沈烨[1]2002年在《根癌农杆菌介导的甜樱桃茎尖遗传转化体系的建立》文中提出木本植物包括大部分果树以及所有的林木，在国民经济和人类生存方面发挥着极其重要的作用。木本植物相对于大田作物和其他草本植物有一个较长的营养生长期，这是运用传统杂交育种方法改良木本植物性状的主要障碍。植物遗传转化为克服木本植物传统育种局限性、加速树木遗传育种进程提供了一条有效途径。植物遗传转化能在分子水平上改造植物的遗传物质，它可以打破物种之间的生殖隔离障碍，定向改造植物遗传性状，提高了育种的目的性和可操作性。 植物遗传转化的研究和应用在近二十年中取得了巨大的发展，但是木本植物的遗传转化却远远落后于大田作物和其他草本植物。主要原因是木本植物的高频再生体系和高效遗传转化体系不够完善。绝大部分果树属于木本植物。果树的遗传转化进展缓慢，甚至落后于林木，其原因仍然是缺乏适宜的遗传转化受体和高效的遗传转化方法。 樱桃是一年中最早上市的水果(木本)，填补了春淡水果市场，而且风味和色泽深受人们喜爱。但其具有果小、核大、肉薄和裂果的缺点，而且是传统育种方法很难改良的树种之一，这促使人们想通过遗传转化技术改变其不良性状。但缺乏合适的高效转化体系，为建立木本果树优良的遗传转化体系，本论文以甜樱桃为材料，用甜樱桃茎尖作外植体，建立了甜樱桃茎尖高频再生体系；并以驯化培养后的甜樱桃茎尖为受体，通过优化农杆菌遗传转化方法的各项参数，建立了甜樱桃茎尖遗传转化体系，其结果如下： 1、确定甜樱桃芽的再生体系 通过进行不同激素组合对甜樱桃腋芽分化率的影响实验，确定了甜樱桃芽的再生体系为：诱导甜樱桃芽分化的培养基是B_5+1.0mg／L BA+0.1mg／LNAA、B_5+1.0mg/L BA+0.2～0.5mg／LIAA，增殖培养基是B_5+BA0.25mg／L+NAA0.05mg/L，生根培养基是B_5+IBA0.2～0.5mg/L。甜樱桃芽在该再生体系中的再生频率为97％。 2、比较不同浓度Cef的杀菌效果和受体材料对Kan的敏感度，确定了Cef的脱菌浓度是500mg/L和Kan的筛选强度50mg／L。 3、建立了农杆菌介导的甜樱桃茎尖转化体系 棍癌农杆菌介导的甜樱状茎尖迟传转化体系的灭立 用驯化培养的甜樱桃茎尖作受体，优化了农杆菌介导转化体系的多项参数；以OD。。0二～0．5的农杆菌菌液感染30删后共培养3d，能获得0．78％的抗性绿芽率。4、通过比较二即筛选、延迟筛选和梯度筛选叁种筛选方式对抗性绿苗率的影啊，得到梯度筛选的转化率为0．85％，是该转化体系的较好筛选方式c5、实验研究了AS、Tween20和负压等回素对转化效率的影响，表明AS可明显提高转化效率，其最适浓度为120fnmoll；T、cen20和负压处理也能提高转化频率，了、een20的适宜浓度是 0．l％，负压的适宜处理是 lmm XIO次。6、通过P＊R扩增，初步证明证明外源基回己转入甜樱桃。
高喜叶[2]2008年在《根癌农杆菌介导的酸樱桃离体叶片高效遗传转化体系的建立》文中指出核果类果树主要包括桃、李、杏、扁桃、樱桃等,在植物分类上属于蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus L.)植物,在果树生产中占有相当重要的地位。长期以来,核果类果树一直被国内外同行公认为是最难进行离体(无性材料)再生的一类树种,大家在这方面曾经尝试做过大量实验研究,但成效甚微。核果类果树由于其自身的离体再生困难等问题,基因工程技术的研究也明显地相对落后于其它果树的发展。因此,建立和完善有效的遗传转化再生系统就成为开展核果类果树在这一领域研究的关键。长期以来,国内外的几个实验室一直致力于这方面的研究,并取得了一定的研究成果。种种迹象表明,核果类果树(无性材料)遗传转化高效再生技术有望在近期取得突破。樱桃是一年当中最早上市的水果,俗有春果第一枝的美誉。其营养价值高,用途广。