摘要：分子诊断学的基础理论为分子生物学，随着分子诊断学的飞速发展，使其成为了生命科学中最先进的领域。近年来，分子诊断学被广泛运用在临床疾病的预防、诊断、治疗与评价中，并取得了巨大的成果。从传统的DNA诊断发展到表达产物等全面诊断，从利用分子杂交等到以技术发展到有机组合多项技术的诊断，分子诊断学在临床中的价值受到关注。本文就分子诊断学用于诊断地中海贫血展开研究，就其价值进行分析。
关键词：分子诊断学；地中海贫血；分子生物学；诊断
分子诊断学是指利用分子生物学的技术与方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构及表达调控变化，在疾病的预测、预防、诊断及治疗中发挥着重要的作用。从生物中心法则来看，分子诊断是通过检测 人体基因结构异常或表达异常来做出人体疾病的实验诊断[1]。随着分子诊断技术的发展和应用，其在临床疾病的全面分析中有着重要价值。
1 分子诊断学的意义及其在疾病诊断中的作用
在进行某项生理或疾病状态的评估时，DNA的检测可以充分反映出人体基因存在的缺陷，分析基因转录或翻译的产物则能反映基因的表达量。分子诊断学在检验医学中显示出了强大的优势，例如：针对乙型肝炎的诊断和治疗，使用DNA定量技术对疾病的治疗和检测提供了重要数据，这也给临床诊疗带来了十分重要的信息。
20世纪50年代人们开始使用细胞学检查、生化指标分析等技术来进行是实验室诊断，这些技术都是以疾病表型改变、通过病理学及细胞学等技术来判断疾病。而分子诊断学主要是根据疾病基因探查为对象，对基因检测的结果具有很强的描述性，属于病因学诊断，并且还具有一定的预测性。分子诊断表现出的疾病诊断准确性使其被广泛运用在早期的遗传性疾病诊断中[2]。
2 地中海贫血的概念机筛查方法
地中海贫血即珠蛋白生成障碍性贫血，是一组遗传性溶血性疾病，因遗传基因缺陷致使血红蛋白中的一种或多种珠蛋白链合成缺失或不足，最终导致贫血或其他病理状态。事实上，地贫基于基因缺陷的复杂性与多样性，疾病的变异性较大。地中海贫血分布世界多地，东南亚即为高发区之一。珠蛋白链分子的合成与结构主要取决于基因，因珠蛋白基因缺失、突变，肽链合成受到阻碍后发病，地中海贫血可分为α型、β型、δβ型和δ型4种，但主要以α型、β型发病为主。α地贫是因α珠蛋白缺失，少数基因点突变造成，β地贫的分子病理比较复杂，有100多种突变情况，多数是因基因点突变造成。
地贫的患病率较高，致使很多研究者开始关注地贫的诊断及治疗方法。目前，已经总结和提出的治疗方法有输血疗法、药物疗法、基因疗法及抑制疗法，但这些方法仅对轻型地贫效果较好，针对重型地贫还存在一定的难度。加强遗传咨询、做好产前诊断与筛查是防止地贫的关键，地贫的筛查主要通过观察红细胞的形态、技术及做血红蛋白电泳、理性化质测定，HbA2和Hb-F定量检测等方法[3]。
3 地中海贫血的分子诊断方法
3.1 α地贫的分子诊断
人体第16号染色体上存在两串联的α珠蛋白基因，内含子和外显子在核苷酸上的序列存在同源性，是不等位交换的理想模式。当细胞减数分裂时，α珠蛋白基因簇如果错排就会造成不等位交换，使得一条16号染色体上只剩下1个α珠蛋白基因，而在另一条上将串联3个α珠蛋白基因。使得α珠蛋白基因转录水平下降，肽链合成量下降造成地贫。聚合酶链式反应（PCR）是鉴别缺失型α地贫的主要手段，因α1和α2珠蛋白基因3端序列存在差别，因此可以进行相应的特异引物进行PCR分析，以鉴别α1、α2的基因缺失情况。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆快速鉴别诊断是突变基因特异性扩增系统法（ARMS）诊断地贫的优势，通过鉴别HbCS和HbQS，方便简单、安全可靠，适合用于诊断中国人非缺失型α地贫的基因与产前诊断。