病毒（maize roughdwarf virus，MRDV）基因组片段S10相应部分的核苷酸同源性分别为87.6％～88.3％，因此，3个中国分离物都应该是RBSDV，而不是MRDV；也就是说中国不同地区发生的水稻黑条矮缩病、玉米粗缩病和小麦绿矮病都是由RBSDV引起的。 紧接着在克隆基因组片段S10中间部分序列的基础上，采取了一种基于RT-PCR技术的简便方法克隆了河北分离物基因组片段S7～S10、浙江分离物的S7～S10以及湖北分离物的S9～S10，并测定了它们的全序列，EMBL/DDBJ/GenBank数据库的登录号分别为AJ297427（RBSDV-Zj S7）、AJ297431（RBSDV-Zj S8）、AJ297430（RBSDV-Zj S9）、AJ297433（RBSDV-Zj S10）、AJ297428（RBSDV-Heb S7）、AJ297432（RBSDV-Heb S8）、AJ297429（RBSDV-Heb S9）、AJ297434（RBSDV-Heb S10）、AJ291706（RBSDV-HubS9）、AJ291707（RBSDV-Hub S10）。3个中国RBSDV之间的同源性最高（核苷酸同源性94.0％～99.0％，氨基酸同源性96.3％～100％），与RBSDV-Jap的同源性次之（核苷酸同源性90.0％～94.9％，氨基酸同源性91.1％～98.6％），与意大利MRDV的同源性较低（核苷酸同源性85.1％～88.1％，氨基酸同源性85.5％～94.3％）。进一步明确了在中国发生的小麦绿矮病、玉米粗缩病、水稻黑 浙江大学博士论文条矮缩病都是由RBSDV引起的。序列比较发现各个RBSDV分离物及意大利＊p V之间的核皆酸变异主要是同类碱基的转换，即OA或CT：而且大多数变异发生在密码子的第叁位碱基上，不引起蛋白质水平上的变化。在氨基酸水平上，也多是同类氨基酸的替代，仅有RBSDV·Heb S7 ORFI的。161处存在一个＊缺失。3个中国分离物的S7－S10的GC含量、编码区和非编码区的长度、末端保守序列。基因组片段特异性倒转重复序列等基因组组织结构上与RB＊＊（挪、意大利＊RD V基本一致；进一步以幻－810编码的相应蛋白质作进化树分析表明 A4mV和 RBSDV应该属于同一种病毒，而且几种 nSDV分离物和意大利MRDV所在的组中，可形成3簇，其中RBSDV中国分离物、RB SDVJap和M ppV各形成一簇，暗示了h SDV中国分离物、g sDV刁叩。MapV虽然有着共同的起源，但在后来的进化中可能是相互独立进行的。 然后以浙江省水稻黑条矮缩病毒分离物为材料在克隆 S7术 的基础上，又探索了一套简单有效的研究水稻黑条矮缩病毒未知的基因组片段的方法，首次克隆了sSDV基因组片段引－S6，并测定了全序列。这是国际上首次报道的侵染植物的斐济病毒（Fjiviruses）全基因组序列。结果表明：RBSDV基因组共29 141血组成，是至今所报道的呼肠孤病毒科中最大的基因组，至少含有13个开放阅读框bpen reading frame，O肪人序列分析表明基因组片段S！长4501nt，仅一个开放阅读框，编码的蛋白质具有KNA聚合酶的特征性结构域，暗示了它是RBSDV核心粒于的一种次要蛋白，即 RNA依赖性 NA聚合酶（NAdepende川 NA polymerase，Rd即），与其它呼肠孤病毒的 Rd帅相比，尽管同源性很低，但在 RdRp的几个保守区域则是非常保守的；基因组片段 SZ和 S3编码的蛋白分别与FDV（竹广砌e。evipw人NL RVRV（M…皿。m7呷。。。v汀us）的 S3或 S4编码的蛋白同源；基因组片段 S4和 NLRV SZ同源；基因组片段引－S4编码的蛋白还和其它的呼肠孤病毒的相应蛋白享有较低的同源性；而 SS和 S6编码的蛋白尽管与NLRV的SS和 S6编码的蛋白大小比较接近，但检测不到同源性，与EMBL／DDBJ用enBank数据库中的其它病毒基因也无显着的同源性。与已知的NLRV基因组相比，推测至少RBSDV S7和SS的第二个Ony编码的蛋白可能与病毒在水稻中的增殖功能有关。