除鲜食外还可以做点心、酿酒、入药等功能。酸樱桃还具有调中益气、养精止泻等滋补功能。其叶、核、果皆可入药,通身无弃物。由于多元酚类化合物含量较高,因此有明显的抗癌、抗动脉硬化和其他心血管疾病的功效。然而在栽植当中容易感染根癌病,大大限制了该优良树种的推广,因而提高它的抗逆性是今后发展的目标。传统的育种方法周期长,而基因工程为加快其育种进程提供了新的手段。但是缺乏高效遗传转化体系,为建立樱桃优良的遗传转化体系,本论文以酸樱桃为材料,用离体叶片作为外植体,建立了离体叶片高频再生体系;并通过根癌农杆菌介导从优化遗传转化的各项参数,建立了离体叶片高效遗传转化体系,其结果如下:1.确定酸樱桃离体叶片的再生体系从再生培养基、激素配比、叶片生理状态、培养基中琼脂用量、不同培养容器等几个方面对影响离体叶片高效再生的关键因素进行了研究。确定了CAB-6p的再生培养基为WPM,最佳激素配比是BA 2mg/L + IAA 2mg/L,叶片的最佳生理状态为试管苗顶部新发出的极为幼嫩并且是合拢状态的幼叶,琼脂的使用浓度为4.5g/L,离体叶片诱导再生的培养容器用广口瓶再生效果最好。2.酸樱桃遗传转化中对抗生素抗性敏感性试验的研究验研究表明,卡那霉素的筛选最佳浓度应为40mg/l。认为头孢唑啉钠是CAB-6p的最佳抑菌抗生素,且适宜的浓度范围为500mg/l-600mg/l。3.酸樱桃遗传转化体系的建立用无菌的CAB-6p试管苗的离体叶片作为受体,优化了农杆菌介导转化体系的多项参数:以OD600为0.5-1.0的农杆菌菌液侵染10min后共培养3天,能获得的GUS+率高达80%以上。4.本实验还进一步研究了立即筛选、延迟筛选、梯度筛选叁种选择方式对抗性芽的百分率及转化率的影响,得到梯度筛选的转化率为1.2%。是该转化体系最好的筛选方式。另外,AS也是遗传转化的一关键影响因素。本实验研究表明,在共培养培养基与农杆菌悬浮液中同时加入浓度为20mg/l的AS可提高抗性芽率。5.通过PCR扩增分析,初步证明外源基因已经转入酸樱桃CAB-6p。
吴延军[3]2004年在《桃组织培养及遗传转化的研究》文中进行了进一步梳理桃是世界性重要果树，我国是桃主产国，产量位居世界各国之首，浙江省是桃主产区之一，平均年产量在10万吨以上。桃果色、香、味、质俱佳，很受消费者欢迎，在果品市场占据重要地位。但桃是乙烯跃变型果实，采后软化进程迅速，大多数品种成熟季节又适逢高温高湿，果实极不耐贮运，严重影响其销售与外运，这是长期制约桃生产的主要问题之一。 延长桃贮藏期常采用低温冷藏，但它易造成桃果冷害，结果并不十分理想。桃贮藏保鲜的现状表明延长桃贮减时间、提高贮藏品质，延长货架期，减少采后腐烂等目标难以靠常规措施实现。随着现代生物技术的发展，植物转基因技术已得到广泛应用，国际上番茄转ACC合成酶和ACC氧化酶反义基因的成功为其他作物解决贮藏难问题提供了范例和良好前景，因此本研究也运用这一思路开展桃组培与转基因研究。 本研究以我国南方主栽品种玉露桃和湖景蜜露桃为试材，建立了桃幼胚和幼胚子叶再生体系，运用基因枪介导法和根癌农杆菌介导法转化桃幼胚子叶获得了转ACO反义基因的转基因植株，并对转基因材料进行了分子鉴定。主要研究结果如下： 1．以奉化玉露和湖景蜜露桃为试材，分别在盛花后45 d和55 d采集桃幼果并取其幼胚接种，置于正交设计的16种培养基上，26℃±1℃暗培养，研究基本培养基类型、激素等因素对桃幼胚脱分化的影响，筛选出适合愈伤组织分化的激素组合。结果表明：1)培养基是影响桃幼胚愈伤组织诱导的最重要因素，MS适合45 d、55 d玉露和55 d湖景蜜露幼胚诱导愈伤组织。2)激素诱导愈伤组织因品种而异，NAA 1.0 mg／L对45 d、0.5 mg／L对55 d玉露，BA 0.5 mg／L对55 d湖景蜜露效果较好，在试验浓度范围内2，4-D对二品种幼胚发育45 d、55 d均无明显效果。3)幼胚的发育状态是影响诱导愈伤组织的另一因素。