（1.如皋市人民医院 江苏 如皋 226500；2.南通大学附属肿瘤医院 江苏 南通 226361）
【摘 要】目的：探讨细胞间粘附分子-3(intercellular cell adhesion molecule ,ICAM-3)、VEGF (Vascular endothelial growth factor,VEGF)的蛋白表达水平与宫颈鳞癌放射抵抗性的相关性。方法：采用免疫组织化学S-P法检测90例中晚期宫颈鳞癌患者的癌组织中ICAM-3和VEGF的蛋白表达，所有患者均采用同步放化疗。其中25例为放疗后未控，65例为放疗后缓解。结果：ICAM-3在90例宫颈鳞癌组织中的阳性表达54例，占60.0%；VEGF呈阳性表达56例，占62.2%。ICAM-3在宫颈鳞癌放疗后未控组中的阳性表达率为84.0%，放疗后缓解组中的阳性表达率为50.8%，两组间差异有统计学意义（P=0.008)；VEGF在宫颈鳞癌放疗后未控组中的阳性表达率为80.0%，放疗后缓解组中的阳性表达率为55.4%，两组间差异有统计学意义（P=0.031)。ICAM-3和VEGF高表达均与肿瘤病理分级及淋巴结转移显著相关，而与临床分期无明显相关性。结论：ICAM-3、VEGF蛋白高表达与宫颈鳞癌放射抵抗性有关，可作为预测宫颈癌放疗敏感性的指标。
【关键词】ICAM-3；VEGF；宫颈鳞癌；放射治疗；免疫组化
【中图分类号】R737 【文献标识码】A 【文章编号】1004-6194（2015）02-0090-02
Application of ICAM-3 protein expression as predictive biomarker in radioresistance of Human Cervical Squamous Cancer
【Abstract】Objective:To study the relationship between Intercellular Adhesion Molecule-3、Vascular endothelial growth factor With radioresistance of human cervical squamous cancer.Methods:S-P immunohistochemical method was performed to detect the expression of ICAM-3 and VEGF in 90 patients with advanced cervical squamous cell carcinoma,of which 25 cases were non-well treated after radiotherapy, 65 cases were well treated after radiotherapy.Results:The positive expression level of ICAM-3 and VEGF were related to clinical stage and lymph nodes metastasis;The expression level of ICAM-3 in non-well treated group was higher than that in well treated group(84.0% vs 50.8%，P=0.008).The expression level of VEGF in non-well treated group was higher than that in well treated group(80.0% vs 55.4%，P=0.031). The expression of ICAM-3 and VEGF were significantly related to lymph node metastasis and grade of differentiation,but no relation to clinicai stage.Conclusion:The expression of ICAM-3 and VEGF is related to radioresistance of cervical squamous cell carcinoma.
【Key Words】ICAM-3;VEGF;cervical squamous cell carcinoma;radiotherapy; immunohistochemistry
