湖南省计划生育研究所 生殖医学中心 湖南长沙 410007
【摘 要】目的 微量精子冷冻在睾丸/附睾穿刺取精及严重少精症患者生殖力保存中发挥着重要的作用，本装置采用重力压缩弹簧的原理，实现冷冻样本的缓慢降温模拟手工操作，从而降低人工劳动强度，实现自动化冷冻微量精子。方法 以辅助生殖技术治疗过程中IVF患者的剩余精液处理后精子为实验样本（前向运动精子比例为90.6%±5.1%），比较自动冷冻微量精子冷冻装置和手工微量精子冷冻的冷冻效果，精子解冻后计数前向运动精子比例。结果 微量精子采用热油法解冻后，自动冷冻与人工冷冻精子的存活率分别为80.6%±7.1%和78.2%±6.1%，两组之间无统计学差异（P>0.05）。讨论 采用自动装置是一种非常有效的冷冻精子的方法，可以替代较为繁杂的体力劳动，实现微量精子的轻松冷冻保存。
【关键词】精子冷冻，睾丸穿刺，附睾穿刺
A novel mechanism for a few sperms cryopreservation
AbstractObject A few sperms freezing plays important roles in fertility preservation for epididymal/testis puncture and severe oligozoospermia. In this study，the automatic freezing device simulated manual operation，the sperm sample slowly is cooled by spring compression driven by gravity，so the intensive labor can be replaced by the automatic device.MethodThe sperm samples after treated（progressive rate 90.6%±5.1%）from IVF patients were collectedand frozen by the device and manual method respectively，the progressive sperm rates were calculated after hot oil thawingseparately.ResultThe progressive sperm rates of post-thawing was 80.6%±7.1% by device，and 78.2%±6.1% by manual，therewasnosignificantdifferencebetweenthetwo methods（P>0.05）.ConclusionIt is a very effective method of a few sperms freezing by the device，and could replace the more complicated manual method.
Key words：sperm frozen，epididymal puncture，testis puncture
人类精子细胞作为一种生殖细胞，早在1776年就有人对精液的冷冻进行了研究，Polge首先发现了甘油对精子冷冻的保护作用[1]，Sherman 首创了液氮蒸汽冷冻精子的方法[2]，这两个里程碑式的贡献使得超低温冷冻精子获得了突破性的进展，以至于当今冷冻精子的保护剂主要成分仍然为甘油，液氮也是目前用来冷冻精子的重要冷冻介质。精子冷冻技术与辅助生殖技术之间的关系是相辅相成，共同发展的。辅助生殖技术为精子冷冻提供了发展的依据，精子冷冻技术的发展又为进一步拓宽了辅助生殖技术的应用领域。卵胞浆内单精子注射技术的出现为严重少精、梗阻性无精患者提供了生育的机会，也使得微量精子冷冻技术逐渐得到重视与发展，国内学者采用玻璃化冷冻方式对微量精子进行研究，取得良好的冷冻效果[3]，甚至Peng采用慢速冷冻方法实现了单个精子的冷冻保存[4]。本研究设计一套冷冻装置，模拟了微量精子的慢速冷冻过程，以替代手工劳动。
1材料和方法
1.1人类精子细胞获取
20例标本来自2017年2月-2017年3月常规IVF继发男方患者，年龄22~35岁，禁欲2~7 d，取精 前消毒手及外生殖器，手淫法将精液标本留在无菌器皿中。精液经密度梯度离心上游处理后，将加精后剩余精子采用Gmops（Vitrolife公司）细胞密度调整为5×106/ml，记录精子的活动能力，共收集样本20份精子作为本实验的冷冻样本。
1.2微量精子冷冻载体制备
将普通胚胎冷冻中空麦管剪去含有棉花一端，同时在另外一端剪去麦管管周一半，保留一半圆弧，长度为2cm，如图1A所示。
1.3自动微量精子冷冻装置制备
该自动冷冻装置按照功能，由三部分组成（1）液体回流系统：主要包括200ml容量的塑料输液瓶2个，由输液管将其联通（中间包含一个输液限速器），每个瓶口同时插一个排气针头，如图A部分；（2）承重平台：由2块边长为10cm塑料板组成，一块塑料板在距离四角边缘1cm开4个3mm×3mm小孔，另1塑料板在对应小孔位置分别立1直径略小于小孔的柱子，长度为10cm，将两塑料板通过柱孔套在一起，塑料板之间以弹簧隔开，将塑料板固定在支架上，如图B部分。（3）样本夹：样本夹一头安装一固定夹，可将样本夹子固定在带孔塑料板上，另一头安装一样本专用夹孔，夹孔数为5个，固定夹与夹孔呈Z字形，如图B部分。
微量精子冷冻装置结构图
