一、p16真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制作用（论文文献综述）
戴薇[1]（2019）在《NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究》文中认为癌症是目前困扰人类健康、威胁人类生命的重大疾病之一。传统的手术切除、放疗、化疗和最新的免疫疗法已被用于癌症治疗,提高了病人的五年存活率,但由于不可避免的毒副反应使得疗效还与病人对于生命健康的期望相差甚远。NF-κB是一种序列特异性DNA结合型转录因子,通过与细胞核内DNA靶点结合,调控靶基因的表达,从而参与炎症反应、免疫应答以及细胞生长、分裂和凋亡等多种生理病理过程。NF-κB在各种癌症中过度活化,是抗肿瘤药物筛选和癌症治疗的优良靶点。由于NF-κB是一把“双刃剑”,传统的NF-κB活性抑制剂因其显着的毒副作用而未能成为临床药物。抑制从来不是解决问题的好办法,应采用因势利导的策略,创制新的肿瘤治疗技术。本研究发展了三种肿瘤基因治疗新技术,并探索了其生物医学研究领域的应用价值,主要研究成果包括以下:1.人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用研究发现,过度活化的NF-κB与肝炎和肝细胞癌（HCC）的发生密切相关,但其完整而精确的分子途径和机制目前还不清楚。本研究使用Ch IP-seq和RNA-seq高通量测序技术,在TNFα诱导的人HCC细胞系Hep G2细胞中共计鉴定出699个NF-κB直接靶基因（direct target gene,DTG）,包括399个激活基因和300个抑制基因。其中,216个基因（包括126个激活基因和90个抑制基因）是目前已经鉴定出的HCC基因标志物。比较TNFα诱导的Hep G2细胞、LPS诱导的THP-1细胞和TNFα诱导的He La细胞中NF-κB靶基因数目,仅有24–46个NF-κB靶基因由两种细胞系共有,表明本研究鉴定出的NF-κB DTG具有HCC细胞特异性。基因功能注释分析表明,Hep G2细胞中的NF-κB DTG主要富集在经典的NF-κB生物学过程,如免疫系统过程、压力反应、刺激反应、防御反应和细胞死亡,并且涉及MAPK、TNF、TGF-β、趋化因子、NF-κB和Toll样受体KEGG信号通路。部分NF-κB DTG也与丙型肝炎和乙型肝炎病毒密切相关。此外,82个NF-κB DTG编码的分泌蛋白是目前临床上已经使用的HCC生物标志物,如CCL2和DKK1。最后,通过Ch IP-q PCR和RT-q PCR实验证实,NFKB1、NFKBIA、CCL2、IL1A、IL1B、PTX3、NUDT7、EFNA5、ID4、GPC6、KLF15、DKK1、OAZ2和IGFBP3这14个基因是TNFα诱导的Hep G2细胞中NF-κB DTG。这些结果为进一步研究NF-κB相关的分子机制和HCC生物标志物诊疗技术的发展提供了有价值的基因信息。2.NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究转录因子NF-κB在各种肿瘤细胞/组织中过度活化,已经成为抗肿瘤药物研发和肿瘤治疗的优良靶点。正因如此,过去几十年发展了无数的NF-κB活性抑制剂,然而由于不可避免的毒副反应,没有一例抑制剂成为临床使用的药物。本研究中,利用NF-κB在肿瘤细胞中高度活化的生物学特性,发展了一种肿瘤细胞特异性基因疗法,即NF-κB激活的基因表达（NF-κB-activated gene expression,Nage）载体用于癌症治疗。Nage载体通过将NF-κB诱骗子序列（decoy）与最小启动子序列（minimal promoter）融合构成NF-κB特异性启动子（decoy minimal promoter,DMP）,DMP与肿瘤细胞内高表达的NF-κB结合,从而激活下游效应基因的表达。本研究首先使用Western-blotting方法验证了NF-κB p65蛋白在肿瘤细胞中特异性表达。随后以绿色荧光蛋白Zs Green作为效应基因,证实Nage载体可在肿瘤细胞中特异性表达效应基因,产生绿色荧光,而在正常细胞中不表达效应基因。随后,以CRISPR/Cas9作为效应基因,在靶向端粒重复序列的sg RNA（Tsg RNA）的引导下,Nage载体特异性地诱导多种肿瘤细胞死亡,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,而对正常细胞293T、MRC-5和HL7702不产生影响。最后,将表达Cas9-Tsg RNA的Nage载体包装进腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）中,构建肿瘤基因治疗载体AAV-Nage,通过静脉注射给药途径注入小鼠体内,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长。本研究发展的肿瘤细胞特异性基因疗法Nage载体为抗肿瘤药物研发提供了一种新思路。3.端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究癌症是由一系列表观基因突变引起的,以多种复杂形式存在的难以预防和治疗的疾病。端粒酶是真核细胞中负责端粒延长的一种RNA聚合酶。研究发现,端粒酶的活性在大多数正常细胞中被程序性关闭,而在90%的肿瘤细胞中被重新激活,使其成为癌症治疗中的重要靶点。目前,已开发出多种端粒酶活性抑制剂用于治疗癌症,但由于不可避免的毒副反应均已失败告终。本研究中,利用肿瘤细胞中端粒酶的活性发展了一种名为端粒酶激活的基因表达（telomerase-activated gene expression,Tage）系统用于治疗癌症。Tage系统由一段携带端粒酶可识别的3’粘性末端效应基因表达载体、表达d Cas9-VP64人工转录因子的表达载体和靶向端粒重复序列的sg RNA（Tsg RNA）组成。以CRISPR/Cas9作为效应基因,Tage系统有效地杀灭多种肿瘤细胞,包括Hep G2、He La、PANC-1、MDA-MB-453、A549、HT-29、SKOV-3、Hepa1-6和RAW264.7,但对正常细胞293T、MRC-5、HL7702和骨髓间充质干细胞（BMSC）不产生影响。更重要的是,酵母同宗接合切换内切酶（homothallic switching endonuclease,HO）切割产生的4碱基3?粘性末端可被细胞中端粒酶识别并延伸,为Tage系统体内应用奠定基础。以腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）作为基因载体,实现了Tage系统体内安全有效治疗肿瘤的目的。荷载Tage系统的AAV经静脉注射给药,显着地抑制小鼠体内肿瘤的生长,并且没有观察到明显的毒副反应。4.肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究癌症由不同分化等级和致瘤潜力的肿瘤细胞构成,是一种高度异质性、难以预防和治疗的疾病。癌干细胞或肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）是具有自我更新、多能分化和无限增殖潜能的肿瘤细胞亚群,对维持肿瘤细胞异质性和致瘤性起关键作用。CSC可抵抗常规抗癌药物,并在肿瘤转移和复发中发挥重要作用,使得抗肿瘤药物研发面临巨大挑战。本研究中,使用前期发展的两种肿瘤细胞特异性基因疗法,端粒酶激活的基因表达（Tage）系统和NF-κB激活的基因表达（Nage）载体24 h内有效地杀灭旺盛分裂的肿瘤细胞,残存细胞具有CSC自我更新增殖特性。q PCR检测发现,涉及上皮/间充质细胞转换、Wnt信号通路、细胞间粘附以及干细胞标志基因VIM、TWIST、p53、p16INK4α、p21、CD24、CD326、DLL4、JAG1、Notch1、MUC1、DACH1、CD133、CD44、ATXN1、BMP7、CXCR4、GATA3、JAK2、KLF4、LIN28a、LIN28b、MYCN、NANOG和SOX2,在残存肿瘤细胞中均高表达,表明Tage系统和Nage载体可在24 h内有效分离得到CSC。研究发现,NF-κB不仅在各种肿瘤细胞中高度活化,在CSC中也显示出高活性,使其有望成为针对CSC的肿瘤治疗靶点。将前期发展的新型NF-κB活性抑制剂,即NF-κB特异性启动子DMP调控的靶向Rel A的mi R533包装进腺相关病毒（AAV）中,构成肿瘤干细胞基因治疗载体AAV-mi R533。AAV-mi R533有效地杀灭Hep G2 CSC,感染病毒20 d后的CSC仍没有再生长增殖迹象。本研究为分离CSC和开发针对CSC的抗肿瘤药物提供了新方法。总之,本研究通过联合运用高通量测序技术、生物信息学技术和传统的分子生物学技术,鉴定出了肝癌细胞中NF-κB的结合靶点和靶基因,发展了三种肿瘤细胞基因治疗新技术—NF-κB激活的基因表达（Nage）载体、端粒酶激活的基因表达（Tage）系统和肿瘤干细胞基因治疗载体,这些基因技术在肿瘤基因治疗领域具有重要的应用价值。
