张金秋[1]2015年在《猪流感病毒感染中线粒体蛋白MAVS介导的宿主天然免疫效应》文中指出猪流感是由猪流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道传染病,病毒的基因组为分节段的单股负链RNA,这一特点使病毒能通过基因突变和基因重配不断进化,从而逃避宿主的免疫压力。探究机体感染猪流感病毒后的天然免疫变化和宿主蛋白的抗病毒作用具有重要的理论意义。1.猪流感病毒感染对猪肺泡巨噬细胞天然免疫信号通路的影响从35日龄健康仔猪肺部分离肺泡巨噬细胞,以MOI=5感染H3N2猪流感病毒A/Swine/Shandong/3/2005,间接免疫荧光试验发现猪流感病毒能够在猪原代肺泡巨噬细胞中增殖。荧光定量RT-PCR方法检测结果显示,TLR-3、TLR-7、RIG-Ⅰ、MDA-5的mRNA在感染后6-24h均出现显著升高(p<0.05);IRF-7、IFN-β的mRNA在感染后8-24h显著升高(p<0.05);MyD88和MAVS mRNA在感染后8h升高,12h后又开始缓慢下降。放射性免疫方法检测上清中细胞因子的含量,其中IL-1β、TNF-α分别在感染后6h和8h出现峰值;IFN-α及IFN-β在病毒感染6-8h后显著升高,至24h时仍维持较高水平(p<0.05)。结果表明,该猪流感病毒毒株能够在猪肺泡巨噬细胞中有效增殖,且能激活TLR及RLR信号通路中相关受体及效应因子的基因与蛋白表达。2.猪流感病毒感染对上皮细胞系A549天然免疫信号通路的影响人肺癌上皮细胞系A549以MOI=5感染H3N2猪流感病毒,结果发现猪流感病毒能够在A549细胞上有效增殖,感染后48h,毒价可达106.1TCID50/mL。荧光定量RT-PCR检测结果显示,TLR-3、TLR-7、RIG-Ⅰ、MDA-5的mRNA水平在感染后6h均开始显著升高(p<0.05)。IRF-7、IFN-α及IFN-βmRNA在感染后8-24h显著升高(p<0.05)。MyD88和MAVS mRNA在8h时升高,12h后又开始缓慢下降,至24h时与对照组无显著差异(p>0.05)。Western blot分析发现RIG-Ⅰ、TLR-3、TLR-7等蛋白表达水平在病毒感染后升高,而MAVS在感染后降低。此外,双荧光素酶报告试验发现polyⅠ:C刺激或SIV感染后,能显著诱导IFN-β启动子、IRF3/7结合位点、NF-κB结合位点报告质粒的荧光素酶表达。结果表明,该猪流感病毒毒株能够在A549细胞中增殖,且能够有效激活TLR及RLR介导的天然免疫信号通路。A549细胞系可以作为研究猪流感病毒感染后宿主细胞天然免疫变化的体外细胞模型。3.MAVS通过介导IFN-Ⅰ的产生抑制猪流感病毒的增殖在pCMV-Flag-MAT-TAG-MAVS质粒的基础上构建各种MAVS截断突变质粒,通过过表达试验发现MAVS能显著激活IFN-β启动子活性,进而抑制病毒的增殖,且呈剂量依赖性。当缺失CARD结构或者跨膜区时,MAVS几乎不能诱导IFN-β启动子或NF-κB、IRF-3/7结合位点的活化,且对病毒滴度几乎无抑制效果;缺失脯氨酸富集区的突变质粒对其功能的影响不显著,但其活性低于完整的MAVS(p>0.05)。表明CARD结构或跨膜区对MAVS介导的IFN-I的产生至关重要。通过人工合成的siRNA序列抑制A549细胞的内源性MAVS表达,再次感染猪流感病毒,结果发现病毒诱导的IFN-β启动子的活化受到显著抑制,病毒滴度显著升高(p<0.05),表明MAVS对宿主细胞IFN-Ⅰ抗病毒通路的活化是必需的,提示线粒体可能在宿主的天然免疫通路中发挥重要作用。4.MAVS介导病毒引起的细胞凋亡在pCMV-Flag-MAT-TAG-MAVS质粒的基础上构建各种MAVS截断突变质粒，通过过表达试验发现MAVS能显著促进细胞凋亡,且呈剂量依赖性(p<0.05)。Western blot检测发现,在MAVS过表达细胞中,Caspase-9、Caspase-3等凋亡相关蛋白的表达水平显著升高(p<0.05)。缺失CARD结构或跨膜区时,凋亡比率显著降低(p<0.05),而缺失脯氨酸富集区对细胞凋亡的影响不显著(p>0.05)。通过特异性siRNA抑制细胞内源性MAVS的表达后,再次感染猪流感病毒,结果发现病毒感染引起的细胞凋亡比率显著下降(p<0.05),表明MAVS对猪流感病毒感染导致的细胞凋亡的发生是必不可少的。通过Transwell小室试验发现转染MAVS能引起凋亡细胞比例显著升高,而处于同样培养环境的对照转染细胞未出现细胞凋亡,表明MAVS介导的凋亡不是IFN-Ⅰ的副效应,与IFN-Ⅰ的产生是独立发挥作用的。研究提示,MAVS介导的凋亡途径在宿主抗病毒感染中可能发挥着重要的作用。5.