细胞间粘附因子-3(Intercellular Adhesion Molecule-3，ICAM-3)即CD50，属于免疫球蛋白超家族，研究证明，ICAM-3与血液系统、淋巴系统肿瘤的发生发展有关，并参与肿瘤细胞的免疫逃脱作用[1]。本课题前期研究发现【2】在宫颈鳞癌中的表达水平明显高于宫颈上皮内瘤变(CINII-III)及正常宫颈。Young等基础研究证明[3]，ICAM-3在放射抵抗的宫颈癌细胞株SiHa/R中表达水平上调，认为ICAM-3的高表达与宫颈癌细胞株放射抵抗性有关。然而，关于ICAMS与放射敏感性之间的关系知之甚少。本文采用免疫组化方法检测宫颈鳞癌放疗后未控组和缓解组中ICAM-3、VEGF的表达，探讨ICAM-3、VEGF高表达与病期及淋巴结转移的相关性，研究采用免疫组化法联合检测ICAM-3和VEGF在预测宫颈癌放射敏感性的应用价值。
1 材料和方法
1.1 一般资料
选取2010年1月至2011年12月期间在南通市肿瘤医院妇瘤科行根治性放疗后未控的存档宫颈鳞癌组织标本25例，另选同期放疗后完全缓解的宫颈鳞癌组织标本65例作为对照组。所有患者取材前均未进行放疗或化疗，且临床资料完整。患者年龄43～71岁，平均年龄52.5岁。按2009年FIGO分期标准进行临床分期，所选患者为Ⅱb期～Ⅲ期b，其中Ⅱb期42例，Ⅲ期48例。影像学提示淋巴结阳性患者35例，阴性55例。组织病理分级：Ⅰ-Ⅱ级52例，Ⅲ级38例。所有患者均给予同步放化疗。外照射采用高能X线行前后对穿野治疗：TD4500Cgy-5000cGY.其中全盆野剂量TD 3000cGy，四野（中间挡铅）剂量TD 1500-2000cGy，高剂量率腔内后装治疗4～5次， A点剂量700cGy/次。同步化疗采用顺铂周疗：30mg/m2/每周，4～6周。
1.2 疗效判断标准
根据WHO实体瘤客观疗效评定标准，结合宫颈癌放疗后病灶的变化情况，放疗结束后三个月内原发肿瘤或部分肿瘤持续存在或盆腔内出现新的病灶为放疗后未控；完成放疗后一个月复查病灶完全消退，盆腔内未出现新的病灶为放疗后缓解。
1.3 ICAM-3H和VEGF检测方法
将选取的病理科存档的宫颈癌组织标本石蜡块90例进行连续切片，每张厚度3～4um。1张进行HE染色病理确认，免疫组化标记用玻片均经防脱片处理。分别由两位病理科主任医师进行免疫组化读片，判定结果。兔抗人ICAM-3单克隆抗体购自R＆D公司，兔抗人VEGF单克隆抗体、S-P免疫组化试剂盒购自北京中杉生物技术公司。采用S-P法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法）检测。免疫标记阳性对照组为人体脾组织，阴性对照组为用PBS（磷酸盐缓冲液）替代第一抗体进行免疫标记操作。免疫组化程序严格按S-P试剂说明书进行。
1.4 检测结果分析方法
ICAM-3定位于细胞膜出现棕黄色颗粒，用半定量法分析结果，判断标准如下：按染色细胞占细胞总数的比例分为5个等级：＜10%为0；10%-25%为1；25%-50%为2；50%-75%为3；75%以上为4。根据细胞染色的强度分为4个等级：阴性为0；淡黄色为1；棕黄色为2；棕褐色为3。将染色细胞数评分与细胞染色强度评分相乘得出免疫染色评分，染色评分0分为阴性(-)，1-4分为弱阳性（+），5-8分为阳性（++），9-12分为强阳性（+++）。
VEGF免疫组化染色以细胞浆中出现棕黄色颗粒为其阳性判定标准。判断标准如下：阳性细胞数＜1%为(-)，阳性细胞数1%- 10%为（+），阳性细胞数11%- 50 %为（++），阳性细胞数〉51%为（+++）。
1.5 统计学处理
应用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析，各组间率的差异比较采用χ2检验，相关性分析用Spearman等级相关分析法，P＜0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 ICAM-3在放疗未控组和缓解组中的表达情况
ICAM-3阳性表达主要定位于癌细胞的细胞膜，阳性和阴性表达（见图1和图2）。ICAM-3在90例宫颈鳞癌组织中的阳性表达54例，占60.0%。ICAM-3在放疗后未控组25例中有21例呈阳性表达，阳性表达率为84.0%。在放疗后缓解组65例中有33例呈阳性表达，阳性表达率为50.8%，两组相比差异有统计学意义（χ2=6.98，P =0.008）。见表1。
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2.2 VEGF的表达结果
VEGF在宫颈癌组织中的表达主要定位于与肿瘤组织的细胞浆，呈弥漫性或散在分布的棕褐色颗粒，其阳性和阴性表达见图3和图4。90例宫颈癌中，VEGF呈高表达56例，占62.2%。VEGF在放疗后未控组25例中有20例呈阳性表达，阳性表达率为80.0%。在放疗后缓解组65例中有36例呈阳性表达，阳性表达率为55.4%，两组相比差异有统计学意义（χ2=4.65，P =0.031）。见表2。
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2.3 CIAM-3、VEGF表达与临床特征的相关性