盛花后45 d的幼胚愈伤组织诱导率最高达96.6％，而盛花后55 d的幼胚愈伤组织诱导率为81.6％。桃幼胚愈伤组织可在MS+0.05 mg／L NAA+1.0 mg／L BA的培养基上分化成芽，再生芽可在1／2 Ms+1.0 mg／L IBA培养基上生根。 2．盛花后45 d、55 d玉露和55 d湖景蜜露桃幼胚子叶，置于MS+2％蔗浙江大学博:卜学位论文:桃组织培养及遗传转化的研究(2 0()4)搪+0.75%琼脂并加入不同浓度配比激素的培养基上，于26℃士l℃，光照强度2000一3000 lux，16h/8h光暗周期的环境下培养，研究激素配比、品种、取样时间、损伤方式对桃子叶再生能力的影响，并对不定芽发生部位进行了观察。结果表明:NAA 0.50 mg/L+BA一0.0 mg/L、NAA 0.05 mg/L+ToZ 3.0 mg/L二组激素配比有利于桃子叶再生:玉露的再生能力较高于湖景蜜露，盛花后55d的幼胚子叶比花后45d的幼胚子叶稍易再生;带胚芽子叶纵向刻伤再生率高。桃幼胚子叶可通过愈伤组织分化和器官直接分化二条途径再生，不定芽可产生于子叶的背茎面、向茎面等各部位。再生不定梢(芽)在1/2MS+2.岛蔗搪+0.75%琼脂+IBA 1.0 mg/L+Ad 20 mg/L的培养基上可以生根。 3.以玉露桃幼胚作为根癌农杆菌介导转化的受体，通过对GUS基因瞬时表达率的分析，研究此转化体系的最佳实验参数。实验结果表明，预培养时间、感染时间、共培养时间和根癌农杆菌诱导物AS等对转化效率都有一定的影响。预培养ld、感染巧min、共培养42h和不添加AS时GUS基因的瞬时表达率最高。 4.通过基因枪轰击盛花后55d玉露桃幼胚带胚芽的单瓣子叶转化带有桃ACO反义基因的PBIO.8载体，在363个外植体中最终获得了5个抗性芽和l个抗性植株。 5.利用根癌农杆菌GV3101将ACO反义基因导入桃幼胚子叶，获得了卡那霉素抗性植株。在供试的1379个玉露桃幼胚子叶中获得了39个抗性芽，湖景蜜露桃614个幼胚子叶中获得了11个抗性芽。抗性芽通过微芽嫁接培养有可能成株。 6.对基因枪和农杆菌介导获得的桃转ACO反义基因的部分抗性材料进行PCR、Southern blot和GUS基因表达等分子检测，结果表明外源反义ACO基因己经整合到桃的基因组中。
李晓[4]2009年在《农杆菌介导codA基因遗传转化‘GF43’李的研究》文中研究表明毛桃是我国长江流域桃产区的最主要砧木,但其抗病虫及抗逆能力相对较弱,且嫁接品种个体间生长不整齐,故在生产上有一定的局限性。‘GF43’李是欧美桃生产大国广泛使用的优良的桃砧木,具有良好的耐涝性,能适应长江流域生长季高温多湿的条件。然而‘GF43’李存在座果率低,扦插生根难,需要通过组织培养快速获得大量遗传稳定、生长一致的苗木用于生产。‘GF43’李存在不抗寒缺陷,需要通过育种进一步改良。由于果树遗传背景复杂,采用常规方法改良砧木品种难度较大。随着现代生物技术的发展,植物转基因技术得到广泛应用。基因转化可以有目的地改善不利性状,是砧木品种改良的有效新途径。本试验建立了欧洲李(Prunus domestica)的实生后代‘GF43’李快繁体系、高效再生体系和遗传转化体系,并用农杆菌介导法将细菌乙酰胆碱氧化酶codA基因转入‘GF43’李中,以期获得携带具有普遍抗性的‘GF43’李新种质。研究结果如下：1.‘GF43’李的高效快繁体系研究发现：消毒方法以75%的酒精浸润20s,0.1%HgCl2+0.01%吐温对外植体表面消毒6min为最佳;MS+6-BA 2.0 mg／L+NAA 1.0mg/L的启动培养基最利于腋芽萌发；LP+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L的继代增殖培养基上试管芽增殖倍数最高(5.6倍／30d),且植株生长健壮；筛选出的适宜生根培养基为LP+IAA0.5mg/L+0.1%活性炭,适宜的移栽基质为珍珠岩：蛭石：草炭土为1：1：1的配比。