猪流感病毒相关蛋白对MAVS介导的IFN-Ⅰ产生及凋亡的影响将猪流感病毒A/Swine/Shandong/3/2005(H3N2)的NS1、PB1-F2及NP表达质粒,分别与MAVS全长表达质粒共转染A549细胞,通过双荧光素酶报告系统研究发现NS1、PB1-F2能显著降低MAVS诱导的IFN-β启动子活性(p<0.05),且NS1抑制MAVS介导的IFN-β启动子的活性呈剂量依赖性;流式细胞术检测结果显示NS1蛋白能显著拮抗MAVS介导的凋亡的产生,并呈显著的剂量依赖性(p<0.05),而PB1-F2、NP蛋白对MAVS介导的凋亡的抑制作用不显著(p>0.05);MAVS过表达能显著抑制病毒的增殖,共表达NS1质粒后,病毒滴度显著升高(p<0.05);共表达PB1-F2、NP质粒也能引起病毒滴度的升高,但差异不显著(p>0.05)。研究结果表明,NS1能够拮抗MAVS介导的IFN-Ⅰ产生及细胞凋亡,为深入认识猪流感病毒逃避宿主细胞天然免疫监视的机制提供了新的理论依据。综上可见,猪流感病毒感染能有效激活宿主细胞TLR及RLR介导的天然免疫信号通路,且RLR通路中的关键接头蛋白MAVS在IFN-Ⅰ产生及细胞凋亡中发挥重要作用。同时,猪流感病毒的NS1蛋白能显著拮抗MAVS介导的IFN-Ⅰ及凋亡的产生。这为深入研究宿主识别和清除病毒感染及病毒逃避宿主免疫系统的分子机制提供了新的思路。
刘晓静[2]2007年在《三种中草药抑制甲3型流感病毒诱导细胞凋亡的研究》文中研究说明目的:采用双黄连的组成药:金银花、黄芩和连翘的提取液为实验药物,并以利巴韦林为阳性对照药物,进行体外抗病毒实验。测试上述药物对甲3型(H3N2亚型)流感病毒诱导狗肾传代细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)凋亡的影响。方法:各种中草药采用传统的水煮浸法分别提取使其浓缩成0.5g/ml药液为原液。测定药物对MDCK细胞的毒性作用,并确定药物的毒性限量。以其下一倍比稀释度为试验浓度进行抗病毒试验。以细胞病变(cytopathic effect,CPE)、姬姆萨染色在光镜下观察细胞形态学变化、Annexin V和PI双染用流式细胞仪测定(flow cytometry,FCM)细胞凋亡率,评价药物对甲3型流感病毒诱导MDCK细胞凋亡的影响。结果:1、各药物对MDCK细胞的无毒界限分别为:金银花3.90mg/ml、黄芩15.62mg/ml、连翘15.62mg/ml。2.在光镜下观察了甲3型流感病毒对照组的MDCK细胞,可见被感染的MDCK细胞出现了细胞凋亡特有的形态学变化。3.Annexin V和PI双染经流式细胞仪测定显示三种药物试验组的细胞凋亡率(金银花28.13%±3.30%、黄芩13.47%±3.04%、连翘19.17%±6.55%)均显著低于病毒对照组54.10%±4.58%(P<0.001)。4.黄芩试验组及连翘试验组细胞凋亡率与药物对照组及细胞对照组无差异(P>0.05)。金银花试验组细胞凋亡率与药物对照组及细胞对照组有差异。(P<0.05)。5.黄芩对甲3型流感病毒诱导细胞凋亡的抑制率:(inhibtion ratio,IR)为79.87%,连翘IR为68.67%,利巴韦林IR为77.94%。黄芩试验组、连翘试验组与利巴韦林对照组比较IR无差异(P>0.05)。结论:1.黄芩和连翘能抑制甲3型流感病毒诱导MDCK细胞凋亡.2.黄芩、连翘对甲3型流感病毒诱导MDCK细胞凋亡的抑制作用与利巴韦比较无显著性差异。3.本研究尚不能说明金银花能有效抑制甲3型流感病毒诱导MDCK细胞凋亡。
邓东沅[3]2017年在《木犀草素对流感病毒H1N1感染A549细胞的作用及免疫调节机制的研究》文中指出目的流感病毒是全球范围内危害较高的病原体,常表现为季节性流行,其中甲型流感病毒是造成感染及死亡的主要病原体,较容易通过突变和重配驱动进化发生变异,常会造成灾难性的大流行。流感属中医"外感热病",祖国医学在流感的防治方面积累了很多经验,利用中医药独特的优势研制新型的抗流感药剂,对流感的防治有重要而深远的意义。本实验选用木犀草素是在其原有的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、免疫调节和诱导肿瘤细胞凋亡等药效作用基础上,进一步探究其对流感病毒的作用。我们发现它具有抗病毒作用,因此本实验选用甲型流感病毒H1N1感染肺癌上皮细胞A549细胞株作为体外细胞培养模型,研究木犀草素体外抗流感病毒作用的分子机制。同时利用基因芯片、实时荧光定量PCR和Western-blot等实验方法,筛查出差异表达基因,找到调控的相关炎性细胞因子和细胞凋亡因子等,为木犀草素临床应用提供理论依据。方法1.木犀草素体外对H1N1感染A549细胞作用的影响将A549细胞复苏、传代3-4次。筛选出生长状态良好的细胞培养瓶,调整细胞浓度到1.5×105mL~(-1),小心接种于96孔板中。采用细胞病变效应(CPE)计算出木犀草素抗病毒的活性指数,根据Reed-Muench公式计算出最大无毒浓度(TC0)以及50%细胞中毒浓度(TC50);检测不同时间和作用方式时木犀草素的吸光度,找出木犀草素抗病毒最佳作用方式,并计算出半数抑制浓度(IC50)以及治疗指数(TI)。