许桂琴[2]（2017）在《GADD45G和USP16调控肿瘤细胞生长及相关机制研究》文中提出研究背景和目的:肝癌和肺癌是进展迅速、恶性程度很高的两种常见肿瘤,找到参与这些癌症发展的基因是目前肿瘤研究的热点。生长阻滞和DNA损伤诱导45G（Growth arrest and DNA damage-inducible 45G,GADD45G）是与细胞应激和DNA损伤相关的蛋白,在多种肿瘤中发挥着抑癌基因的作用。我们的前期工作表明,GADD45G诱导的细胞衰老的缺失是导致肝肿瘤发展的重要事件。然而,GADD45G导致细胞衰老和肿瘤生长抑制的精确机制仍然是模糊的。本文的第一部分为此展开了相关研究。去泛素化酶USP16可调节多种生物学过程,具有影响胚胎干细胞分化、造血干细胞生成等作用。但是,USP16在肿瘤发生、发展中的作用仍不十分清楚。在本文的第二部分研究中,我们探讨了USP16是否影响K-Ras驱动的小鼠肺肿瘤发生。实验结果:在第一部分研究中,利用诱导表达慢病毒系统（Tet-on）在肝肿瘤细胞中导入GADD45G表达载体,Doxycyclin处理诱导GADD45G表达后,肝肿瘤细胞发生衰老,同时,端粒酶的活性受到抑制,而其上游基因SIP1的表达上调;利用si RNA技术敲降SIP1后,在体外抑制了GADD45G诱导的细胞衰老以及IL-6、IL-8的m RNA水平,端粒酶的活性和细胞周期G1期阻滞有所回复,在体内逆转了GADD45G对肿瘤生长的抑制作用;使用MG132处理细胞,内源性的GADD45G和SIP1表达上调,并贡献于MG132诱导的细胞衰老;在GADD45G诱导的细胞衰老过程中,p38和JNK信号通路被激活,使用这两条通路的抑制剂处理细胞后,细胞衰老都明显被抑制,但只有阻断JNK通路,明显抑制SIP1的表达水平;Ch IP实验验证,在GADD45G表达情况下,JNK下游基因c-Jun能直接结合到SIP1的启动子区域;最后,经临床资料分析,GADD45G和SIP1在肝癌组织中低表达,两者呈现正相关关系。在第二部分研究中,我们发现在成纤维细胞IMR90和小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts,MEFs）中表达H-Ras V12导致USP16的蛋白水平增加;USP16缺失(USP16-/-)抑制K-Ras G12D诱导的细胞衰老,但同时造成细胞增殖能力降低;在SV40T和K-RasG12D共表达的MEFs中,USP16缺失也抑制细胞增殖;裸鼠体内成瘤实验表明,相对于K-Ras G12D/USP16+/+/SV40T-MEFs,K-Ras G12D/USP16-/-/SV40T-MEFs的成瘤能力显着降低,肿瘤体积明显减小。利用USP16条件性敲除小鼠和K-RasG12D诱导的小鼠肺肿瘤模型,在肺组织中敲除USP16可抑制小鼠肺肿瘤的生长,小鼠生存期延长。结论:在GADD45G诱导的肝肿瘤细胞衰老和抑制肿瘤生长的过程中,JNK介导的SIP1的活化在GADD45G诱导的肝肿瘤细胞衰老中发挥重要作用;SIP1的上调贡献于GADD45G诱导的对h TERT的抑制作用;在临床标本中,GADD45G和SIP1在肝癌组织中低表达,呈正相关关系。因此,GADD45G和SIP1功能下调在肝肿瘤细胞逃逸衰老以及肿瘤生长中发挥了重要作用。在USP16调控K-Ras活化诱导肿瘤发生的研究中,USP16缺陷抑制K-Ras G12D转化的鼠胚胎成纤维细胞的增殖,降低SV40T和K-Ras G12D共转化的鼠胚胎成纤维细胞的成瘤能力;USP16缺陷抑制K-Ras G12D诱导的鼠肺肿瘤的生长;提示USP16在K-Ras突变驱动的肺癌发生中发挥了重要作用。
朱华宇[3]（2013）在《miR-203对内皮细胞靶分子鉴定及其生物学功能的研究》文中提出microRNAs （miRNAs）是内源性的一系列微小非编码RNA，能特异性结合靶分子的3’非翻译区，抑制翻译或转录。近年来越来越多的证据显示miRNAs与多种疾病的发生发展有关。miRNAs在疾病中展现了分子标志物的潜力，也有可能成为基因治疗的新策略。血管生成在实体瘤生长和转移中具有重要作用。内皮细胞和间质细胞在此过程中以自分泌和旁分泌的形式分泌促血管生长因子，参与肿瘤侵袭，内皮细胞迁移和增殖以及肿瘤血管的生成。因此抑制促血管生成的细胞因子（包括FGF2）,可以作为抗血管生成的分子靶标。本研究首先构建含人源microRNA-203（miR-203）的慢病毒表达载体并制备重组慢病毒，感染人脐静脉内皮细胞系（HUVEC-12），观察其对细胞增殖，迁移和管腔形成的影响。我们利用通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测外源导入miR-203的表达情况，通过MTT法检测miR-203对HUVEC体外生长的抑制作用，利用划痕实验检测miR-203对HUVEC迁移的抑制作用。我们找到miR-203的一个新靶基因FGF2，通过实验证实miR-203通过靶向抑制FGF2表达能影响HUVEC-12的管腔形成能力。通过对FGF2的干涉实验发现和过表达miR-203的细胞株具有相似的生物学表形。之后，为了验证miR-203和FGF2在细胞管腔形成中的关系，我们在过表达miR-203的HUVEC-12细胞株中进行了FGF2的恢复实验，观察了细胞管腔形成的现象。综上所述，我们认为在HUVEC-12中miR-203通过靶向抑制FGF2抑制管腔形成的能力。肿瘤干细胞被认为是一类有着自我更新，多分化潜能和肿瘤生成能力的干细胞。而成体干细胞中起着自我分化作用的基因Bmi-1被认作是癌基因。据报道Bmi-1在体外实验中能诱导细胞分化和形成肿瘤。通过文献查找和生物信息学预测，我们找到了靶向Bmi-1的两个microRNAs。在另一个实验中，我们结合文献和利用生物信息学网站预测结果初步判断miR-203和miR-218在肿瘤干细胞中可能的下游靶基因为Bmi-1。我们构建了miR-203，miR-218和Bmi-1全长3’UTR的重组质粒。通过双荧光素酶报告基因实验发现这两个microRNA均能抑Bmi-1全长3’UTR的荧光素酶活性。我们构建了Bmi-1开放阅读框的真核表达重组载体，并在293T细胞中验证了其蛋白表达效率。我们的实验为下一步在肿瘤干细胞中研究microRNA和Bmi-1的关系打下了基础。在第一部分研究中构建的过表达miR-203的慢病毒载体，预测并验证了靶分子FGF2，在人脐静脉内皮细胞株中研究了miR-203的生物学功能。在第二部分研究中预测并验证了miR-203和miR-218的另一个靶分子Bmi-1。我们的工作为进一步探讨miR-203对肿瘤治疗的分子机制提供了理论基础。
朱晓西[4]（2011）在《pIRES2-EGFP-hIL-12-HSP70真核表达载体的构建及对7402肝癌细胞生长的影响》文中研究表明目的：构建真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL-12-HSP70,并观察其转染7402肝癌细胞后的表达情况及对7402肝癌细胞生长的影响,旨在获得同时具有hIL-12和HSP70活性的双功能融合蛋白分子。方法：应用聚合酶链反应（PCR）技术,从pBIl21-hIL-12质粒中扩增hIL-12基因,从pShuttle-CMV-HSP70质粒中扩增HSP70基因,应用基因定向重组技术构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL-12.pIRES2-EGFP-HSP70及pIRES2-EGFP-hIL-12-HSP70,并通过PCR、酶切和DNA测序进行鉴定。用Lipofectamine2000将以上各重组真核表达载体及pIRES2-EGFP（空白对照）质粒转染7402肝癌细胞,同时设空细胞组,各组分别命名为7402/hIL-12,7402/HSP70,7402/hIL-12-HSP70,7402/PE,7402/0。通过倒置荧光显微镜检测各组细胞的绿色荧光表达情况；Real-t- ime PCR检测各重组外源基因在7402肝癌细胞中的表达差异；MTT法检测细胞生长情况；用AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。结果：真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL-12.pIRES2-EGFP-HSP70及pIRES2-EGFP-hIL-12-HSP70构建成功,通过PCR扩增、酶切及DNA测序证实各插入基因及联合基因的大小、位置、方向均正确无误；各转染组细胞在转染后24h、48h、72h均可在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光；Real-time PCR证明各重组外源基因在已转染重组真核表达载体的7402肝癌细胞中均有表达。MTT法结果显示7402/hIL-12-HSP70组细胞的细胞抑制率最高,各处理组细胞48h抑制率明显高于24h和72h,7402/hIL-12-HSP70组细胞的细胞抑制率与7402/hIL-12组、7402/HSP70组、7402/PE组的差异均有显着性（P<0.05）.AnnexinV-FITC/PI双染法结果显示7402/hIL-12-HSP70组细胞较其余各组细胞凋亡数量增多,7402/hIL-12-HSP70组细胞凋亡数量与7402/hIL-12组、7402/HSP70组、7402/PE组的差异均有显着性（P<0.05）。结论：成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL-12.pIRES2一EGFP-HSP70及pIRES2-EGFP-hIL-12-HSP70；各重组真核表达载体均能转染进7402肝癌细胞并有效表达；联合hIL-12和HSP70基因能明显地促进7402肝癌细胞凋亡,并具有协同增强作用。