章松柏[9]2013年在《南方水稻黑条矮缩病的监测及其病原病毒Pns6与寄主水稻的互作》文中研究表明水稻（Oryza sativa）是我国的主要粮食作物，病毒病一直是影响我国粮食稳定生产的一个重要问题。近十年来，多种水稻病毒病相继爆发流行，给水稻生产造成了巨大的经济损失，其中由一种新的植物呼肠孤病毒---南方水稻黑条矮缩病毒（Southern Rice black streaked dwarf virus，SRBSDV）引起的南方水稻黑条矮缩病尤为重要。国内外学者对这种新病毒的生物学和分子生物学进行了许多研究，明确了南方水稻黑条矮缩病的地理分布、症状、病原性质、传播途径、品种抗性等生物学特性，并解析了病毒的基因组结构和少数编码蛋白的功能，但是对于病毒在寄主组织的分布和动态变化、多数编码蛋白的功能、病毒的致病机制、寄主抗感病作用机制等仍不清楚。因此，保持对水稻病毒病的监测，了解病毒在寄主体内的分布和动态变化，以及研究病毒与寄主间的互作关系，对于病毒病的防控以及阐明病毒的致病机制等方面具有重要的意义。首先，于2009-2012年间，在湖北、福建、江西、湖南、海南等省进行了水稻病毒病田间流行调查，并承担了这些省份水稻病毒病的诊断和检测任务，在此基础上，分析了水稻病毒病的种类、分布和流行特点。结果如下：首次报道了南方水稻黑条矮缩病毒在湖北水稻和玉米上的发生，以及验证了水稻条纹病毒在湖北水稻产区的存在；福建水稻病毒的种类较多，有SRBSDV、RBSDV(Rice blackstreaked dwarf virus)、RSV(Rice stripe virus)、RRSV(Rice ragged stunt virus)、RDV(Rice dwarf virus)、RGSV(Rice grassy stunt virus)，国内流行的水稻病毒病在福建均有分布；湖南和江西两省是近几年我国水稻病毒病发生的重灾区，病原以SRBSDV为主，RRSV次之；海南省是我国南方水稻黑条矮缩病和水稻锯齿叶矮缩病的重要初侵染来源地。其次，测定了SRBSDV湖北分离物的全基因组序列，并以此序列为基础扩增了病毒13个基因的全长，在本氏烟细胞中分别表达这些基因，观察所表达蛋白的亚细胞定位。结果显示：SRBSDV湖北分离物全长29122bp，基因组核酸S10-S1的登录号分别为HM585270-HM585879；P1、P4、Pns52、P91这4个蛋白主要定位于细胞质，在细胞质中形成聚集体，Pns52、Pns91能形成较大颗粒状聚集体，而P1、P4则形成点状的聚集体；P2、P8、P3、P10这4个蛋白的定位相似，即可定位于细胞核，也可以定位于细胞质，在细胞质中都能够形成一些点状聚集体；P51、Pns6、Pns71、Pns72和Pns92定位相似，分散于整个细胞，定位于细胞质中或膜上，沿细胞骨架等组分形成丝网状结构，Pns6和P51在细胞质中还能够形成颗粒状的聚集体。再次，通过电镜观察、RT-PCR和实时定量PCR技术研究了病毒在水稻组织中的分布和动态变化以及种子各组分的带毒情况。结果显示：SRBSDV只存在于韧皮部细胞中，是一个韧皮部组织限制的病毒；不同生育期的病株种子各组分都可以带毒，成熟种子虽可以携带SRBSDV，但是不能够经过种子传播；在水稻幼苗接种病毒后的30天内，根组织的病毒含量一直大于地上部分组织，病毒含量在12天或14天内增长比较缓慢，26d左右时可达到比较明显的水平；幼苗期根组织内的病毒含量远大于地上部分的叶片和叶鞘，而分蘖期根、叶、叶鞘、茎中的病毒含量差别不大，至扬花灌浆期后茎中的病毒含量远大于其它部位，进一步说明病毒在不同生育期、不同组织中的含量是不同的。最后，以SRBSDV Pns6为诱饵，利用酵母双杂交系统筛选水稻cDNA文库，钓取了24个可能与之互作的水稻蛋白；从中选取8个蛋白，经过RT-PCR获得了其完整阅读框，并将它们重组到酵母载体和BiFC植物表达载体上，通过酵母菌回复互作验证和BiFC体系的荧光互补验证，8个水稻蛋白中有5个能够与Pns6互作，这5个水稻蛋白是40S ribosomal protein S9-2、ubiquitin-conjugating enzyme、AP2domain containing protein、zinc finger protein、eukaryotic translation elongationfactor1A。