2.木犀草素体外对流感病毒H1N1诱导炎性细胞因子表达干预作用的影响设置细胞对照组(A)、病毒感染组(B)、奥司他韦对照组(C:0.75mg·L~(-1))、木犀草素高剂量组(D:25mg·L~(-1))和木犀草素低剂量组(E:6.25mg·L~(-1))。细胞对照组不加病毒,其他组均感染流感病毒2h后,吸弃病毒液,用PBS清洗,加入以上各组药物,作用24h后吸弃上清,用PBS清洗1次后,加入细胞裂解液,提取各组总RNA,通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western-blot)的方法检测IL-1、IL-10、IFN-y、TNF-a 的 mRNA 的表达变化。3.木犀草素对流感病毒感染细胞TLR信号通路调节作用的影响基因芯片用于筛选流感病毒H1N1感染A549细胞后TLR信号通路的差异表达基因。通过Real-Time PCR和Western-blot检测肺组织Toll样受体3(Toll-like receptor 3,TLR 3)、Toll 样受体 7(Toll-like receptor 7,TLR 7)、髓样分化因子 88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)的 mRNA和蛋白表达的变化。4.木犀草素对流感病毒H1N1感染A549细胞引发凋亡的调控作用设置细胞对照组(A)、病毒感染组(B)、奥司他韦对照组(C:0.75 mg·L~(-1))、木犀草素D组(25mg·L~(-1))和木犀草素E组(6.25mg·L~(-1))。细胞对照组不加病毒,其他组均感染流感病毒2h后,吸弃病毒液,用PBS清洗,加入以上各组药物,作用24h后吸弃上清,用PBS清洗1次后,加入细胞裂解液,放置于一80℃冰箱中冷冻过夜。提取各组总RNA,采用基因芯片技术,查找基因信息功能及生物路径,筛选出与凋亡通路中密切相关的差异表达基因,进行讨论。结果1.木犀草素体外对流感病毒H1N1增殖干预效果的影响木犀草素的半数中毒浓度为39.810μg·mL~(-1),最大无毒浓度为25.0μg·mL~(-1);浓度在12.5-25.0μg·mL~(-1),木犀草素作用48-60 h,对H1N1所致的细胞病变作用有明显的抑制作用。病毒感染后2 h加入25.0μg·mL~(-1)浓度的木犀草素,抗病毒有效率最高为(87.0±1.71)%。计算该条件下木犀草素半数抑制浓度为11.282μg·mL~(-1),治疗指数为3.528。2.木犀草素体外对流感病毒H1N1诱导炎性细胞因子表达干预作用的影响通过KEGG pathway分析涉及炎性因子分泌和转录的变化基因。与细胞对照组(A)相比,病毒感染组(B)差异表达基因TNF-α、IFN-γ、IL-10和IL-1明显上调(P<0.01);与H1N1感染组(B)比较,奥司他韦组(C)对差异表达基因IFN-γ、IL-10和IL-1明显下调(P<0.01);木犀草素高剂量组(D)对差异表达基因,TNF-a、IFN-γ、IL-10和IL-1明显下调(P<0.01);木犀草素低剂量组(E)对差异表达基因,IFN-γ、IL-10和IL-1明显下调(P<0.01或P<0.05)。RT-PCR结果显示,与细胞对照组(A)比较,H1N1感染组(B)TNF-α、IFN-γ、IL-10和IL-1的mRNA表达均明显升高(P<0.01);与H1N1感染组(B)比较,奥司他韦对照组(C)的TNF-α、IFN-γ、IL-10和IL-1的mRNA表达明显降低(P<0.01);木犀草素组(D和E)的TNF-α、IFN-y、IL-10和IL-1表达均明显降低(P<0.01)。Western-blot 提示,H1N1 病毒感染组(B 组)TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-1蛋白表达较细胞对照组(A)显著升高(P<0.01),与H1N1病毒感染组(B组)相比,木犀草素高低剂量组(D和E组)的TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-1蛋白表达不同程度降低(P<0.01)。3.木犀草素对流感病毒感染细胞TLR信号通路调节作用的影响通过KEGG pathway分析涉及TLR信号通路的细胞因子。与细胞对照组(A)相比,H1N1 感染组(B)差异表达基因 Myd88、TLR3、TLR7、IRAK4、IRF7、TRAF6明显上调(P<0.01);与H1N1感染组(B)比较,奥司他韦对照组(C)对差异表达基因 Myd88、TLR3、TLR7、IRAK4、IRF7、TRAF6 明显下调(P<0.01);木犀草素高剂量组(D)对差异表达基因Myd88、TLR3、TLR7、IRF7、TRAF6明显下调(P<0.05或P<0.01);木犀草素低剂量组(E)对差异表达基因Myd88、TLR7、IRAK4、IRF7明显下调(P<0.01)。