柳洁,田海文,谢正兰,吴尚辉,饶利兵[5]（2011）在《p16基因对人肝癌细胞的生长抑制作用的初步研究》文中进行了进一步梳理目的探讨抑癌基因p16对肝癌细胞生长的抑制作用。方法将p16 cDNA亚克隆至pcDNA3.1真核表达载体上,并经脂质体介导转染至人肝癌细胞株SMMC-7721。用MTT法和Western blot分析转染细胞的生长情况。结果成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-p16,转染pcDNA3.1-p16的SMMC-7721细胞生长速度受到明显抑制;经Western blot证实,转染后有外源p16蛋白的表达,且伴随Bax上调,Bcl-2和cIAP2的下调。结论重组pcDNA3.1-p16质粒能在人肝癌细胞SMMC-7721内表达,且能抑制SMMC-7721的生长,其机理与诱导肿瘤细胞凋亡相关。
丁睿[6]（2010）在《Id-1与HBx在乙肝相关性肝癌成瘤过程中相互作用的研究》文中研究表明【背景】原发性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球发病率第五位的常见恶性肿瘤。在亚洲和大洋洲国家,特别是中国大陆,肝癌发病的主要诱因是慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B,HBV）感染。对肝癌的早期诊断是提高肝癌患者疗效和预后的关键。目前包括肝癌切除术和肝移植在内的外科手术疗法仍是治疗早期肝癌的首选。然而,只有不到30%的患者能够在早期被诊断出肝癌并接受合适的治疗,大多数进展期患者由于治疗不及时而无法获得较理想的预后。由于我国众多的乙肝病毒携带者是肝癌的危险人群,更要求我们在早期发现并预测肝癌方面进行的研究,以期获得更好的肝癌的肿瘤标记物和预测因子。乙肝病毒感染在肝癌的发病过程中起到了重要作用,在中国大陆,约80%以上的肝癌患者伴随着慢性乙肝病毒的感染。即便是HBV的隐匿性感染者,甚至是乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）在体内已被廓清后的曾经感染者,其肝癌的发病风险仍高于普通人群。乙肝病毒可以整合入宿主基因组,并直接或间接的促进肝癌的发生。在这个过程中,乙肝病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein,HBx protein）起到了重要的促进作用。HBx是由HBV-DNA中最短的开放读取框所编码的。它增强了HBV的转录,并激活了癌基因、细胞因子和生长因子等不同细胞的基因转录过程。HBx和其它多种因子如p53、DDB1、Caspase3和蛋白酶体亚单位等相互作用,促进细胞转化。在肝癌患者血清和肝癌组织中均可检测到高水平HBxAg和抗-HBx的表达。Id蛋白即分化抑制蛋白或DNA结合抑制蛋白（Inhibitor of Differentiation and/or DNA-binding Protein）。由于Id蛋白缺少DNA结合结构域,它与其它碱性螺旋-环-螺旋转录因子（bHLH）结合后可形成没有DNA结合能力的异二聚体,起到了负性调节作用。作为Id蛋白家族的一员,Id-1在细胞分化过程中起到了重要的作用,它在包括肝癌在内的多种人类肿瘤中高表达。不受控制的Id-1蛋白表达将促进肿瘤细胞增殖、分化抑制、并刺激肿瘤血管生成及诱发基因组失稳。Id-1表达水平往往和肿瘤的高侵袭性、去分化程度和较差的临床预后相关。高表达的Id-1可以介导肝癌细胞的增殖,并且可成为预测慢性肝炎肝硬化患者肝癌发生风险的指标。Id-1可能在肝癌形成过程中的发挥重要作用,而它与HBV之间的关系值得进一步深入研究。【目的】（1）检测Id-1和HBx蛋白在乙肝相关性肝癌组织中的表达情况。（2）分析乙肝相关性肝癌患者临床病理学特征与Id-1及HBx蛋白表达水平的相关性。（3）检测Id-1和HBx在肝癌细胞中的共定位情况。（4）检测HBx对肝癌细胞系中Id-1表达水平的影响。（5）构建人Id-1干扰慢病毒载体。（6）人Id-1干扰慢病毒载体对肝癌HepG2细胞的感染验证。【方法】（1）对获得的96例乙肝相关性肝癌标本进行免疫组化染色,并对Id-1和HBx蛋白的染色结果进行分级。（2）借助SPSS软件,统计学分析Id-1和HBx的蛋白表达水平与肝癌临床病理学特征间的相关性以及Id-1的表达强度和乙肝相关性肝癌患者预后之间的关系。（3）用激光共聚焦免疫荧光染色法研究Id-1和HBx在肝癌细胞中的共定位情况。（4）Realtime-PCR和Western Blot分别检测Id-1 mRNA和蛋白在肝癌细胞系HepG2、HepG2.2.15、SMMC7721、FHCC98和肝细胞系HL7702中的表达情况。（5）Realtime-PCR和Western Blot检测Id-1蛋白在转染入HBx的肝癌HepG2-X和转染空质粒的HepG2-PC细胞内的表达情况。（6）采用荧光素酶报告基因系统检测Id-1启动子序列在HepG2-X和HepG2-PC细胞内的表达情况。（7）筛选获得效率最高的Id-1 RNA干扰序列并构建人Id-1干扰慢病毒载体。（8）验证人Id-1干扰慢病毒载体对HepG2细胞中Id-1的沉默效果。【结果】（1）免疫组化染色发现,在96例乙肝相关性肝癌标本中,Id-1高表达率为64.6%,HBx的高表达率为74.0%。且Id-1的表达强度与HBx的表达强度正相关。（2）Id-1高表达水平与患者的血清高HBsAg水平、较差的肿瘤分化程度、门静脉侵犯、淋巴结转移及Child B/C级之间关系有统计学意义;Id-1高表达组的无瘤生存率和总生存率均较Id-1低表达组更差。（3）成对免疫组化染色和激光共聚焦免疫荧光染色发现Id-1和HBx在肝癌细胞中存在共定位现象,二者主要表达在细胞质和细胞核中。（4）经Realtime-PCR和Western Blot发现Id-1的mRNA和蛋白水平的表达强度在肝癌细胞系HepG2、HepG2.2.15、SMMC7721和FHCC98中均显着高于肝细胞系HL7702。（5）在肝癌HepG2-X中,Id-1的mRNA和蛋白表达强度均高于转染空质粒的HepG2-PC细胞。（6）报告基因检测发现在HepG2-X细胞中被激活的Id-1启动子的表达强度高于HepG2-PC细胞。（7）成功筛选并构建了人Id-1干扰慢病毒载体Id1-RNAi-LV,经鉴定病毒滴度为2.0×10E9 TU/mL;在HepG2细胞中,该载体对HepG2细胞中Id-1的mRNA和蛋白的表达均有明显抑制效果,抑制效率为61.2%。【结论】（1）乙肝相关性肝癌标本中,Id-1和HBx均有表达,并且二者存在共定位现象。（2）Id-1蛋白的表达水平与乙肝相关性肝癌患者血清HBsAg水平、肿瘤分化程度、门静脉侵犯、淋巴结转移及Child分级等肿瘤恶性表型相关;Id-1高表达组患者有较差的预后。（3）Id-1在多种肝癌细胞系中均有表达,且其表达强度高于正常肝细胞系。（4）被转染入HepG2细胞中HBx,可提高Id-1启动子活性并使Id-1在mRNA及蛋白水平表达升高。（5）成功构建了Id-1干扰慢病毒载体Id1-RNAi-LV,并对肝癌HepG2细胞系中的Id-1基因有mRNA和蛋白水平的沉默效果。（6）综上Id-1可以作为乙肝相关性肝癌患者一个有用的预后指标。乙肝相关性肝癌标本中高表达的Id-1至少部分的受HBx表达所影响。构建成功的人Id-1干扰慢病毒载体可用于对Id-1参与肝癌机制的进一步研究,并可能成为新的治疗肝癌的分子靶向。
黄锦[7]（2007）在《应用RNAi技术沉默遗传印记基因PEG10治疗肝癌的实验研究》文中认为目的肝癌是全球性高度恶性肿瘤,预后很差,死亡率高。目前,外科手术包括肝部分切除术和肝移植仍是治疗肝癌的有效手段,但是适合手术切除的患者仅有25%,切除后五年生存率也仅为36～50%,五年复发率高达85%。非手术治疗如经动脉导管化学栓塞治疗（TACE）,经皮酒精瘤内注射（PEI）,放疗,射频消融治疗（RFA）微波凝固治疗（MCT）,激光热疗,中医中药等,方法虽然很多,但均不能达到令人满意的疗效。因此,对于肝癌尤其是中晚期肝癌患者,探索更为有效的治疗手段至关重要。肿瘤发病机制及靶向基因治疗是近年来研究的热点,发现了许多与肝癌发病相关的靶分子,但缺乏高度的特异性。因此寻找参与绝大多数肝癌发病的关键性特异分子靶是现阶段肝癌基因治疗迫切需要解决的问题。遗传印记基因PEG10是来源于病毒反转录转座子的父系表达的印记基因。本实验室的前期研究结果显示,PEG10在肝癌组织中的表达具有比AFP更高的特异性。本实验中检测PEG10基因mRNA和蛋白在包括肝癌、胰腺癌、大肠癌、乳腺癌及宫颈癌等多种人肿瘤细胞株中的表达情况,并采用RNAi技术,设计针对PEG10基因的siRNA真核表达载体,研究其对PEG10基因的抑制作用及在体内外对肝癌生长的影响,为探讨PEG10作为肝癌基因治疗的新的特异性靶点奠定实验基础。方法RT-PCR和Western Blot分别检测PEG10基因mRNA和蛋白在人肝癌细胞株、胰腺癌细胞株、大肠癌细胞株,乳腺癌细胞株及宫颈癌细胞株中的表达情况。根据PEG10基因cDNA序列,设计针对PEG10基因的4个siRNA靶序列,将其插入H1启动子下游,克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo中,进行酶切鉴定和DNA测序鉴定。