黄 靓 向 琼 王 芳 朱梦霞（南华大学外总教研室 湖南 衡阳 ４２１００１）
【中图分类号】Ｒ１５５．３【文献标识码】Ａ【文章编号】１６７２－３７８３（２０１５）０７－０５２５－０１【摘要】目的观察Ｎｅｕ－ｐ１１对阿霉素诱导的原代乳鼠心肌细胞的保护作用及其量效关系。方法采用体外培养乳鼠心肌细胞，用阿霉素制备心肌细胞损伤模型，实验设正常对照组、阿霉素组及Ｎｅｕ．ｐ１１组。分别检测心肌组织存活率，心肌细胞中超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、丙二醛（ＭＤＡ）及谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ．Ｐｘ）浓度。结果与阿霉素心肌细胞损伤组比较，Ｎｅｕ－ｐ１１组心肌细胞存活率提高，ＭＤＡ释放量显著减少（Ｐ ＜０．０１），ＳＯＤ、ＧＳＨ－Ｐｘ含量明显增高（Ｐ ＜０．０１）。
结论Ｎｅｕ－ｐ１１对阿霉素诱导心肌细胞损伤有保护作用，可能与其抗氧化、抗自由基作用有关。
【关键词】Ｎｅｕ．ｐ１１；阿霉素；大鼠；氧化损伤
蒽环类广谱抗肿瘤药物阿霉素，因其高效广谱的特点被广泛应用于多种恶性肿瘤的临床治疗，由于阿霉素与心肌组织亲和力较强，长期使用可导致剂量依赖性心肌毒性，严重限制了该药的临床应用。探讨阿霉素心肌损伤的发病机制，寻找有效的保护措施，对于改善阿霉素心脏毒性，增加阿霉素的临床应用安全性，提高肿瘤患者的预后具有重要临床意义。Ｎｅｕ．Ｐ１１是一种新型的褪黑素激动剂，与褪黑素受体ＭＴ１／ＭＴ２具有高亲和力。最近研究表明Ｎｅｕ．Ｐ１１能够发挥类似褪黑素的作用，具有强有力的抗氧化作用。Ｎｅｕ．Ｐ１１可以清除包括羟自由基、超氧阴离子在内的多数氧自由基，并从多个环节防止自由基损伤。本文旨在观察Ｎｅｕ．Ｐ１１对阿霉素诱导的原代乳鼠心肌细胞的保护作用及其机制。
１材料与方法１．１实验动物新生ＳＤ大鼠（１．３ｄ）３０只，雌雄不限，由南华大学实验动物学部提供。１．２药物及试剂Ｎｅｕ．Ｐ１１由ＮｅｕｒｉｍＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＬｔｄ．（Ｔｅｌ．Ａｖｉｖ，Ｉｓｒａｅｌ）提供，注射用盐酸阿霉素由浙江海正药业股份有限公司提供（批号：１３０５０９．２００３０１），ＤＭＥＭ培养基，胰蛋白酶，ＭＴＴ均购自ＳＩＧＭＡ公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司，ＬＤＨ、ＭＤＡ、ＳＯＤ及ＧＳＨ．Ｐｘ试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。１．３大鼠心肌细胞原代培养心前区碘伏消毒，取出心脏，迅速用无菌的Ｄ．Ｈａｎｋｓ缓冲液冲洗３次，去除心房及心底大血管，用眼科剪将其剪成１ｍｍ３的组织块，采用０．０８％胰蛋白酶反复消化分离细胞，收集除第１次外的细胞悬液，用等量的ＤＭＥＭ培养基终止消化，１０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ，弃上清，用含１０％胎牛血清及青霉素和链霉素（终浓度均为１×１０５Ｕ· Ｌ．１）的高糖ＤＭＥＭ培养液，轻柔地吹打成单细胞悬液，转移到细胞培养瓶中，置于３７℃、５％ＣＯ２、９１％湿度环境细胞培养箱中培养，３６～４８ｈ换液１次，培养７２ｈ后进行实验。１．４实验分组心肌细胞原代培养７２ｈ达融合状态后，去除原培养液，随机分为３组：正常对照组；阿霉素组（１．７２μｍｏｌ／Ｌ）；Ｎｅｕ．Ｐ１１组（阿霉素１．７２μｍｏｌ／Ｌ ＋Ｎｅｕ．Ｐ１１１０ｎｍｏｌ／Ｌ）。１．５监测指标１．５．１ＭＴＴ法检测心肌细胞存活率：各组心肌细胞接种于９６孔板，每孔１００μｌ，每组１２个孔，经上述实验分组处理后每孔加入５ｍｇ／ｍｌ的ＭＴＴ溶液２０μｌ，３７℃继续孵育４ｈ；弃上清，每孔加入１００μｌＦｏｒｍａｚａｎ溶解液，振荡１０ｍｉｎ，使结晶物完全溶解，最后测定５７０ｎｍ波长吸光度值。存活率／％ ＝（实验组Ａ值．空白对照Ａ值）／（对照组Ａ．空白对照Ａ值）×１００％ 。