PCR结果:与细胞对照组(A)比较,H1N1感染组(B)TLR3、TLR7、MyD88的mRNA表达均明显升高(P<0.01或P<0.05)。与H1N1感染组(B)比较,奥司他韦对照组(C)的TLR3、TLR7、MyD88的mRNA表达明显降低(P<0.01或P<0.05);木犀草素组(D和E)的TLR3、TLR7、MyD88的mRNA表达均明显降低(P<0.01)。Western-blot 提示,H1N1 病毒感染组(B 组)TLR3、TLR7、MyD88蛋白表达较细胞对照组(A)显著升高(P<0.01),与H1N1病毒感染组(B组)相比,木犀草素高低剂量组(D和E组)的TLR3、TLR7、MyD88蛋白表达不同程度降低(P<0.01)。4.木犀草素对流感病毒H1N1感染A549细胞引发凋亡的调控作用通过KEGG pathway分析信号通路的传导。与细胞对照组(A)相比,病毒感染组(B)差异表达基因 Caspase3、Caspase6、Caspase7、Caspase8、Caspase9、TRAIL、Myd88、IL1 α 和 IL1 β 明显上调,以 TRAIL 尤为明显(P<0.01);与 H1N1感染组(B)比较,奥司他韦组(C)对差异表达基因Caspase3、Caspase6、Caspase7、Caspase8、Caspase9 和 Myd88 明显下调(P<0.01);木犀草素组(D和 E)对差异表达基因 Caspase3、Caspase6、Caspase7、Caspase8、Caspase9 和Myd88明显下调(P<0.01)。RT-PCR提示,与细胞对照组(A)比较,H1N1感染组(B)Caspase3、Caspase8 和 Myd88 的 mRNA 表达均明显升高(P<0.01);与 H1N1 感染组(B)比较,奥司他韦对照组(C)的Caspase3、Caspase8和Myd88的mRNA表达明显降低(P<0.01);木犀草素组(D和E)的Caspase3、Caspase8和Myd88的mRNA表达均明显降低(P<0.01),该结果和基因芯片表达的结果基本相符。结论本实验利用基因芯片、RT-PCR、Western blot方法从基因、mRNA和蛋白质等方面较全面分析了木犀草素对流感病毒H1N1感染A549细胞的干预作用及机制。结果显示,木犀草素对流感病毒的增殖有较强的抑制作用,同时也能有效抑制炎性细胞因子的表达,影响TLR信号通路以及凋亡相关因子的表达,从而减轻病毒对宿主细胞的免疫损伤,减少细胞凋亡,发挥抗病毒的作用。
戴新宪[4]2011年在《PI3K/Akt信号通路下游关键分子对甲型流感病毒增殖的影响》文中研究指明病毒在感染宿主细胞后可以激活细胞内的信号转导来支持自身的高效复制。甲型流感病毒感染可以激活宿主细胞的P13K/Akt通路。但是PI3K/Akt通路在流感病毒感染过程中支持流感病毒有效复制下游具体机制并不清楚。为了进一步揭示P13K通路对流感病毒增殖进行调控的具体分子机制,本研究立足于P13K通路下游两个主要的生物学效应(细胞凋亡和翻译起始的调节),探讨了PI3K/Akt信号通路的三个关键的下游分子mdm2、GSK-3β和mTOR对流感病毒感染过程的影响。在研究mdm2、GSK-3β和mTOR对流感病毒诱导的细胞凋亡的调控作用中,本研究主要通过RNA干扰技术使mdm2、GSK-3β或mTOR基因表达下调后,应用Caspase Glo 3/7凋亡检测试剂盒和流式细胞术检测了流感感染细胞凋亡水平的变化,应用CCK-8试剂盒检测了细胞活力的改变,并检测了对细胞上清的流感病毒滴度的影响。在mTOR介导的翻译调控对流感病毒感染过程影响的研究中,本研究采用蛋白免疫印记方法检测了mTOR下游两个关键翻译调控分子4E-BP 1和p70S6K在流感感染细胞,P13K抑制剂LY294002或mTOR抑制剂rapamycin处理的流感病毒感染细胞磷酸化水平的变化。通过NP蛋白间接免疫荧光实验及细胞液中的病毒滴度等实验检测了相应的病毒增殖水平。本研究还使用真核表达载体在细胞内表达甲型流感病毒的NS1蛋白,并检测了NSl蛋白表达对Akt及4E-BP1磷酸化的影响。在对流感病毒诱导的细胞凋亡的研究中,本研究发现：mdm2分子在流感病毒感染过程中发生了有趣的亚细胞定位变化；mdm2基因表达下调增强了流感病毒感染的A549细胞的细胞活力并降低了流感病毒感染造成的A549细胞凋亡,同时提高了细胞上清中的病毒滴度；GSK-3β基因表达下调降低了流感病毒感染的A549细胞的细胞活力并且增强了流感病毒感染造成的细胞凋亡,同时降低了细胞上清中的病毒滴度；mTOR基因表达下调降低了流感病毒感染的A549细胞的细胞活力并且增强了流感病毒感染造成的细胞凋亡,同时降低了细胞上清中的病毒滴度。