将构建好的4个重组质粒分别命名为psiRNA1, psiRNA2, psiRNA3和psiRNA4,通过脂质体瞬时转染肝癌细胞后,RT-PCR和实时定量PCR,检测其对肝癌细胞PEG10基因mRNA表达的影响,Western Blot检测转染后PEG10蛋白表达的改变,同时检测转染后细胞周期相关因子包括Cyclin （cyclin D）, CDKI （p21, p27 and p16）, CDK （CDK4）和E2F1的mRNA和蛋白表达情况。MTT法、流式细胞仪和激光共聚焦检测转染后的肝癌细胞的增殖,凋亡及细胞周期变化。在体外抗肝癌研究的基础上,应用培养的HepG2细胞建立人肝癌荷瘤裸鼠模型,在肝癌细胞接种后第14天分别将空载体和重组质粒psiRNA2瘤内多点注射进行治疗,观察肿瘤大小变化,组织形态学及超微病理改变。结果肝癌细胞、胰腺癌细胞和大肠癌细胞中PEG10基因mRNA和蛋白均高表达,而乳腺癌细胞和宫颈癌细胞中未检测到PEG10基因mRNA和蛋白的表达。成功构建了4个特异性siRNA表达载体,分别转染肝癌细胞后,均不同程度地抑制了肝癌细胞PEG10基因mRNA的表达,转染后48小时psiRNA2抑制效率最高。同时CDKI（p21和p16）mRNA表达升高, E2F1, Cyclin和CDK表达降低。Western Blot结果显示PEG10和CDKI蛋白水平升高,而E2F1, Cyclin和CDK蛋白水平降低。肝癌细胞的生长也明显受到抑制（P<0.05）,而乳腺癌细胞和宫颈癌细胞生长未受影响。流式细胞仪分析转染后的细胞在细胞周期各时相的分布发生明显改变,G0/G1期细胞增多,发生G1/S期阻滞,大量HepG2细胞凋亡。激光共聚焦显微镜观察到三种肝癌细胞典型的凋亡细胞形态。以皮下接种培养肝癌细胞的方法成功建立人肝癌荷瘤裸鼠模型,经psiRNA2、空质粒和生理盐水多点瘤内注射,psiRNA2治疗组肿瘤生长受到明显抑制,与生理盐水组和空质粒组比较有明显差异（P<0.001）,抑瘤率明显高于其他两组,电镜下可见明显的细胞凋亡。结论PEG10基因在肝癌细胞中高表达,在消化系肿瘤以外的其他肿瘤如乳腺癌和宫颈癌细胞中不表达。成功构建针对PEG10的4个真核表达载体,其中psiRNA2的抑制效果最佳,转染肝癌细胞后可明显降低PEG10基因mRNA和蛋白的表达,抑制肝癌细胞的生长,诱导细胞凋亡,影响肝癌细胞周期的分布,使肝癌细胞发生G1/S期阻滞,同时对裸鼠肝癌移植瘤生长有抑制作用。因此,靶向PEG10的siRNA真核表达载体可能成为肝癌基因治疗的新手段。
史宪杰[8]（1999）在《MTS1在肝细胞癌中的表达及其对人肝癌细胞SMMC-7721生长抑制作用的研究》文中研究指明肝癌是中国最常见恶性肿瘤之一，其发病率居我国恶性肿瘤发病率的第三位，死亡率居第二位。肝癌的手术切除复发率高，放疗和化疗敏感性低，免疫治疗和介入治疗效果均不理想。随着分子生物学的发展，肝癌的治疗已进入分子水平，目前的研究显示肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活以及细胞周期调节失控密切相关。肿瘤的病因治疗主要是针对癌基因和抑癌基因的异常，抑制、阻断癌基因的表达和恢复抑癌基因的功能是基因治疗的主要策略。 多肿瘤抑制基因（Multiple Tumor Suppressor1，MTS1）是由Kamb及David Beach分别领导的科研小组发现的能直接作用于细胞周期的新型抑癌基因。由于其在多种肿瘤中发现有缺失和／或点突变，被认为是一个颇具吸引力的抑癌基因，具划时代意义。现已明确MTS1位于人类第九号染色体短臂（9P21）上，由三个外显子和两个内含子组成，其编码蛋白为P16（故又称P16基因）。有关P16作用于肝细胞癌的研究报道并不多见。 本文旨在探讨抑癌基因p16的表达与肝细胞癌发生、发展的关系，明确其在肝癌的诊断与预后方面的应用价值，为肝细胞癌的基因治疗提
张蕾[9]（2007）在《聚丙交酯乙交酯纳米粒（PLGA-NP）介导P16-P53基因联合抑制人肝癌细胞的实验研究》文中提出研究背景：目前肝癌临床常规治疗效果不佳，基因治疗的问世开辟了肝癌治疗的新途径。针对个别癌基因或个别抑癌基因治疗肝癌只能缓解肝癌发生过程中的某一步骤，并不能达到根治肝癌的目的。抑癌基因治疗是将正常的肿瘤抑制基因导入肿瘤细胞可代替和补偿缺陷的基因，以抑制肿瘤的生长，这是从根本攻克肿瘤的关键环节。p16和p53基因是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因。利用基因转染技术将抑癌基因p16、p53转染至肿瘤细胞以感染肿瘤细胞，可以在多个环节上组织肝细胞增殖与癌变，达到抑制肿瘤生长的目的。而DNA进入细胞需选择适当的基因转运载体系统，纳米颗粒材料的选择是成功进行纳米基因转运和治疗的关键。聚丙交酯乙交酯（PLGA）是用于控制多种药物释放成功的载体之一，无毒、可以生物降解、生物相容，是较理想的纳米载体材料，目前研究较少。第一章：构建p16与p53基因融合表达载体pcDNA16-53目的：构建基因融合表达载体pcDNA16-53方法：将p16A质粒的酶切鉴定、PMAMne053质粒和pcDNA3.1质粒分别进行酶切鉴定后，混合并加入T4连接酶和T4连接buffer，16℃混合12hr后可得pcDNA16-53，再行酶切鉴定证实。结果：pcDNA16经酶切、补平后能与p53基因片段进行平端连接，连接后为pcDNA16-53，大小8.0kb，方向为正向插入。第二章聚丙交酯乙交酯（PLGA）纳米粒的制备目的：制备聚丙交酯乙交酯（PLGA）纳米粒。方法：制备PLGA纳米粒，并测定其粒径和粒径分布、浊点、包封率和对细胞的毒性检测。结果：1．聚合物分子量小于15000时，可得到高产率PLGA纳米粒。但PLGA纳米粒产率随分子量增加缓慢降低。纳米粒产率均随乙醇体积分数的增大而提高。2．制备的纳米粒平均粒径均小于182nm，乙醇可影响纳米粒粒径。3．随着质粒DNA浓度增高，纳米粒包封率增加；但是PLGA种类对包封率的影响不大。4．PLGA-NP在低于100ng／μl的浓度下对HepG2细胞无明显的细胞毒性，在低于200 ng／μl的浓度下对3T3细胞无明显的细胞毒性。而当纳米粒浓度继续增加时，细胞毒性效应则急剧增强。第三章：PLGA-NP与PcDNAl6-53的连接目的：将pcDNA16-53与PLGA纳米粒进行连接，制备出PLGA-pcDNA16-53纳米粒。并分析其DNA结合效率，对所结合质粒DNA的保护作用以及评价其体外基因转运效率。方法：制备PLGA-pcDNA16-53纳米粒。测定PH值对DNA结合能力的影响，PLGA-NP与DNA结合的凝胶阻滞实验和DNA沉淀实验；通过PLGA-NP的DNaseI保护试验和血清保护试验判断其对所结合的质粒DNA的保护作用；用绿色荧光蛋白报道基因pEGFP-N1表达质粒评价其体外基因转运效率。结果：1．在中性（pH=7）条件下，DNA结合能力最强；当纳米粒与DNA比例达10：1时，DNA几乎完全结合到PLGA-NP上，结合效率达92％。2．PLGA-NP纳米粒中的DNA经DNaseⅠ消化1小时后或胎牛血清消化8小时，仍然保持结构的完整、未被降解，而裸DNA在同样条件下即被完全降解。3．PLGA-NP系统能有效转运外源质粒DNA进入HepG2和3T3细胞，表达EGFP蛋白。其转运效率可达约48％，略高于SuperFectTransfection Reagent转染试剂的转运效率（43％）。第四章：PLGA-pcDNA16-53进行肝癌基因治疗的实验研究目的：通过体外实验和体内实验研究PLGA-pcDNA16-53对肝癌的治疗作用。方法：1．体外实验：肝细胞癌HepG2细胞株随机分为A组：RPMI-1640对照组、B组：PLGA空白纳米粒组、C组：PLGA-pcDNAl6-53组。质粒抽提并转化至对应细胞组，Western blotting蛋白印迹法检测肝癌肿瘤细胞内源性p16、p53基因的表达，MTT法检测转染质粒后的细胞生长增殖的变化并通过光镜、电镜及DNA凝胶电泳观察细胞凋亡的情况。2．体内实验：HepG-2肝癌细胞皮下接种裸鼠，建立皮下肝癌移植瘤模型。将16只裸鼠随机分成2组，每组8只，分为实验组(接种HpeG2后24hr内每只裸鼠在接种部位皮下缓慢注射100μg（200μl）PLGA-pcDNA16-53，3天一次，连续5周；对照组肿瘤接种部位皮下注射等量生理盐水。观察肿瘤体积变化和成瘤率。5周后处死，Westernblotting蛋白印迹法检测肿瘤组织p16、p53表达，流式细胞技术检测组织细胞凋亡。结果：1．Western blot检测结果显示C组细胞内可检出16KD大小的p16和53KD大小的p53条带。A组和B组细胞内无蛋白条带。2．A组细胞抑制率为0.34±0.06，B组为0.41±0.04，C组为0.86±0.07；与A组和B组比较，C组肿瘤细胞的抑制作用明显（p＜0.05）。3．光镜和电镜下均可以看到C组细胞表现为明显的凋亡状态，DNA凝胶电泳可见到特异性条带，而A组和B组细胞均未见明显凋亡改变及特异性条带。4．裸鼠均在2周左右成瘤，成瘤率100％。实验组裸鼠瘤重0.84±0.19，明显低于对照组1.08±0.15（p＜0.05）。且经PLGA-pcDNA16-53局部注射后，肿瘤抑制率达53.8％。实验组裸鼠成瘤时间超过2周，迟于对照组。5．Western blot检测结果显示实验组肿瘤组织内可检出16KD大小的p16和53KD大小的p53条带。对照组未检测出蛋白条带。6．实验组小鼠平均凋亡率为（11.33±3.48）％，对照组小鼠平均凋亡率为（3.07±0.29）％，实验组小鼠平均凋亡率高于对照组小鼠（p＜0.05）。结论：1．PLGA-NP在中性（pH=7）条件下，DNA结合能力最强；纳米粒与DNA比例达10：1时，结合效率高，无细胞毒性。2．PLGA-NP与PcDNAl6-53连接制备的PLGA-pcDNA16-53纳米粒，具有很好的抗核酸酶和抗血清消化能力。3．PLGA-NP能有效将p16、p53基因转入HepG2细胞，并使其在细胞内正常表达。4．转染pcDNA16-53明显抑制细胞活力，光镜和电镜下均可以看到细胞表现为明显的凋亡状态，DNA凝胶电泳可见到特异性条带。5．经PLGA-pcDNAl 6-53局部注射后，组织可表达p16和p53，肿瘤生长被抑制，组织出现凋亡细胞