1.4人类精子细胞冷冻
取离心上游后精子悬液100微升，将100微升精子冷冻保护剂（Vitrolife公司）缓慢加入到精子液滴中，充分混匀。将混合后精子悬液20微升，装载在冷冻载体圆弧部分，手工操作微量精子冷冻时将载体置于液氮蒸汽中（距离液氮面垂直高度约为5cm），缓慢下降载体，使精子样本逐渐接近液氮面，于5分钟时接触到液氮面，并将载体插入到液氮中，采用保存待解冻。自动微量精子冷冻方法：调整冷冻装置样本夹与液氮面的高度，将高度设定为5cm。将装载了精子样本的载体置于自动冷冻装置样本夹上，然后将水瓶中的全部液体转移到一个水瓶中，将含水水瓶置于输液架上，另一水瓶置于冷冻装置平台上。开启连接管阀门，由于重力作用，液体流向平台水瓶中，逐渐增加的重量压缩弹簧，使冷冻样本逐渐接近液氮面，最终插入液氮中，从而实现模拟人工微量精子冷冻过程，完成微量精子冷冻。
1.5人类精子细胞解冻
37℃预热含有培养基Gmops液滴的ICSI皿，上盖石蜡油，备用。将含有微量精子的冷冻麦管从液氮中取出，插入到预热好的ICSI皿的石蜡油中，待载体上的精子液滴融化后，将其与ICSI皿内的GMOPS液滴融合，倒置相差显微镜下观察精子活动情况。
1.6统计学分析
采用SPSS 11.5统计软件进行 统计学分析，均值比较采用t 检验。根据样本含量及统计分析方法以P<0.05作为有显著性差别的界值。
2 结果
精子冷冻前前向精子的比例为90.6%±5.1%，微量精子解冻后，混匀ICSI皿内的解冻滴，取10微升样置Makler精子计数板，镜下观察精子活动情况。自动冷冻解冻和手工冷冻解冻的精子中，前向运动精子比例分别为80.6%±7.1%和78.2%±6.1%，无统计学差异。
3 讨论
细胞冷冻（包括精子细胞）损伤主要包括以下几个方面：冰晶损伤、冷损伤、渗透压损伤及冷冻保护剂毒性。精子细胞作为人体一种特殊的细胞，由于其自身的细胞膜流动性以及含水量（约50%）等原因，使其对于冷冻损伤不敏感而具有较高的耐受性，即使在不含冷冻保护剂的条件下，精子在冷冻过程中细胞内不产生冰晶[5]。本研究模拟Peng报道的实验步骤，设计出自动冷冻装置，取得了良好的冷冻解冻效果，由于冷冻样本间距离液氮面相对距离能够高度保持一致，各冷冻样本见得差异能有效得到充值，由此该自动冷冻装置可以替代较为繁杂的手工劳动。有研究报道：在液氮熏蒸冷冻过程中，精子经历了温度休克期、潜热扩散期、冰晶形成期、再结晶期和保存期等5个阶段，精子冷冻的主要损伤为细胞外冰晶形成造成细胞内脱水及细胞内冰晶的直接机械损伤，导致精子内外环境中分子异常移动。人类精子在不同的冷冻阶段对降温速度存在不同要求，如人类精子对温度休克期具有较高的抵抗力，一般认为慢速（1~2℃/分钟）通过温度休克期极为理想，而在冰晶形成期，以5~7℃/分钟为最佳，过快容易导致细胞内冰晶的形成直接损伤细胞膜和细胞器，过慢细胞外首先结冰，造成细胞内外电解质浓度升高，导致精子渗透损伤[6]。在本自动冷冻装置中，由于缺少微量液滴温度探头，未能测量精子在自动冷冻过程中温度的实时变化情况，未能实现阶段性降温速度的实时控制，故有进一步提高和改进的空间。
参考文献：
1. Wilmut I，Polge C.The low temperature preservation of boar spermatozoa. 1. The motility and morphology of boar spermatozoa frozen and thawed in the presence of permeating protective agents.Cryobiology. 1977；14（4）：471-8.
2. Perloff WH，Sterinberger E，Sherman JK. Conception with human spermatozoa frozen by nitrogen vapor technic. Fertil Steril. 1964；15：501-4.
3. 张静静，章志国，贺小进，吴欢，曹云霞. 玻璃化冷冻与慢速冷冻对微量精子活动力和DNA完整性的影响中华医学会全国生殖医学学术会议，2013，34：533-536.
4. Peng QP1，Cao SF，Lyu QF. A novel method for cryopreservation of individual human spermatozoa. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2011；47（8）：565-72.
5. Sachenko，VE. Isachenko. Cryoprotectant-free cryopreservation of human spermatozoa by vitrification and freezing in vapor：effect on motility，DNA integrity，and fertilization ability. 2004 Biol Reprod 71（4）：1167-1173.
6. 于德新，尤国才. 冷冻与复温对人类精子的生物学影响. 中国男科学杂志，1988；03：174-177.
论文作者:罗树伟,喻乔,吴贤玲,黄启江,谢舜,毛增辉
论文发表刊物:《航空军医》2017年第6期
论文发表时间:2017/5/16
标签：精子论文; 微量论文; 液氮论文; 样本论文; 装置论文; 细胞论文; 冰晶论文; 《航空军医》2017年第6期论文;