１．５．２ＳＯＤ活性测定采用黄嘌呤氧化酶法，ＭＤＡ含量测定采用硫代巴比妥酸法，ＧＳＨ．Ｐｘ活性测定采用二硫代二硝基苯甲酸比色法，具体操作方法按试剂盒说明书进行。１．６统计分析所有资料均用ＳＰＳＳ１３．０软件处理，计量资料以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，采用ｔ检验，记数资料用χ２检验，Ｐ ＜０．０５为差异具有统计学意义。２结果２．１Ｎｅｕ．ｐ１１对心肌细胞存活率的影响与正常对照组比较，阿霉素组心肌细胞存活率明显下降（Ｐ＜０．０１），与阿霉素组比较，Ｎｅｕ．ｐ１１组心肌细胞存活率显著升高（Ｐ＜０．０１），结果见图１。
注：与对照组比较，Ｐ＜０．０１；与阿霉素组比较，Ｐ＜０．０１３讨论阿霉素所致的心脏毒性反应，临床上表现为：急性早期出现各种心律失常，晚期出现剂量相关性充血性心力衰竭。其慢性心肌损伤可以在停用阿霉素后，继续进展，甚至导致死亡，死亡率约为２６％ ～５０％［１］。研究证实，阿霉素所致心脏毒性的主要机制与产生的过量氧自由基有关。作用于心肌细胞膜及各种细胞器膜上的磷脂中的多价不饱和脂肪酸形成脂质自由基，引发脂质过氧化反应，使膜的结构发生改变，最终导致膜的完整性遭到破坏，膜的流动性降低，通透性增加，容量调节功能及离子转运功能障碍，并进一步触发心肌细胞的凋亡。Ｎｅｕ．ｐ１１作为一种人工合成的、高亲和力的新型褪黑激素受体激动剂，以往的研究多局限于其参与调节睡眠、抗抑郁和抗焦虑等作用。近年研究证实Ｎｅｕ．ｐ１１与褪黑激素一样具有强大的抗氧化作用，在心肌缺血再灌注损伤大鼠模型中发现，Ｎｅｕ．ｐ１１能降低大鼠缺血在关注损伤诱导的心律失常发生率，降低室颤发生率，减少心肌梗死面积，提高血清超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性，降低丙二醛（ＭＤＡ）、乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）、磷酸肌酸激酶（ＣＫ）含量，表明Ｎｅｕ．ｐ１１可显著促进缺血后左心室功能的恢复，减轻心肌缺血再灌注损伤。ＳＯＤ是生物体内清除自由基的首要物质，它可以催化超氧自由基转化为过氧化氢和分子氧，在抵御氧自由基导致的细胞损伤中起关键作用，其水平高低可反映出机体清除氧自由基的能力［２］。
ＧＳＨ．Ｐｘ是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，为生物体中清除过氧化氢和其他有机过氧化物的脱毒酶，它能通过抗氧化作用保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。ＭＤＡ是脂质过氧化物产物种类之一，其含量高低能够体现脂质过氧化程度可用于评价氧化损伤程度［３］。在本实验中，阿霉素损伤组与正常对照组相比ＳＯＤ、ＧＳＨ．Ｐｘ活性明显降低，ＭＤＡ水平显著升高，说明脂质过氧化较剧烈，细胞受到严重损伤，而Ｎｅｕ．ｐ１１组ＳＯＤ、ＧＳＨ．Ｐｘ活性均较阿霉素组明显增高， ＭＤＡ含量低于阿霉素组，提示Ｎｅｕ．ｐ１１可降低心肌细胞脂质过氧化反应，提高心肌细胞清除超氧阴离子的能力，从而发挥抗自由基损伤的作用。但Ｎｅｕ．ｐ１１抗阿霉素心肌损伤的作用机理较为复杂，尚不十分清楚，还有待后续深入研究。
基金项目：湖南省医药卫生科研计划项目（课题编号：Ｂ２０１４．０４８）参考文献［１］孙云鹏，张宇，李天书，温得中，章宏．褪黑素对阿霉素致心肌损伤保护作用的实验研究［Ｊ］．中国药物警戒，２０１１，８（７）：３８８．３９０．［２］曲震理，王国贤，吴红芳，祝春梅．川芎嗪对阿霉素所致体外心肌细胞损伤的保护作用［Ｊ］．中国组织工程研究与临床康复，２００７，１１（４３）：８６８３．８６８６．［３］曲震理．丹参酮ⅡＡ对阿霉素所致体外心肌细胞氧化损伤的保护作用［Ｊ］．现代预防医学，２０１３，４０（１３）：２５２０．２５２３．
论文作者:黄 靓 向 琼 王 芳 朱梦霞
论文发表刊物:《健康必读》2015年第7期供稿
论文发表时间:2015/8/31
标签：阿霉素论文; 心肌论文; 细胞论文; 损伤论文; 作用论文; 存活率论文; 自由基论文; 《健康必读》2015年第7期供稿论文;