季国忠[10]（2007）在《转化生长因子β1-Smad信号转导通路在肝细胞性肝癌发生发展中的作用机制研究》文中提出转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族是由一类结构和功能相关的多肽生长因子亚家族组成，包括TGF-βs、激活素、抑制素、骨形态发生蛋白等。广泛存在于多种生物的各种组织中，参与细胞增殖分化、胚胎发生、血管形成、肿瘤发生、细胞外基质形成、骨骼形成与重建等多种生物学事件。TGF-β作用于效应细胞的信号转导主要通过激活Smad通路实现。近年来，TGF-β1-Smad信号通路在恶性肿瘤中的研究是肿瘤信号转导领域的一大热点。Smad4是TGF-β1-Smad通路信号转导的中枢环节，哺乳动物Smad4最初在胰腺癌的研究中被发现，也被称为DPC4（deleted in pancreatic carcinoma locus 4），其缺失和突变率高达50％，已有研究显示Smad4扮演抑癌基因的作用。目前对TGF-β1-Smad4在胰腺癌中的作用已做了较为深入的探讨，但是在肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤中的研究仍较少，而且对于肝癌，包括我们已有研究在内的国内外不少研究结果差别较大，有的甚至相反。另外，该通路下游基因的调控情况尚不完全清楚，而Smad4非依赖通路的存在和多条通路间复杂的相互作用现象更是为癌症发生机制增添了无限的神秘。信号通路上各点或各因子之间的关系，如同浩瀚宇宙中各天体之间的关系一样，非常复杂，使这种我们暂且称之为“微天体”之间关系（relationship between microheavenly bodies）的研究较为艰难。为了探讨TGF-β1-Smad信号转导通路在肝细胞性肝癌（HCC）发生发展中的作用及机制，本课题在临床病理研究的基础上，利用Smad4在TGF-β1-Smad通路中处于中枢环节的机制，通过RNA干扰技术沉默其表达，观察对细胞生物学特性的影响及信号转导通路中其他相关基因的变化，这些结果将为阐明肝细胞癌中TGF-β1-Smad信号转导途径的功能提供重要的理论依据，并可能为肝细胞癌的生物学治疗提供新的靶点。目的探讨TGF-β1-Smad信号转导通路在肝细胞性肝癌形成中的作用及其可能机制。为进一步深入了解肝细胞癌的发生、发展过程并为其分子诊断和基因治疗提供新的科学依据。方法（1）利用免疫组化技术，分别检测36例肝癌组织和癌旁肝组织中TGF-β1、转化生长因子βⅡ型受体（TβR-Ⅱ）、核转录因子κB（NF-κB）、Smad4及Smad7蛋白的表达；观察TGF-β1和TβR-Ⅱ、NF-κB、Smad4及Smad7蛋白表达之间的关系。另外，鉴于Smad4在TGF-β1-Smad信号通路中处于的中枢地位，为确证肝癌组织中Smad4的表达，有利于后续研究，我们进一步提取了患者肝癌组织和癌旁组织的总RNA与总蛋白，以及正常肝细胞系L02和肝癌细胞系SMMC-7721的总RNA与总蛋白，体外进行RT-PCR和Western blot分析Smad4基因的表达。（2）利用RNA干扰（RNAi）技术，构建Smad4 RNAi真核表达载体：即针对Smad4基因，设计、合成3对编码发夹RNA（shRNA）的寡核苷酸序列，退火后分别将其克隆入pGCsi-H1／Neo／GFP质粒，酶切、测序鉴定。脂质体法转染293工具细胞。72小时后实时荧光定量PCR检测Smad4基因表达的特异性抑制效率。（3）根据已筛选确定的Smad4基因RNAi有效靶序列，合成相应shRNA的寡核苷酸序列，退火形成双链DNA，与经Mlu I和Cla I酶切后的pLVTHM载体（含H1启动子和绿色荧光蛋白GFP）连接产生Smad4 RNAi慢病毒载体LT32，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。用LT32、pCMV-dR8.74和pMD2G三质粒共转染293T包装细胞，包装产生慢病毒，根据293T细胞中GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。再以包装产生的慢病毒颗粒感染肝癌SMMC-7721目的细胞，通过检测GFP的表达确定感染效率。（4）为了进一步探讨Smad4基因沉默对TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞生物学性状的影响，将SMMC-7721细胞分为对照组（简称CTL组）、转染Smad4 RNAi相应阴性对照病毒载体组（简称LTN组）和转染Smad4 RNAi病毒载体组（简称LT32组），分别用100 ng／ml TGF-β1进行处理后进行以下检测：①以台盼兰排斥法进行活细胞计数绘制的细胞生长曲线和MTT检测结果评价细胞增殖情况；②通过PI染色与TUNEL染色法检测细胞凋亡的发生情况；③SMMC-7721细胞体外侵袭能力的测定在Transwell小室中进行；④利用RT-PCR与Western blot分别检测与细胞增殖、凋亡及侵袭能力相关的基因表达，包括p16、p21、p53、caspase 3、MMP-2、MMP-9及VEGF等，以探讨这些基因与TGF-β1-Smad通路在信号转导过程中的关系。结果（1）临床病理观察：肝癌组织TGF-β1和Smad7表达明显高于癌旁组织；但TβR-Ⅱ和Smad4表达明显低于癌旁组织。肝癌组织中NF-κB和TGF-β1的表达呈高度一致性。这些结果表明：在肝癌组织中，TGF-β1-Smad信号转导通路上主要因子TGF-β1、TβR-Ⅱ、NF-κB、Smad4及Smad7蛋白表达均有异常，提示它们可能在肝细胞癌的形成中发挥重要作用；肝癌组织中TGF-β1抑制作用的减弱可能是由于TGF-β1-Smad信号转导通路上TGF-β1的受体（如TβR-Ⅱ）和受体后因子（如Smad4和Smad7）异常所致；NF-κB可能在介导TGF-β1的活化或产生中发挥一定的作用。另外，对患者肝癌组织和癌旁组织以及正常肝细胞系L02和肝癌细胞系SMMC-7721中Smad4的表达分析显示肝癌组织与相关细胞系中Smad4基因mRNA与蛋白的表达均低于癌旁组织与正常肝细胞系，进一步证实Smad4基因表达的下调在肝细胞性肝癌的发生中可能发挥重要的作用。（2） Smad4 RNA干扰靶序列的设计与表达载体的构建：针对Smad4基因（NCBI：NM005359）的shRNA序列设计采用Ambion公司的网上设计软件进行（www.ambion.com），并blast比较分析，排除可能的偏靶效应。在筛选出3条特异性序列后，根据所选择的shRNA序列合成两条相应的DNA寡核苷酸，退火形成双链DNA后将其接入pGCsi-H1／Neo／GFP质粒进行重组转化。重组后载体分别利用HindⅢ和BamHⅠ双酶切进行鉴定，并且DNA测序进一步证实小干扰RNA（siRNA）序列正确并被准确克隆入pGCsi-H1／Neo／GFP载体。脂质体法进一步将载体转染293工具细胞，72小时后，实时荧光定量PCR检测结果表明3种重组载体psiSmad4-1、psiSmad4-2和psiSmad4-3分别对293细胞中Smad4基因mRNA表达的特异性抑制率为39.0％、8.8％和73.8％，表明质粒介导的RNAi能够抑制Smad4基因的表达，其中以psiSmad4-3的抑制效率最高，Smad4基因shRNA表达载体成功构建。（3） Smad4 RNAi病毒载体的构建与病毒包装纯化：将已验证有效的Smad4 RNAi靶序列3进一步克隆到病毒表达载体中。在合成Oligo DNA后，经体外退火形成双链DNA。然后与经Mlu I和Cla I酶切后的pLVTHM载体进行连接转化。PCR和测序证实Smad4 shRNA寡核苷酸链序列正确插入病毒表达载体中。进一步包装慢病毒，感染目的细胞。实验结果显示病毒载体对SMMC-7721细胞的感染效率在85％以上，此时Smad4蛋白表达的抑制效率达60％，表明Smad4基因shRNA慢病毒载体成功构建。（4） Smad4基因沉默对TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞增殖抑制作用影响：利用细胞计数法绘制细胞生长曲线和MTT检测法评价肝癌SMMC-7721细胞的生长情况。