在对于流感病毒蛋白翻译控制的研究中,本研究发现：甲型流感病毒感染激活了PI3K/Akt通路并可以引起4E-BP1的磷酸化；使用LY294002阻断PI3K/Akt信号通路可以同时阻断p70S6Kianse和4E-BP1的磷酸化；使用Rapamycin阻断mTORCl的功能可以阻断p70S6K的磷酸化而对4E-BP1的磷酸化并没有显著影响,特别是在感染后期；LY294002影响了流感病毒NP蛋白的表达和出核并降低了流感病毒的滴度,而Rapamycin对流感病毒NP蛋白的表达和出核过程没有明显影响但是却降低了流感病毒的滴度；使用质粒表达流感病毒的NS1蛋白可以激活PI3K/Akt通路并磷酸化4E-BP1。以上研究结果提示甲型流感病毒的NS1蛋白可以通过PI3K/Akt信号通路磷酸化4E-BP1并可能因此影响了病毒蛋白的翻译。本研究揭示了mdm2、GSK-3β和mTOR对甲型流感病毒诱导的细胞凋亡的调控作用以及对病毒增殖的影响。同时研究了mTOR介导的翻译调控在流感病毒感染中的作用。本研究扩充了我们对流感病毒感染过程的认识,为流感的防治奠定了基础。
桂芳, 张卓然, 段于峰, 周志航, 滕兰菊[5]2007年在《甲型与乙型流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡的比较》文中研究表明目的观察并比较不同流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡能力的差异。方法A1、B型流感病毒及经紫外线照射后的病毒分别感染HeLa细胞,于不同时间取HeLa细胞分别在电镜下观察细胞的形态,AnnexinV-FITC染色流式细胞仪检测凋亡百分率。结果A1亚型及B型流感病毒作用于HeLa细胞后24h,电镜下可见细胞凋亡的特征性改变,且凋亡百分率随时间延长而增高,于12～24h达高峰,其中B型流感病毒的凋亡诱导率最高达38.65%,A1亚型最高为23.94%。紫外线照射后的B型流感病毒(UV-B)最高达到18.20%,UV-A1最高达到10.05%,A1亚型与B型相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论B型流感病毒诱导肿瘤细胞凋亡的能力比A型流感病毒强,而且经紫外线照射后的流感病毒可能仍然具有一定的诱导细胞凋亡能力;在肿瘤治疗方面,B型流感病毒比A型流感病毒具有更大的研究和应用价值。
余丹丹[6]2005年在《两株H5N1亚型禽流感病毒诱导的细胞凋亡研究》文中进行了进一步梳理禽流感病毒以感染禽类引起大爆发和急性死亡为特征,但近年来,禽流感病毒已经能够跨越种间屏障直接感染人了。研究病毒-宿主相互作用对于阐明病毒引起疾病的机理起到至关重要的作用。流感病毒诱导的细胞凋亡,涉及到各方面的问题,包括细胞和病毒因子的相互关系、细胞种类等因素。对于禽流感病毒感染诱导的细胞凋亡作用既可能是有利于病毒的扩散,也可能是机体对病毒感染的防御反应。本研究目的是在了解禽流感病毒的NSl基因引起细胞凋亡的基础上,进一步探索全病毒对鸡胚成纤维细胞以及哺乳动物的作用,为阐明禽流感病毒的致病机理提供理论依据。 实验中我们选择了生物学特性差异明显A/Duck/Guangdon/40/2000(H5N1)(简称DKGD/40/00)和A/Duck/Guangxi/35/2001(H5N1) (简称DKGX/35/01)两株H5N1亚型禽流感病毒来进行实验,DKGD/40/00和DKGX/35/01同属于H5N1亚型禽流感病毒,对于禽类是高致病性的,而在小鼠上,DKGD/40/00是感染不致死,DKGX/35/01是感染且致死小鼠。我们把这两株病毒的NS1基因进行了克隆,应用荧光显微镜检测构建于真核表达载体pIRES2-EGFP的NS1蛋白的转染表达效率及瞬时表达,应用TUNEL和流式细胞仪观察NS1蛋白与凋亡的关系。结果表明:两株病毒NS1蛋白表达均能诱导Hela细胞凋亡,凋亡率最高可达15.29%,但是两者间并无明显差异。由此说明单一的NS1并不能完全阐明凋亡的产生与病毒毒力强弱和病毒扩散之间的关系。 在了解禽流感病毒的NS1基因引起细胞凋亡的基础上,我们研究了这两株病毒对鸡胚成纤维细胞的凋亡作用,结果发现经过病毒诱导后,细胞出现生长特性及细胞形态学的改变,DNA电泳出现典型梯状条带;流式细胞仪显示凋亡峰出现,凋亡率最高可达23.64%,且两种病毒诱导的细胞凋亡差异极显著,DKGX/35/01诱导的细胞凋亡率明显高于DKGD/40/00。结论:H5N1亚型禽流感病毒可诱导体外培养鸡胚成纤维细胞发生凋亡,且跟病毒的毒力有关。 1997年香港H5N1禽流感病毒感染人事件发生表明禽流感病毒正在获得感染人的能力,在分子水平及其细胞水平的研究基础上,为了了解禽流感病毒对哺乳动物的致病机理与细胞凋亡的关系,我们用两株H5N1亚型高致病性禽流感病毒感染BALB/C小鼠后,采集心、肝、脾、肺、肾、脑和胰等器官,用免疫组织化学的方法检测了病毒抗原的位置;同时,还应用TUNEL方法来检测这些组织中的凋亡信号。结果表明,