2.通过对基本培养基的类型、生长调节剂种类和浓度、暗培养时间、叶片放置方式等因素对‘GF43’李叶片再生频率影响的研究,发现TDZ比6-BA能更有效的诱导叶片不定芽的再生；生长素IBA、叶片近轴面接触培养基的接种方式和培养基中添加蔗糖是诱导不定芽再生的关键因子；14d的叶片作外植体,以及培养初期进行2d的暗培养可以大幅度提高再生频率。通过再生体系优化,发现14d叶片,近轴面接种在LP+TDZ 3.0mg/L+IBA 1.0mg/L+蔗糖30g/L培养基上,暗培养2天,再转为光照培养30d时,再生率可以达到85.2%,不定芽平均再生数量为6.4个／叶块。3.对‘GF43’李叶片侵染时间、共培养时间、抑菌素种类和浓度、不同选择压等遗传转化影响因素的研究。获得的‘GF43’李遗传转化体系为,在农杆菌浓度OD600=0.5时,叶片经农杆菌浸染5 min,在LP+TDZ 3.0 mg／L+IBA 1.0 mg／L+30g/L蔗糖培养基上共培养3d(暗培养2d)后,添加Cb150mg/L,能获得最佳的GUS瞬时表达率为33.5%,最佳选择压为Km 15mg/L。农杆菌介导法获得的‘GF43’李抗性芽进行GUS染色,鉴定出GUS染色阳性芽4个,这些试管苗株系中很可能已经转入codA基因,需进一步验证。
郭绍华[5]2005年在《樱桃砧木Colt抗菌肽基因转化研究》文中指出以樱桃砧木Colt(Prunsavium×Pruns pseudocerasus)茎尖为外植体,用携带有抗菌肽基因的根癌农杆菌进行基因转化研究。利用烟草高频再生体系检测工程菌的侵染力,并将pSMC 质粒由LBA4404 转移到A208SE、EHA105。用pSMC/A208SE转化樱桃砧木Colt,共获得9个转化克隆系,对部分转基因植株进行PCR检测及抑菌、诱发冠瘿瘤实验初步证明抗菌肽基因已整合到植物基因组中并得到了表达。本研究表明:在影响根癌农杆菌介导转化的众多因素中,农杆菌和外植体细胞良好的生长状态是保证转化成功的关键。用YEB-1(pH5.6)培养基活化农杆菌,培养至OD600为0.4时用于侵染,取苗龄为25d、1～3mm茎尖,在分化培养基中进行1d的预培养,可提高其对农杆菌的感受力。转化过程中,侵染5～7min,共培养3d,再延迟选择3～7d,温度24～26℃之间,为最佳转化条件,可使转化频率由2.21±0.4%升高到3.01±0.2%。
徐世彦, 武凯翔, 吴延军[6]2018年在《樱桃组织培养及遗传转化研究进展》文中提出樱桃果实甜美,营养丰富,深受消费者喜爱,是极具市场潜力的水果之一。但是由于其易裂果、不耐贮藏且抗性较弱,使樱桃产业的发展受到了极大影响,因此加快樱桃优良品种的选育十分重要。采用传统育种方式在一定程度上所需周期较长、工作量大,且杂交胚败育率较高,严重阻碍了樱桃育种工作的进程。而通过植物组织培养与遗传转化可以克服樱桃传统育种的局限性,加速育种工作的进程。笔者分析了樱桃茎尖、茎段和叶等器官培养以及胚培养的影响因素,如基因型、外植体类型、培养条件和激素组合等;综述了有关樱桃标记基因和目的基因的遗传转化,包括转化方法、转化材料、所用基因类型、转化植株的鉴定方法、转化结果以及转化率等,并对生物技术在樱桃研究中存在的问题及今后在樱桃中的应用前景进行了讨论。