SMMC-7721细胞在TGF-β1的诱导下，细胞生长速度减慢，出现了明显的增殖抑制现象；转染Smad4 RNAi相应的阴性对照病毒载体LTN，对SMMC-7721细胞的增殖没有明显影响，并且对TGF-β1诱导的细胞增殖抑制效应也未产生明显影响；而当细胞转染Smad4 RNAi病毒载体LT32后，TGF-β1诱导细胞增殖抑制作用被显着削弱，提示TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞增殖抑制作用受Smad4表达的影响，其信号转导为Smad4基因依赖性的。另外，我们还发现在转染阴性对照病毒载体LTN对SMMC-7721细胞的增殖没有明显影响的情况下，转染Smad4 RNAi病毒载体LT32却引起SMMC-7721细胞生长减慢，提示下调Smad4的表达能够抑制SMMC-7721细胞的增殖。（5）TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞增殖抑制过程中p16与p21的表达变化：p16与p21为重要的细胞周期调控基因，在细胞周期调控中阻止细胞由G1期进入S期，防止细胞过度增殖。因此，我们进一步检测了在TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞增殖抑制过程中p16与p21基因的作用及其与TGF-β1-Smad通路的关系。结果显示，TGF-β1处理肝癌SMMC-7721细胞36小时，p16的表达出现明显上调，增加了近55％；转染Smad4 RNAi相应的阴性对照病毒载体LTN，对SMMC-7721细胞中p16的表达没有影响，且对TGF-β1诱导p16表达的上调也未产生明显影响；SMMC-7721细胞转染Smad4 RNAi病毒载体LT32后，虽未对p16的表达产生影响，但TGF-β1诱导的p16表达的上调则几乎被完全抑制，表明TGF-β1诱导的SMMC-7721细胞生长抑制作用与p16的表达上调有关，p16可能作为Smad4的下游调控基因，与Smad4一起参与了TGF-β1的信号转导过程。而对于SMMC-7721细胞，无论是利用TGF-β1进行诱导，还是沉默Smad4基因，p21的表达均未发生明显变化，表明在TGF-β1诱导SMMC-7721细胞生长抑制的信号转导过程中p21可能并未作为Smad4的下游靶基因发挥重要作用。（6） Smad4基因沉默对TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡作用的影响：利用PI染色与TUNEL染色法检测细胞凋亡情况。结果显示TGF-β1处理肝癌SMMC-7721细胞36小时，诱导近22％细胞发生凋亡；转染Smad4 RNAi病毒载体LT32和相应阴性对照病毒载体LTN，均未见SMMC-7721细胞发生明显的凋亡现象；转染LTN病毒载体也未对TGF-β1诱导的SMMC-7721细胞凋亡产生明显影响；而当细胞转染LT32病毒载体后，TGF-β1诱导的SMMC-7721细胞凋亡则几乎被完全抑制，从22％下降到5％，说明TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡作用受Smad4表达的影响，其信号转导为Smad4基因依赖性。（7） TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡过程中p53表达与caspase 3活性的变化：TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡过程并不伴随着野生型p53基因的表达变化；沉默Smad4基因，亦未引起野生型p53基因的表达改变，表明在TGF-β1诱导SMMC-7721细胞凋亡的信号转导过程中p53可能并未作为TGF-β1-Smad通路相关基因发挥作用。但是，伴随着TGF-β1诱导的SMMC-7721细胞凋亡，caspase 3原酶被降解为小分子量的活性片断，表明caspase 3被激活；并且随着Smad4基因沉默对TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡作用的削弱，caspase 3的活性亦被抑制，表明TGF-β1诱导的SMMC-7721细胞凋亡与caspase 3的激活有关，caspase 3可能作为Smad4下游调节基因，参与TGF-β1诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的最终执行。（8） TGF-β1-Smad信号通路改变对肝癌SMMC-7721细胞运动侵袭能力的影响：利用Transwell小室对细胞侵袭能力进行检测。SMMC-7721细胞在TGF-β1诱导36小时后，穿透基底膜成分Matrigel的数量增加了20％，表明TGF-β1能够促进肝癌SMMC-7721细胞的侵袭转移。与未转染和转染阴性对照病毒载体LTN组相比，转染Smad4 RNAi病毒载体LT32组细胞穿透基底膜成分Matrigel的数量也增加了24％，说明Smad4基因沉默可以显着增强肝癌细胞的运动侵袭能力。但是，在细胞转染LT32病毒载体后再加以TGF-β1刺激，既没有削弱TGF-β1诱导SMMC-7721细胞侵袭能力的增强，也没有发挥协同作用进一步增强细胞穿透上室基底膜的能力。（9） TGF-β1-Smad信号通路改变对肝癌SMMC-7721细胞中MMP-2、MMP-9与VEGF表达的影响：肿瘤的侵袭转移与MMP-2和MMP-9的关系甚为密切。本研究结果显示伴随着TGF-β1的诱导与Smad4基因沉默所导致的SMMC-7721细胞运动侵袭能力的增强，MMP-2的表达明显上调，MMP-9的表达无明显变化。表明肝癌SMMC-7721细胞的侵袭可能与MMP-2密切相关，而与MMP-9无关。但是，细胞转染Smad4 RNAi病毒载体LT32后再加以TGF-β1刺激，在既没有削弱TGF-β1诱导SMMC-7721细胞侵袭能力的增强，也没有发挥协同作用进一步增强细胞穿透上室基底膜能力的同时，MMP-2表达的上调既没有被削弱也没有被进一步增强，表明TGF-β1诱导MMP-2表达的上调可能是Smad4非依赖性的。TGF-β1诱导SMMC-7721细胞侵袭增强的信号转导过程可能虽不依赖Smad4，但仍存在MMP-2的参与，TGF-β1通过增加MMP-2的表达促进SMMC-7721细胞的运动与侵袭。另外，我们发现TGF-β1可诱导肝癌SMMC-7721细胞VEGF表达明显上调；转染Smad4 RNAi相应的阴性对照病毒载体LTN，对SMMC-7721细胞中VEGF的表达没有影响，对TGF-β1诱导的VEGF表达的上调也未产生明显影响；SMMC-7721细胞转染Smad4 RNAi病毒载体LT32后，虽未对VEGF的表达产生影响，但TGF-β1诱导的VEGF表达的上调则几乎被完全抑制，表明在TGF-β1的信号转导过程中，VEGF的表达受Smad4调控，为其下游基因。（10） MAPK通路在TGF-β1信号转导过程中的作用：在TGF-β1诱导SMMC-7721细胞生物学效应的过程中，伴随着JNK和p38的活化；Erk1／2的表达虽无明显变化，但一直处于较高活性状态。转染Smad4 RNAi相应的阴性对照病毒载体LTN，对SMMC-7721细胞中JNK和p38的活性没有影响，对TGF-β1诱导的JNK和p38的活化也未产生明显影响；SMMC-7721细胞转染Smad4 RNAi病毒载体LT32后，虽未对JNK和p38的活性产生影响，但TGF-β1诱导的JNK和p38的活化则几乎被完全抑制。这些结果表明TGF-β1诱导的SMMC-7721细胞生物学效应与高水平的Erk1／2活性状态有关；同时，JNK和p38的激活参与了TGF-β1的信号转导过程。并且JNK和p38的活性受Smad4调节，与Smad4相互作用，共同参与TGF-β1的信号转导。结论（1）肝细胞性肝癌组织中，TGF-β1-Smad信号转导通路上的主要因子TGF-β1、TβR-Ⅱ、NF-κB、Smad4及Smad7的表达均有异常，提示它们可能在肝细胞性肝癌的形成中发挥重要作用。（2）鉴于Smad4在TGF-β1信号转导途径中的中枢地位，在成功构建Smad4 RNAi慢病毒载体有效沉默Smad4表达的基础上，以肝癌细胞株SMMC-7721为研究对象，进一步探讨TGF-β1的生物学效应及Smad4在其信号转导过程中的作用。研究发现TGF-β1可通过Smad4上调p16的表达，将细胞阻断于G1期，诱导对SMMC-7721细胞的生长抑制作用；亦可通过Smad4激活caspase 3，促使SMMC-7721细胞的凋亡。（3）另外，TGF-β1在肝癌细胞中通过诱导表达MMP-2和VEGF，提供合适的微环境，有利于肿瘤细胞的迁移和浸润血管上皮细胞，直接或间接的纵容肿瘤细胞的转移。（4） MAPK通路中JNK和p38的激活也参与了TGF-β1的信号转导过程，并且JNK和p38的活性受Smad4调节，与Smad4相互作用，共同在应答TGF-β1的信号转导中发挥作用。因此，TGF-β1-Smad信号转导通路在肝细胞性肝癌的发生发展中具有重要作用，广泛参与了肝癌细胞的增殖、凋亡以及侵袭转移等多种生物学过程的调节。对TGF-β1-Smad信号转导通路更加深入、全面的探讨将有助于我们进一步了解肝细胞性肝癌的发生发展机制，为对肝癌的分子诊断和基因治疗提供新的科学依据。
二、p16真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、p16真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制作用（论文提纲范文）