在此基础上，进一步研究了OseEF1A(eukaryotic translation elongationfactor1A from Oryza sativa)与SRBSDV Pns6互作的意义以及OseEF1A与水稻病毒互作的普遍性，取得了如下结果：（1）SRBSDV Pns6除了与水稻eEF1A互作外，还与自身的基质蛋白Pns91互作，共定位实验表明Pns6可能招募Pns91和OseEF1A形成复合体，从而在病毒基因组复制和增殖中起某种作用；（2）RRSV的Pns10和Pns6都能够与OseEF1A在酵母中互作以及在本氏烟细胞中共定位，说明和SRBSDV一样，RRSV能够利用OseEF1A为病毒基因组复制和增殖服务；（3）除上述两种病毒外，OseEF1A还能够与RGDV的Pns11，RSV的NS3，RGSV的NS1、NS3和PC3等病毒蛋白在酵母中互作，并且还能够与作为DNA病毒的双生病毒相关蛋白在酵母中互作，从而证明了植物病毒利用eEF1A的普遍性。
王贞超[10]2015年在《南方水稻黑条矮缩病毒基因序列特征及基质蛋白与病毒防控药剂相互作用研究》文中进行了进一步梳理南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)第二组一个新成员。南方水稻黑条矮缩病毒引起的新水稻矮缩病近年在越南北部和我国南方各省爆发,给我国水稻生产带来严重损失。寻找用于防控SRBSDV药剂筛选的候选靶标,建立基于SRBSDV靶标蛋白的SRBSDV防控药剂筛选模型,筛选出具有更高活性的抗SRBSDV小分子化合物可为防治SRBSDV提供新的技术措施。本研究首先采用荧光定量PCR方法,对南方水稻黑条矮缩病毒的13个基因在水稻寄主中的丰度趋势进行考察,了解SRBSDV的基因组组成。选取表达量较高的S9、S8以及S10叁个基因为候选靶标,利用生物信息学研究了不同分离物基因组序列性质,最终确定丰度最高且保守性最强的SRBSDV-P9-1基质蛋白为研究靶标。结合生物信息学分析P9-1蛋白的氨基酸序列,发现了其氮端保守区、碳端保守区和131~160 aa的高变区。继而纯化获得了野生型(WT-His-P9-1)、碳端截短23个氨基酸(TR-ΔC23-His-P9-1),氮端截短6个氨基酸(TR-ΔN6-His-P9-1)以及138位定点突变型(MU-138-His-P9-1)的SRBSDV-P9-1靶标蛋白。采用荧光滴定光谱法(fluorescence titration,FT)和微量热泳动技术(microscale thermophoresis,MST),在离体条件下探究了毒氟磷(dufulin,DFL)与四种蛋白的相互作用,发现DFL与P9-1的结合常数为微摩尔级。同时,进行DFL抑制SRBSDV的作用机制研究,即通过与SRBSDV-P9-1的碳端23个氨基酸结合,抑制病毒基质的形成。建立了基于SRBSDV-P9-1靶标蛋白来筛选新型病毒防控药剂的作用模型。最后,基于建立的SRBSDV-P9-1靶标蛋白作用模型,进行DFL系列衍生物与蛋白的相互作用研究,筛选出结合作用更强的小分子化合物。具体结论如下:(1)SRBSDV基因在水稻体内表达量分析选取不同生长期、不同地区、不同品种及感染病毒状况的SRBSDV水稻作为研究对象,采用荧光定量PCR法,对SRBSDV的13个基因片段的表达量进行分析。研究结果表明:S9-1、S7-1基因呈现高表达量特性及S6基因呈现最低表达量特性,均不受寄主生长期、地域、品种及病毒侵染状态的影响;S8、S2基因呈现稍高的表达量;而其他基因片段如,S1、S3、S4、S5-1、S5-2、S7-2、S9-2及S10则呈现不规律的表达趋势。(2)SRBSDV重要功能基因的生物信息学分析利用分子生物学技术,结合生物信息学分析基因组核苷酸及氨基酸序列特征,明确不同分离物核苷酸序列的分类地位。对病毒基质蛋白P9-1、外壳蛋白P10和核心蛋白P8进行理化性质和功能预测等分析,确认各基因组的核苷酸全长、GC含量、亲水区及疏水区、编码蛋白的信号肽、二级及叁级结构等特征;利用Motif、Blast比对,对S8、S9、S10序列进行同源性分析;结合SNP对S8、S9、S10的核苷酸序列进行突变分析,并结合建立的系统进化树,进一步探索病毒的遗传进化趋势。