王婷, 房师松, 俞慕华[7]2011年在《流感病毒致病机理的研究进展》文中提出流感病毒感染可损伤呼吸道上皮细胞、肺上皮细胞,也可损伤肺外器官。依据病毒型别和感染部位不同而有不同的病理表现。流感病毒诱导宿主细胞凋亡的机制错综复杂,包括半胱天冬酶(caspase)、Fas/FasL、P53和PI3K/Akt信号通路、IKK-NF-κB信号通路、JNK和P38MAPK。同时细胞凋亡与流感病毒编码蛋白和其他因素也有关系。
张春晶, 顾立刚, 于海涛[8]2011年在《黄芩苷干预甲型H1N1流感病毒感染诱导的A549细胞周期分布及凋亡》文中认为以甲型H1N1流感病毒作为刺激因素,在人肺腺癌A549细胞培养内采用MTT比色法和细胞病变(CPE)法观察黄芩苷不同作用时间的抗病毒效率;以碘化丙啶(Propidium iodide,PI)单染流式细胞仪分析细胞周期中各时期的细胞百分数和对细胞增殖的影响,以Hoechst33258染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化,并采用免疫荧光实验测定膜受体通路Caspase 8和线粒体通路Caspase 9及作为细胞凋亡标志的Caspase 3的活性。结果显示:流感病毒感染36h后宿主细胞周期阻滞于S期(P<0.05),并在G0期细胞峰前出现一个亚二倍体细胞峰(凋亡细胞峰)。A549细胞中Caspase 8/3活性明显升高,但标记Caspase 9活性的荧光亮度增强不明显。黄芩苷对甲型流感病毒感染诱导的细胞损伤有较好的保护作用,最大剂量的黄芩苷100μg/mL无毒,可抑制病毒细胞病变的产生,50~100μg/mL治疗组可明显调节流感病毒感染诱导的细胞周期分布(P<0.05),细胞凋亡现象明显减少,100μg/mL黄芩苷治疗组Caspase 8/3活性显著降低,接近正常对照组细胞水平,有剂量依赖性。实验说明:黄芩苷可拮抗甲型流感病毒H1N1细胞病变,调控细胞周期分布,并通过抑制Caspase 8的激活,进一步抑制Caspase 3活性,从而发挥抗病毒作用。
晏文君[9]2012年在《流感病毒核蛋白NP激活p53生物学意义及p53抗流感病毒机制解析》文中提出流感病毒(Influenza A viruses, IAV)属于正粘病毒科，单股负链分节段的RNA病毒，基因组由8个RNA片段组成。人类历史上几次流感大流行都给社会带了严重的经济损失并造成了大量人群的死亡。由于病毒变异快，这给病毒的防治带来了相当大的困难。病毒感染细胞通过一系列的机制来限制病毒的复制，现阶段发现的抗流感病毒机制主要有激活趋化因子、炎性因子和抗病毒细胞因子类等。肿瘤抑制因子p53是在细胞受到各种刺激，如细胞分化、细胞衰老、DNA损伤、缺氧等，均能被激活而发挥其功能，总得来说p53作为转录调控因子，通过磷酸化和去磷酸化而在DNA损伤修复、细胞周期捕获、细胞凋亡中起到重要作用，但近年来发现p53在抗病毒免疫中也发挥着重要作用，而且有研究表明p53在细胞水平具有抗IAV作用。为了进一步研究IAV与p53之间的关系及p53在抗IAV中的作用，我们进行了如下研究：1、IAV NP蛋白激活p53生物学意义。我们通过p53-Luciferase实验发现，NP蛋白能够激活p53转录活性，通过IFA发现NP蛋白和p53蛋白之间在细胞内存在很好的共定位，通过Co-ip及BIFC实验表明NP和p53蛋白之间存在直接的相互作用。接着通过FCM检测细胞凋亡发现NP蛋白并不能引起p53依赖的细胞凋亡，但能引起细胞周期停滞于G0/G1期。这部分研究表明，IAV NP蛋白能激活p53，从而引起细胞停滞，这可能是p53抗流感病毒的一种可能机制。2、p53与流感病毒致病性之间的关系。主要是通过流感病毒PR8毒株感染p53wt(p53+/+)、p53ko(p53-/-)小鼠，分析p53wt和p53ko小鼠的发病情况、病料中病毒复制情况。发现流感病毒感染后p53ko小鼠死亡率和体重减轻都明显高于p53wt小鼠，这表明p53分子具有保护机体免受流感病毒致病性的影响。进一步分析小鼠肺脏眼观病理变化及病理切片分析表明p53ko小鼠肺组织病理损伤明显高于p53wt小鼠，而且其细胞损伤程度和炎症反应也明显强于p53wt小鼠。此外，对肺脏中病毒滴度检测表明p53ko小鼠病毒滴度明显高于p53wt小鼠，这说明，p53在机体水平具有抗流感病毒作用。以上结果说明了p53具有保护机体抗流感病毒的作用。3、小鼠淋巴细胞增殖情况分析。IAV感染p53wt、p53ko小鼠后第3天，对脾脏中CD4和CD8细胞增殖情况通过流式细胞技术检测发现，p53wt小鼠脾脏中CD4和CD8细胞在病毒感染后明显增多，但p53ko小鼠却几乎没有变化。这表明p53ko小鼠CD4和CD8细胞在IAV感染后增殖受到抑制，说明p53在淋巴细胞的增殖中起到重要作用。4、小鼠全基因组表达差异分析。