（1）NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 NF-κB在癌症治疗中的应用 |
| 1.1.1 NF-κB的生物学特性 |
| 1.1.2 NF-κB的结合靶点和靶基因 |
| 1.1.3 NF-κB与肿瘤 |
| 1.2 基因编辑技术用于癌症治疗 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑技术 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9 系统在癌症研究中的应用 |
| 1.3 端粒酶与癌症 |
| 1.3.1 端粒和端粒酶 |
| 1.3.2 端粒酶在癌症治疗中的应用 |
| 1.4 癌症干细胞 |
| 1.4.1 CSC的生物学特性 |
| 1.4.2 CSC的分离与鉴定 |
| 1.4.3 NF-κB与 CSC |
| 1.5 本论文研究内容及意义 |
| 第二章 人肝癌细胞中NF-κB结合靶点和靶基因的鉴定及其应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试验材料 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 细胞siRNA干扰 |
| 2.3.2 RNA-seq和数据分析 |
| 2.3.3 染色质免疫沉淀(ChIP) |
| 2.3.4 Ch IP-seq和数据分析 |
| 2.3.5 RT-qPCR |
| 2.3.6 Ch IP-qPCR |
| 2.3.7 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 NF-κB结合区域鉴定 |
| 2.4.2 增强子区NF-κB的结合 |
| 2.4.3 NF-κB差异表达基因鉴定 |
| 2.4.4 NF-κB直接靶基因鉴定 |
| 2.4.5 细胞特异性NF-κB直接靶基因 |
| 2.4.6 NF-κB直接靶基因GO分析 |
| 2.4.7 NF-κB直接靶基因KEGG分析 |
| 2.4.8 编码分泌蛋白的NF-κB直接靶基因鉴定 |
| 2.4.9 qPCR检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 NF-κB激活的肿瘤细胞特异性基因疗法及其应用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试验材料 |
| 3.2.2 主要试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 载体构建 |
| 3.3.2 细胞培养和转染 |
| 3.3.3 Western blotting |
| 3.3.4 细胞增殖能力测定 |
| 3.3.5 相对端粒长度检测 |
| 3.3.6 病毒包装和纯化 |
| 3.3.7 病毒滴度测定 |
| 3.3.8 病毒感染 |
| 3.3.9 动物实验 |
| 3.3.10 qPCR检测 |
| 3.3.11 数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 不同细胞系中NF-κB蛋白表达检测 |
| 3.4.2 Nage载体特异性验证 |
| 3.4.3 Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 3.4.4 相对端粒长度检测 |
| 3.4.5 rAAV-Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 3.4.6 Nage载体体内肿瘤治疗 |
| 3.4.7 qPCR和 Western blotting检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 端粒酶激活的肿瘤基因疗法及其应用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试验材料 |
| 4.2.2 主要试验仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 载体构建 |
| 4.3.2 细胞培养和转染 |
| 4.3.3 细胞活力和增值能力测定 |
| 4.3.4 端粒合成检测 |
| 4.3.5 相对端粒长度检测 |
| 4.3.6 病毒包装和滴度测定 |
| 4.3.7 病毒感染 |
| 4.3.8 动物实验 |
| 4.3.9 qPCR检测 |
| 4.3.10 数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 Tage系统特异性验证 |
| 4.4.2 细胞内端粒合成验证 |
| 4.4.3 Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
| 4.4.4 相对端粒长度检测 |
| 4.4.5 四碱基粘性末端Tage系统验证 |
| 4.4.6 HO酶在Tage系统中的应用 |
| 4.4.7 Tage系统优化 |
| 4.4.8 rAAV-Tage系统杀灭肿瘤细胞 |
| 4.4.9 Tage系统体内肿瘤治疗 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 肿瘤干细胞基因治疗载体的构建及其应用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试验材料 |
| 5.2.2 主要试验仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 载体构建 |
| 5.3.2 细胞培养和转染 |
| 5.3.3 病毒包装和滴度测定 |
| 5.3.4 病毒感染 |
| 5.3.5 细胞活力测定 |
| 5.3.6 RT-qPCR检测 |
| 5.3.7 数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 Tage系统和Nage载体杀灭肿瘤细胞 |
| 5.4.2 Tage系统和Nage载体连续杀灭Hep G2 细胞 |
| 5.4.3 动态观察和检测残存细胞 |
| 5.4.4 rAAV杀灭残存细胞 |
| 5.4.5 rAAV-mi R533 杀灭CSC |
| 5.4.6 rAAV杀灭急性白血病细胞 |
| 5.4.7 AML CSC标志基因q PCR检测 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 个人履历 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目 |
| 攻读博士学位期间学术成果 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
（2）GADD45G和USP16调控肿瘤细胞生长及相关机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语列表 |
| 第一部分 应激蛋白GADD45G诱导肝肿瘤细胞衰老和抑制肿瘤生长的机制研究 |
| 前言 |
| 1.1 细胞衰老 |
| 1.2 GADD45家族蛋白 |
| 实验材料与方法 |
| 2.1 组织标本 |
| 2.2 实验动物和材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 数据分析 |
| 实验结果 |
| 3.1 SIP1在GADD45G诱导肝肿瘤细胞衰老过程中表达上调 |
| 3.2 SIP1 表达活化在GADD45G诱导的细胞衰老中的作用 |
| 3.3 GADD45G活化SIP1 表达参与MG132 诱导的细胞衰老 |
| 3.4 JNK活化诱导SIP1 表达参与GADD45G诱导的细胞衰老 |
| 3.5 p38 MAPK活化参与GADD45G诱导的细胞衰老但不参与SIP1 表达活化 |
| 3.6 GADD45G诱导SIP1 表达对Stat3 活性的影响 |
| 3.7 抑制SIP1 逆转GADD45G诱导的肿瘤生长抑制作用 |
| 3.8 GADD45G和 SIP1 在人肝癌组织中的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 USP16在K-Ras活化诱导的小鼠细胞增殖和肿瘤发生中的作用 |
| 前言 |
| 1.1 泛素与蛋白酶体降解系统 |
| 1.2 去泛素化酶 |
| 1.3 去泛素化酶USP16及其生物学效应 |
| 实验材料和方法 |
| 2.1 实验动物和材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 实验结果 |
| 3.1 H-Ras活化上调USP16 的蛋白表达 |
| 3.2 敲除USP16 抑制K-Ras~(G12D)表达的MEFs的增殖 |
| 3.3 敲除USP16抑制SV40T和 K-Ras~(G12D)转化的细胞的体内成瘤能力 |
| 3.4 USP16 敲除对K-Ras活化诱导的鼠肺肿瘤生长的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 已发表论文清单 |