与ARMS法相似，等位基因特异性扩增法（ASA）主要同工PCR产物扩增带的诊断，判断其是否存在突变从而确诊，但ASA法如果用于HbQS点突变检测，当其突变点附近的GC含量较高时，进行扩增的难度较大，且准确性不高[4]。此外，单链构象多态性法（SSCP）也是快速筛查非缺失型α地贫突变的有效方式，通过RNA在非变性聚丙烯酰胺酶凝胶电泳，根据单链DNA体系以构象为基础进行电泳来鉴定DNA的序列是否改变。SSCP是目前为止发现的操作简单、适用类型广泛的诊断方式，但其也存在影响因素多、重复性差的缺陷。等位基因特异性扩增技术（ASPCR）适用于针对小片段DNA进行电泳分析，依照扩增得到的电泳带判断其是否存在点突变，ASPCR具有准确可靠、微量清晰的优势。South印迹法通过用α基因特异性探针与正常人的基因酶切片段进行杂交，当α基因发生缺失时杂交片段变小或消失则可以确定为α型地贫。
3.2 β地贫的分子诊断学
前面说道，β珠蛋白生成障碍性贫血的发生的分子病理相当复杂，主要是由于基因的点突变，少数为基因缺失。β地贫还分为重型、轻型及中间型，其中重型β地贫主表现为外周血象呈小细胞低色素性贫血，红细胞大小不均，出现异形、靶形、碎片红细胞和有核红细胞等。轻型β地贫表现为成熟红细胞轻度形态改变，血红蛋白电泳显示HbA2升高，红细胞渗透脆性正常或减低。中间型表现为外周血象及骨髓象改变，红细胞渗透脆性减低。
另外，重型β地贫的筛查和诊断一直以来都是研究难点，PCR结合特异寡核苷酸探针（PCR-ASO）斑点杂交法是诊断和分型β地贫的一种有效方法，通过将β珠蛋白基因PCR扩增产物进行碱变性后，固定在尼龙膜上，将标记的蛋白PCR与扩增后产物内部核酸序列互补的序列进行等位基因特异寡核苷酸探针行斑点杂交即可检测。但此方法一次检测只能针对一种突变，因此实际操作比较费时，但其准确性较高。反向杂交法（RDB）通过将β地贫的一些抑制突变ASO探针经末端转移酶形成多聚体尾巴后，固定在尼龙膜上，同时将其经PCR扩增靶序列杂交检测，这种方法突破了ASO方法的单一检测行，可以同时对多种未知样本的多种突变进行筛查，不仅效率高且准确性较高，是目前国内比较成熟且安全可靠的β地贫分子诊断方法。此外，芯片技术现已被多个国家广泛运用于地贫检测中，芯片检测阅读系统是专为检测β链基因上多位点突变所设计，采用国际先进PCR体外扩增，根据DNA芯片反向杂交检测技术，快速并准确的检验血液样本中β珠蛋白基因上出现的多个基因位点突变。其技术路线为：样品采集-样品总DNA提取-样品PCR扩增-荧光标记产物-芯片杂交-芯片扫描-分析结果。
综上所述，随着分子诊断学的进一步发展，其在医学上的应用得到了充分的发挥。在地中海贫血的诊断中发挥着重要价值，无论从速度、效果、敏感度、自动化程度等方面来讲，分子诊断学的多种诊断方法都存在优势，且在各领域中取得了巨大的成果。相信在未来，随着越来越多的研究者加入，分子诊断学运用在地中海贫血的诊断中将发挥更大的作用。
参考文献：
[1] 韦柳宏.分子诊断学在地中海贫血诊断中的应用进展[J].海南医学,2011,22(23):130-132.
[2] 任兆瑞,黄淑帧.珠蛋白生成障碍性贫血的基因诊断[J].诊断学理论与实践,2010,09(5):405-408.
[3] 姜敏敏.Y染色体微缺失和地中海贫血的分子遗传学诊断[C].//第八届全国遗传病诊断与产前诊断学术交流会论文集.2012,23(18):207-207.
[4] 农少云.分子诊断学在血友病诊断中的应用[J].海南医学,2013,24(2):280-282.
论文作者:王春莲
论文发表刊物:《名医》（学术版）2016年3期
论文发表时间:2016/9/20
标签：基因论文; 分子论文; 地中海论文; 突变论文; 蛋白论文; 诊断学论文; 缺失论文; 《名医》（学术版）2016年3期论文;