通过基因芯片技术对IAV感染后第3天和第6天，p53wt、p53ko小鼠肺脏全基因表达谱进行分析，发现先天性免疫中有许多基因表达发生的明显变化，比如，病毒感染后第3天TLR信号通路中TLR8、Rac1、AKT、JNK、p38、IFN-α、AP-1、CD40、IRF7等基因表达上调；TLR4、CASP8、TNF-α、IL-1β、IL-12、CD80、CD86、NF-κB等表达下调；第6天TLR1、TLR2、TLR6、TLR7、P13K、P38、IFR7、IL-12、IFN-α、IP-10等基因表达上调；TLR9、CD80等基因表达下调。这表明p53可能在调控先天性免疫抗流感病毒过程中起着重要作用。此外对于细胞凋亡通路基因表达变化分析也发现了一些表达有明显差异的基因。而且通过本研究我们还找到了一些p53的可能靶基因及一些在抗流感病毒中可能起作用的基因，这些都有待于进一步研究。综上所述，本研究通过多个方面研究了IAV与p53之间的关系，分析了p53对IAV增殖和致病性的影响，发现了p53抗流感病毒的一些可能机制，以及一些可能参与作用的分子及细胞。进一步确立了p53在抗病毒中的作用，为以后进一步研究p53抗IAV的分子机制和抗病毒药物的研发提供了基础数据。
景姗[10]2008年在《毒热平注射液对FM1感染小鼠T细胞功能的影响》文中认为目的流行性感冒是由流感病毒引起的一种呼吸道传染性疾病,给人们健康生活和社会经济带来严重危害.中医药在治疗流感方面具有独特的优势,临床疗效肯定,近年来的实验研究表明,中药不仅能抗病毒,还能发挥整体调节作用,通过调节免疫系统来发挥治疗病毒感染性疾病的作用。因此对中药治疗流感的免疫调节作用有进一步研究的必要。毒热平注射液是由黄芩、栀子、猪胆粉、灯盏花等四味药组成的中药复方制剂,四药共奏清热解毒、活血通络之功。本实验主要研究毒热平注射液对FM1感染后小鼠T细胞功能的影响,以明确中医药抗病毒作用机制,为中医药的临床应用和进一步实验研究提供理论依据。方法本实验共分为体内、体外两个部分:第一部分为体外实验,研究毒热平注射液体外对小鼠脾脏T细胞抗流感病毒(FM1)功能的影响。以BALB/c小鼠(SPF级)脾脏T细胞作为研究对象,实验分成毒热平注射液组,双黄连对照组,正常组和FM1感染模型组。主要研究内容有:①毒热平注射液对正常小鼠T细胞增殖功能和产生IFN-γ、IL-10的影响;②研究流感病毒(FM1)对Con A活化T细胞的影响及毒热平注射液的干预作用;③流感病毒(FM1)感染巨噬细胞培养上清对T细胞增殖和产生INF-γ的影响及毒热平注射液的干预作用;④毒热平注射液对小鼠T细胞杀伤流感病毒(FM1)感染巨噬细胞Ana-1的影响。第二部分为体内实验,研究毒热平注射液体内对FM1感染小鼠肺脏T细胞功能的影响。以ICR小鼠(SPF级)作为研究对象。实验分为七组:毒热平注射液大、中、小剂量组,双黄连组,利巴韦林组,FM1感染模型组,正常组。FM1感染小鼠造模后,上述各组小鼠感染当天分别给予药物腹腔注射,每天1次,连续7天后摘取肺组织,计算肺指数,用RT-PCR法测定肺组织中INF-γmRNA,IL-4 mRNA基因转录水平的改变,用Wstern-blot法检测肺组织中CD40L蛋白表达水平的变化。结果第一部分体外实验1.毒热平注射液对正常小鼠T细胞增殖功能和产生IFN-γ、IL-10的影响毒热平注射液17μg/ml和8.5μg/ml能明显抑制诱导的小鼠脾脏T细胞增殖,同时还能明显抑制conA诱导的脾脏T细胞IL-10的产生,毒热平注射液17μg/ml能明显增强conA诱导的脾脏T细胞IFN-γ的产生。2. FM1对Con A活化T细胞的影响及毒热平注射液的干预作用⑴FM1感染conA诱导的脾细胞,加药作用12h后换液继续培养至36h,模型组与正常组比较,淋巴细胞数目显著减少,毒热平注射液17μg/ml能显著上调病毒诱导的淋巴细胞数目减少;加药作用24h后换液继续培养至36h,模型组与正常组比较,淋巴细胞数目显著减少,毒热平注射液17μg/ml、8.5μg/ml和4μg/ml能显著上调病毒诱导的淋巴细胞数目减少;加药作用36h后,模型组与正常组比较,淋巴细胞胞数目显著减少,毒热平注射液组与正常组模型组比较均没有显著性差异。⑵FM1感染conA诱导的脾细胞,加药作用12h后,模型组细胞上清中的IFN-γ、IL-10水平显著高于正常组,毒热平注射液17μg/ml、8.5μg/ml细胞上清中的INF-γ水平显著高于正常组,毒热平注射液8.5μg/ml、2μg/ml细胞上清中的INF-γ值显著低于模型组,毒热平注射液17μg/ml、8.5μg/ml和2μg/ml细胞上清中的IL-10值显著低于模型组;FM1感染conA诱导的脾细胞,加药作用24h后,流感病毒FM1感染脾细胞24h后,正常组产生的INF-γ、IL-10在ConA刺激下增长到最高,模型组细胞上清中产生的INF-γ、IL-10减少,显著低于正常组。