90例宫颈鳞癌患者中，Ⅱb期42例，ICAM-3阳性表达21例，占50.0%，Ⅲ期患者33例，占68.7%，两组无显著差异（p=0.48）;病理分级Ⅰ-Ⅱ级52例患者中，ICAM-3高表达22例，占42.3%，明显低于病理Ⅲ级患者32例，占84.2%（p=0.003）；淋巴结阳性35例中，ICAM-3高表达30例，占85.7%，明显高于淋巴结阴性患者43.6%（p=0.003）。
VEGF高表达56例，占62.2%，其中Ⅱb期阳性表达率为57.1%，与Ⅲ期患者66.7%相比差异无显著意义（p=0.56）;病理分级Ⅰ-Ⅱ级患者ICAM-3高表达46.2%，明显低于病理分级Ⅲ级患者84.2%（p=0.015）。淋巴结阳性患者ICAM-3高表达率为80%，明显高于淋巴结阴性患者50.9%（p=0.021）。见表3。
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3 讨论
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，临床上约70%以上的宫颈癌患者需接受放射治疗。关于宫颈癌放射治疗敏感性的影响因素已逐渐受到关注。国内外许多学者研究了肿瘤放疗敏感相关因子，但迄今为止，在预测宫颈癌放射敏感性方面的研究尚不充分。
细胞间粘附分子(ICAMs) 指一类调节细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间相互结合和起粘附作用的膜表面糖蛋白，目前发现有三种：ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3。本课题前期研究发现[2]，ICAM-3在CINⅢ和宫颈癌组织中高表达，而在正常宫颈组织中低表达，提示其表达水平与宫颈癌的发生发展有关。本课题组前期采用PCR技术已证明ICAM-1的高表达与宫颈癌的放射抵抗有关【4】。有研究发现ICAM-3可与LFA-1结合通过分子结构而调节ICAM-1（CD54）/LFA-1的相互作用[5]。因此推测ICAM-3高表达与宫颈癌的放射抵抗有关。本研究采用免疫组化方法检测了90例宫颈鳞癌患者中，放疗后未控组和缓解组中ICAM-3的表达水平，结果显示ICAM-3在放疗后未控组中的表达高于缓解组，提示ICAM-3高表达与宫颈癌的放射抵抗有关。可能的机制是ICAM-3可能参与或调节VEGF的FAK信号途径,FAK已被证实会诱导抑制辐射后的细胞凋亡[6-7] ，从而引起宫颈癌放射抵抗性增加。因此临床上在治疗前通过检测ICAM-3表达水平，预测宫颈癌的放疗敏感性，进一步判断预后和指导治疗方案的制定。
Bachtiary B[8]等研究发现，宫颈癌患者放疗前VEGF水平高者，放疗后的近期肿瘤缓解率和远期疗效都相对较差。本研究结果显示，VEGF在放疗后未控组中的表达高于缓解组，差异有统计学意义（P＜0.05)，与前述研究结果一致。VEGF引起肿瘤细胞放射抵抗的机制可能是：(1)放射治疗通过激活EGFR而激活P13K/Akt通路，刺激VEGF受体高表达，进而诱导肿瘤新生血管的形成，促进肿瘤侵袭和转移【9】；（2）缺氧可上调VEGF基因的表达，引起肿瘤自身侵袭性增加和对放化疗的抗拒性增加[10]。
本研究结果提示：ICAM-1和VEGF高表达与宫颈癌的病理分级和淋巴转移有关。研究表明【11】，ICAM-3表达于血管及淋巴管内皮细胞，通过与细胞浆内酪氨酸磷酸化的小分子ß-catenin结合，调节内皮细胞的增殖和血管新生，另外ICAM-1、ICAM-3等细胞粘附因子可能作为信号传导分子调节内皮细胞之间以及内皮细胞与细胞外基质之间的粘附和去粘附，促进血管和淋巴管的增生，在肿瘤的浸润和淋巴结转移中发挥着重要作用。血管内皮生长因子（VEGF），是目前公认一种重要的促血管生成因子，研究发现【12】，VEGF通过选择性与内皮细胞上的受体结合，使细胞内的CA2+水平迅速升高，通过磷酸肌醇特异性磷酸脂酶C途径，使细胞内肌醇三磷酸水平升高，转导细胞内信号，从而使血管内皮细胞分裂增殖、促进血管生长和提高血管通透性，利于恶性肿瘤的侵袭和转移。而和临床分期无关。由于本研究选择的是适合放疗的Ⅱb-Ⅲ期宫颈鳞癌患者，结果可能不能反映所有临床分期，还需进一步进行全面分期的研究。
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*通讯作者：
何爱琴*，女，主任医师，硕士生导师,主要从事妇科肿瘤的临床工作。
论文作者:沙红兰, 何陈云,李咏, 刘蓉, 何爱琴
论文发表刊物:《中国慢性病预防与控制》2015年8月第2期供稿
论文发表时间:2016/3/18
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