张娅君[7]2012年在《枣成熟胚离体培养及农杆菌介导叶片与胚遗传转化研究》文中研究指明枣是鼠李科（Rhamnaceae）枣属（ZiziphusMill.）植物，其产量在叁大干果中占据首位。因枣花期不一致，且花小，授粉困难，在自然条件下坐果率低，且胚败育严重，同时还存在严重的病虫害。传统育种方法周期长、效率低，不易获得优良抗性新品种。本实验以酸枣成熟胚为材料，建立了枣胚离体再生体系，为枣胚的遗传转化研究奠定基础；另外，以灰枣叶片和蜂蜜罐成熟胚为材料，进行了农杆菌介导枣树抗虫基因遗传转化的研究。主要结果如下：1枣成熟胚离体再生体系的建立试验结果表明：以常温保存1年的成熟胚的萌芽率较高，适宜启动培养基为不添加任何植物激素的MS；增殖培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L；培养基中加入PVP1.5mg/L时对褐化有很好的抑制效果。2农杆菌介导枣树抗虫基因遗传转化研究试验以枣叶片和胚为转化受体研究发现，用农杆菌菌株EHA105侵染外植体，共培养结束后，后期脱菌困难，只有菌液浓度在OD600=0.2，侵染时间为12min，共培养3d后，洗菌后能有效抑菌，获得不定芽；枣树对除草剂basta非常敏感，浓度在2mg/L时的褐化死亡率高达96.5%。初步认为枣树的遗传转化不宜用除草剂basta作为筛选剂。不同种或同一种植物的不同品种对除草剂basta的敏感性差别较大，其应用在草本上较为常见。而在木本植物遗传转化时，应用最多的筛选剂是卡那霉素，且本课题组通过研究，已得到卡那霉素在灰枣上的筛选浓度为40mg/L。在后续进行灰枣抗虫基因Bt遗传转化研究前，可考虑对原有基因载体进行改造，将原有的抗除草剂筛选的bar基因替换成抗卡那霉素筛选的新霉素磷胺酸转移酶基因NPTⅡ。
高春媛[8]2008年在《影响油桃（Prunus persica var.nectarina）茎尖培养和胚轴再生因子的研究》文中研究指明桃的常规育种周期长、工作量大,且很难取得令人满意的结果。随着现代生物技术和基因工程的发展,可有目的地改良某些优良品种的不良性状,在较短时间内得到新品种,从而提高育种效果,而建立高效稳定的再生体系一直是桃基因工程发展所需要攻克的难题之一。本研究以早熟油桃品种华光、曙光以及中熟油桃品种秦光为试材,对影响其茎尖初代培养和继代增殖的主要因素进行试验,旨在为油桃茎尖快繁体系的建立提供更加精确的试验依据。还以秦光种胚胚轴为试材,对其进行离体培养,诱导获得了不定芽。并对下胚轴再生的愈伤组织进行抗氧化酶的测定分析,初步进行了不定芽再生在细胞水平上的研究。研究结果如下:1.华光、曙光和秦光叁种油桃茎尖培养最适宜的取材时期为新梢萌发期,试材为萌发新梢的顶端嫩芽,污染率低,利于成活。用75%酒精30s+0.1%升汞1min+饱和次氯酸钠5min对油桃茎尖进行消毒处理效果最好。2.茎尖初代培养适合的培养基组合为:华光和秦光G+6-BA 0.50 mg/L +IBA0.50mg/L,成活率分别为98.15%和72.34%;曙光G+6-BA 0.50 mg/L+IBA0.125 mg/L,成活率为91.72%。3.茎尖培养适合的增殖培养基组合为:华光和曙光G+6-BA 2.00 mg/L +IBA0.25mg/L ,增殖的平均有效芽数为2.36 , 2.89 ;秦光G+6-BA 1.50 mg/L +IBA0.50mg/L,增殖的平均有效芽数为3.16。4.中熟油桃秦光经过7天常温光下预培养所得下胚轴适宜做再生的外植体;下胚轴形态学上部再生能力较下部差异显着;下胚轴暗培养7—14天左右较适宜诱导产生愈伤组织,进而产生不定芽,平均不定芽数也较其他处理高。5.秦光油桃下胚轴再生以G+TDZ2.5mg/L+NAA0.5mg/L的培养基效果最好,再生率达到38.89%。6.秦光油桃下胚轴再生过程中,在愈伤组织分化不定芽的前期,SOD活性逐渐升高,14d时SOD活性达到最高值,随后SOD活性开始下降;而POD和CAT的活性在愈伤组织开始分化的前期迅速降低,在7-14天之间基本维持在相对稳定的水平。到不定芽生长后期,两者的活性又迅速上升。