(3)SRBSDV-P9-1基质蛋白的保守结构域及高变结构域分析选择S9基因组为研究对象,利用Gene Doc软件分析SRBSDV及水稻黑条矮缩病毒(rice black streaked dwarf virus,RBSDV)P9-1序列的保守结构域及高变结构域,研究表明:SRBSDV-P9-1与RBSDV-P9-1序列的碳端和氮端具有高度的保守性;同时SRBSDV-P9-1与RBSDV-P9-1序列之间存在一个高变区,即131~160 aa。(4)野生型和突变型SRBSDV-P9-1基质蛋白的表达与纯化基于SRBSDV-P9-1生物信息学研究结果,利用E.coli BL21(DE3)RIL表达菌株,成功表达和纯化了野生型(WT-His-P9-1)及叁种突变型基质蛋白(TR-ΔC23-His-P9-1、TR-ΔN6-His-P9-1以及MU-138-His-P9-1)。(5)DFL及宁南霉素(ningnanmycin,NNM)与P9-1基质蛋白相互作用研究利用FT和MST技术研究了小分子化合物DFL、NNM与P9-1基质蛋白的相互作用。研究结果表明:DFL与WT-His-P9-1的结合力为1×105.061 M-1(FT)、3.26+/-0.46μM(MST),NNM与WT-His-P9-1的结合力为1×104.244 M-1(FT)、48.40+/-6.04μM(MST),即DFL与P9-1基质蛋白的结合力明显强于NNM。为了探究DFL与P9-1的结合位点,利用FT和MST技术研究了DFL与TR-ΔC23-His-P9-1、TR-ΔN6-His-P9-1和MU-138-His-P9-1叁种突变蛋白之间的结合作用力。研究结果表明:碳端23个氨基酸对于DFL与基质蛋白的结合起到关键作用。在此基础上,构建了基于WT-His-P9-1、TR-ΔC23-His-P9-1蛋白的防控SRBSDV活性小分子化合物作用模型。(6)基于SRBSDV-P9-1基质蛋白靶标模型的DFL衍生物的筛选基于构建的靶标蛋白作用模型,采用FT和MST技术手段,考察了DFL衍生物与WT-His-P9-1基质蛋白的结合作用力。研究结果表明,芳杂环噻吩取代的化合物及苯环上没有取代基、苯环引入-F、-Cl、-NO2、-CF3等六个DFL衍生物与WT-His-P9-1靶标蛋白的结合均为强结合,且都具有微摩尔级的结合能力;碳端23个氨基酸依然影响了小分子化合物与P9-1基质蛋白的结合。
参考文献：
[1]. 水稻黑条矮缩病毒基因组片段S3和S9编码蛋白的表达分析[D]. 孙丽英. 中国农业大学. 2003
[2]. 南方水稻黑条矮缩病毒和水稻黑条矮缩病毒RNA沉默抑制子鉴定分析[D]. 卢嫣红. 南京农业大学. 2011
[3]. 南方水稻黑条矮缩病毒云南分离物基因组特征及其编码蛋白的功能预测[D]. 胡秀弟. 云南农业大学. 2012
[4]. RBSDV和SRBSDV安徽分离物全基因组特征及SRBSDV mp基因的功能分析[D]. 李祥宇. 安徽农业大学. 2013
[5]. 水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）进化分析及基因表达调控研究[D]. 王增辉. 山东农业大学. 2016
[6]. 南方水稻黑条矮缩病毒湖南分离物全基因组及分子检测[D]. 朱俊子. 湖南农业大学. 2012
[7]. 不同寄主中RBSDV基因组表达分析及RBSDV P7-1互作寄主因子筛选[D]. 倪海平. 南京农业大学. 2015
[8]. 水稻黑条矮缩病毒分子生物学[D]. 张恒木. 浙江大学. 2001
[9]. 南方水稻黑条矮缩病的监测及其病原病毒Pns6与寄主水稻的互作[D]. 章松柏. 福建农林大学. 2013
[10]. 南方水稻黑条矮缩病毒基因序列特征及基质蛋白与病毒防控药剂相互作用研究[D]. 王贞超. 贵州大学. 2015
标签：植物保护论文; 基因组论文; 水稻论文; 基因合成论文; 同源重组论文; 水稻品种论文; 编码序列论文; 序列模式论文; 同源基因论文; 科学论文; 玉米论文; 科普论文;