（3）miR-203对内皮细胞靶分子鉴定及其生物学功能的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 中文摘要 ABSTRACT 前言 文献回顾 综述一：通过 |
| MICRORNA |
| 抑制 |
| FGF2 |
| 可作为抗肿瘤血管化的新策略 综述二：肿瘤干细胞、BMI-1 |
| 和 |
| MICRORNA 第一部分 |
| MIR-203 |
| 慢病毒表达载体的构建及人脐静脉内皮细胞的稳定转染 1 |
| 材料 2 |
| 方法 3 |
| 结果 4 |
| 讨论 第二部分 |
| HUVEC-12 |
| 中 |
| MIR-203 |
| 靶分子的预测分析及验证 1 |
| 材料 2 |
| 方法 3 |
| 结果 4 |
| 讨论 第三部分 |
| MIR-203和MIR-218对BMI-1的抑制作用初步探讨和真核表达重组质粒的构建 1 |
| 材料 2 |
| 方法 3 |
| 结果 4 |
| 讨论 小结 参考文献 个人简历和研究成果 致谢 |
（4）pIRES2-EGFP-hIL-12-HSP70真核表达载体的构建及对7402肝癌细胞生长的影响（论文提纲范文）
| 英汉缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验方法与步骤 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 正文 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）p16基因对人肝癌细胞的生长抑制作用的初步研究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1主要试剂 |
| 1.2组织标本和细胞 |
| 1.3质粒、菌株及引物 |
| 1.5pc DNA 3.1-p 16质粒转染SMMC-7721细胞及鉴定 |
| 1.6MTT法检测细胞生长 |
| 1.7Westernblot检测凋亡相关蛋白的表达情况 |
| 1.8统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1人肝癌, 癌旁组织, 正常肝组织中p16的表达 |
| 2.2p16基因的扩增与pc DNA3.1-p16重组真核表达质粒载体的构建与鉴定 |
| 2.3转染后p16基因在人肝癌细胞SMMC-7721的表达 |
| 2.4p16基因对人肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响 |
| 2.5p16基因表达对人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响 |
| 3 讨论 |
（6）Id-1与HBx在乙肝相关性肝癌成瘤过程中相互作用的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 中文摘要 英文摘要 前言 文献回顾 正文 |
| 实验一：Id-1在乙肝相关性肝癌中的表达意义及其与HBX相互作用关系 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二：人Id-1干扰慢病毒载体的筛选构建 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 小结 参考文献 个人简历和研究成果 致谢 |
（7）应用RNAi技术沉默遗传印记基因PEG10治疗肝癌的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文 |
| 第一部分 PEG10 基因在肝癌细胞中的表达 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 靶向PEG10 的siRNA 真核表达载体的构建和鉴定 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 靶向PEG10 的siRNA 真核表达载体体外抑制肝癌生长的实验研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 靶向PEG10 的siRNA 真核表达载体体内抑制肝癌生长的实验研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 综述 |
| 综述1 RNAi 技术及其在肝病研究中的应用 |
| 综述2 遗传印记及相关疾病 |
| 参考文献 |
| 附录 1 攻读学位期间发表的论文(第一作者) |
| 致谢 |
（8）MTS1在肝细胞癌中的表达及其对人肝癌细胞SMMC-7721生长抑制作用的研究（论文提纲范文）
| 1.英文缩写词表 |
| 2.中文摘要 |
| 3.英文摘要 |
| 4.文献回顾 |
| 5.前言 |
| 6.实验研究 |
| 第一部分 肝癌组织及肝癌细胞系7721中MTS1的转录和翻译 |
| (1)．材料 |
| (2)．方法 |
| (3)．结果 |
| (4)．讨论 |
| 第二部分 人MTS1cDNA真核表达载体pDOR-p16的构建 |
| (1)．材料 |
| (2)．方法 |
| (3)．结果 |
| (4)．讨论 |
| 第三部分 转染MTS1cDNA在肝癌细胞系7721中的表达及其对7721生长的抑制作用 |
| (1)．材料 |
| (2)．方法 |
| (3)．结果 |
| (4)．讨论 |
| 7.结论 |
| 8.致谢 |
| 9.参考文献 |
| 10.发表文章 |
| 11.附图 |
（9）聚丙交酯乙交酯纳米粒（PLGA-NP）介导P16-P53基因联合抑制人肝癌细胞的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一章 构建p16-p53基因融合表达载体pcDNA16-53 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 第二章 聚丙交酯乙交酯(PLGA)纳米粒的制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 第三章 PLGA-NP与PcDNA16-53的连接 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 第四章 PLGA-PCDNA16-53进行肝癌基因治疗的实验研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的主要研究成果 |
（10）转化生长因子β1-Smad信号转导通路在肝细胞性肝癌发生发展中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 主要缩写词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 TGF-β1-Smad通路中关键信号分子在肝细胞性肝癌及癌旁组织中的表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 第二部分 Smad4基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定 |
| 一、Smad4 RNA干扰靶序列的设计与表达载体的构建 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 第三部分 Smad4基因沉默对肝癌细胞生物学特性影响的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 在读博士期间发表的论文和着作 |
四、p16真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制作用（论文参考文献）
- [1]NF-κB和端粒酶启动的肿瘤基因治疗新技术研究[D]. 戴薇. 东南大学, 2019(01)
- [2]GADD45G和USP16调控肿瘤细胞生长及相关机制研究[D]. 许桂琴. 上海交通大学, 2017(05)
- [3]miR-203对内皮细胞靶分子鉴定及其生物学功能的研究[D]. 朱华宇. 第四军医大学, 2013(03)
- [4]pIRES2-EGFP-hIL-12-HSP70真核表达载体的构建及对7402肝癌细胞生长的影响[D]. 朱晓西. 遵义医学院, 2011(06)
- [5]p16基因对人肝癌细胞的生长抑制作用的初步研究[J]. 柳洁,田海文,谢正兰,吴尚辉,饶利兵. 肿瘤药学, 2011(02)
- [6]Id-1与HBx在乙肝相关性肝癌成瘤过程中相互作用的研究[D]. 丁睿. 第四军医大学, 2010(06)
- [7]应用RNAi技术沉默遗传印记基因PEG10治疗肝癌的实验研究[D]. 黄锦. 华中科技大学, 2007(05)
- [8]MTS1在肝细胞癌中的表达及其对人肝癌细胞SMMC-7721生长抑制作用的研究[D]. 史宪杰. 第四军医大学, 1999(02)
- [9]聚丙交酯乙交酯纳米粒（PLGA-NP）介导P16-P53基因联合抑制人肝癌细胞的实验研究[D]. 张蕾. 中南大学, 2007(01)
- [10]转化生长因子β1-Smad信号转导通路在肝细胞性肝癌发生发展中的作用机制研究[D]. 季国忠. 南京医科大学, 2007(02)