毒热平注射液17μg/ml、8.5μg/ml和2μg/ml组仍然能维持INF-γ量在较高水平,浓度显著大于模型组,与正常组比较无显著差异,而毒热平注射液17μg/ml、8.5μg/ml组的IL-10水平显著低于模型组;流感病毒FM1感染conA诱导的脾细胞,加药作用36h后,各组上清中的INF-γ、IL-10水平均比前面时段明显下降,且没有显著性差异。3.FM1感染巨噬细胞培养上清对T细胞增殖和产生INF-γ的影响及毒热平注射液的干预作用FM1感染预先加药后的巨噬细胞(Ana-1),8h的细胞上清,加入Con A诱导过的小鼠脾细胞后,模型组的脾脏T细胞增值水平与正常组比较没有显著差异,但产生的INF-γ显著高于正常组,毒热平注射液8.5μg/ml、2μg/ml组与模型组比较,能明显上调脾脏T细胞增值水平,且17μg/ml、8.5μg/ml组产生的INF-γ显著高于模型组;12h的细胞上清,加入Con A诱导过的小鼠脾细胞后,模型组脾细胞增值水平明显低于正常组,产生的INF-γ水平与正常组比较没有显著性差异,毒热平注射液17ug/ml、8.5μg/ml、24μg/ml组与模型组比较,能明显上调脾脏T细胞增值水平,毒热平注射液17ug/ml组产生的INF-γ显著高于模型组;24h的细胞上清,加入Con A诱导过的小鼠脾细胞后,模型组脾细胞增值水平明显低于正常组,产生的INF-γ亦显著低于正常组,毒热平注射液组脾细胞增值水平与模型组没有显著性差异,但毒热平注射液17ug/ml、8.5μg/ml组产生的INF-γ显著高于模型组。4.毒热平注射液对小鼠T细胞杀伤FM1感染巨噬细胞Ana-1的影响T细胞作用于FM1感染后的Ana-1细胞12h后,当效靶比例E/T=100:1时,模型组的杀伤率明显低于正常组,毒热平注射液17μg/ml组杀伤效率明显高于模型组;当效靶比例E/T=50:1时,模型组杀伤率仍低于正常组,但无明显差异,毒热平注射液C=17ug/ml和DRP2C=8.5ug/ml组杀伤效率均明显高于模型组. T细胞作用于FM1感染后的Ana-1细胞24h后,模型组与正常组杀伤效率没有显著差异;当效靶比例E/T=100:1时,毒热平注射液17μg/ml、C=8.5ug/ml组杀伤效率明显高于模型组;当效靶比例E/T=50:1时,毒热平注射液17μg/ml、C=8.5ug/ml和C=2ug/ml组杀伤效率均明显高于模型组;当效靶比例E/T=25:1时,毒热平注射液2μg/ml组杀伤率明显大于模型组。第二部分体内实验1.毒热平注射液对FM1感染小鼠肺指数的影响毒热平注射液作用于流感病毒FM1感染的小鼠7天后,模型组的肺指数明显高于正常组,利巴韦林组、双黄连组、毒热平大剂量组、毒热平中剂量组、毒热平小剂量组与模型组比较,肺指数均明显降低,其中以毒热平中剂量组最好,且可以看出该组小鼠体重增长与正常组比较没有显著性差异.2.毒热平注射液对FM1感染小鼠肺组织中IL-4、INF-γmRNA转录的影响毒热平注射液作用于流感病毒FM1感染的小鼠7天后,模型组的IL-4、INF-γmRNA转录水平均明显高正常组,毒热平注射液能降低流感病毒FM1感染小鼠肺组织中IL-4mRNA基因转录,且IL-4mRNA基因转录水平与浓度成反向关系,但毒热平注射液祖的IL-4mRNA基因转录水平明显高于利巴韦林组;毒热平注射液能增强流感病毒FM1感染小鼠肺组织中IFN-γmRNA基因转录,且INF-γmRNA基因转录水平与毒热平的浓度呈正向相关性,大剂量组与中剂量组与利巴韦林比较没有显著性差异。3.毒热平注射液对FM1感染小鼠肺组织T细胞CD40L蛋白表达的影响毒热平注射液作用于流感病毒FM1感染的小鼠7天后,模型组的CD40L蛋白表达水平明显高正常组,毒热平注射液能抑制流感病毒FM1感染小鼠肺组织中CD40L蛋白表达,抑制效果与浓度呈正向相关性,但毒热平注射液组CD40L表达水平显著高于正常组与利巴韦林组。结论毒热平注射液体外能抑制Con A诱导的正常小鼠脾细胞的增殖,抑制Th2型细胞因子IL-10的产生,促进Th1型细胞因子IFN-γ的产生;能保护FM1感染的的小鼠脾细胞,并抑制其产生Th2型细胞因子IL-10,而使Th1型细胞因子IFN-γ水平保持在一定的范围内;其预先作用巨噬细胞,再经FM1感染,各时段的巨噬细胞上清能促进T细胞的增殖能力和IFN-γ的表达;还能直接增强T细胞对FM1感染的靶细胞的杀伤能力。毒热平注射液体内能降低FM1感染小鼠的肺指数,且对小鼠的体重抑制作用小;增强FM1感染小鼠肺组织IFN-γmRNA基因转录,抑制IL-4mRNA基因转录,从而调节Th1型和Th2型T细胞的分化;还能抑制FM1感染小鼠肺组织CD40L蛋白的表达。实验说明毒热平注射液作用的多靶点性,通过调节免疫系统的平衡,增强机体进行有利于抗病毒的免疫应答,而又不产生过强的病理性炎症反应,且对小鼠的毒副作用少。
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