孙国利[9]2009年在《不同基因型樱桃植株再生体系的研究》文中研究指明本研究旨在进一步优化和拓宽樱桃不同基因型组织培养和快速繁殖体系,以离体叶片、离体叶柄、节间、根等多种外植体为试材,探讨并丰富樱桃遗传转化体系的再生系统。以樱桃杂种优系‘F8’(Prunus.avium L.×Prunus . pseudocerasus L.)、‘F10’(Prunus.avium L.×Prunus. pseudocerasus L.)、‘H8’(Prunus. cerasus L×Prunus.pseudocerasus L.)和‘H10’(Prunus. cerasus L×Prunus.pseudocerasus L.)的茎尖为材料,MS和F14为基本培养基,通过添加不同浓度的6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)、3-吲哚丁酸(IBA)、赤霉素(GA3)进行杂种樱桃再生体系的构建研究,结果表明:F14+6-BA (0.3~0.5)mg/L+GA30.1 mg/L适合各个杂种优系初代培养诱导出植株,F14+6-BA (0.5~1.0)mg/L+IBA(0.1~0.3)mg/L +GA30.1 mg/L能够很好的促进各个杂种优系分化不定芽,1/2MS+IBA0.5 mg/L(或NAA 0.8 mg/L)是各个杂种优系的最佳生根培养基。以甜樱桃(Prunus avium L.)品种‘meizao’和‘Summit’、杂种优系‘F8’、‘F10’、‘H8’和‘H10’等不同基因型的试管苗为材料,进行樱桃离体叶片、叶柄、子叶、节间、根再生试验。结果表明:甜樱桃品种‘meizao’的离体叶片在WPM+6-BA 2.0 mg/L +IAA 2.0mg/L +GA30.1 mg/L培养基上,不定芽再生率可达到90%,‘H10’、‘Summit’、‘F10’、‘F8’在6-BA2~2.5 mg/L、IAA 1.0~2.0 mg/L的激素配比范围内,也获得了76.0%、86.0%、80.0%、64.0%的再生率。离体叶片接种后暗培养1周、远轴面向下接种和选择试管苗上部的幼嫩叶片,均有利于叶片再生。优系‘H10’叶柄接种于改良MS+6-BA2.0 mg/L+IBA0.1 mg/L +2,4-D0.5 mg/L的培养基,可获得40.0%的再生率,其他品种仅有H8的叶柄获得了少量的再生植株。选择带一小块叶片的叶柄和5mg/L的硝酸银处理有利于叶柄再生;优系‘F10’的幼嫩节间接种于LS+6-BA1.0 mg/L+NAA2.0 mg/L+CH100 mg/L培养基,最高再生率为40.0%,在6-BA1~2mg/L和NAA1~2mg/L的激素配比范围内,‘H8’、‘H10’的离体节间再生率最高分别为25.0%和30.0%。选择试管苗黄化处理的节间,再生率要低于未经过黄化处理的节间;优系‘H8’整体根在MS+6-BA1.0 mg/L +2,4-D2.0 mg/L + IBA0.05 mg/L + NAA 0.05 mg/L的培养基上,达到了96.7%的再生率,在6-BA 0.5~2 mg/L和2,4-D 0.5~2.0 mg/L的激素配比范围内,‘H10’、‘F8’、‘F10’离体根再生率分别为93.3%、96.7%和93.3%。另外,根切段接种没有整体根再生频率高。以樱桃杂种优系‘H8’试管苗的离体节间和中国樱桃‘对樱’的试管苗离体叶片为材料,MS为基本培养基,通过调整植物激素种类和浓度,筛选适合‘H8’试管苗离体节间和‘对樱’离体叶片再生不定根的培养基配方,结果表明:‘H8’离体节间和‘对樱’离体叶片,均在培养基MS+NAA1.0 mg/L上获得了最大的不定根再生率64.0%和80.0%,NAA浓度过大或过低均不利于不定根再生。离体叶片和离体节间再生不定根的成功,从多角度、多层次建立樱桃离体再生不定芽提供了新途径。
尹秀[10]2013年在《棉花分生组织转化技术的研究》文中研究指明近年来大多研究学者通过植物转基因技术改良棉花性状，已成功获得了多种优良品质的转基因棉花。大多采用农杆菌介导法、基因枪法及花粉管道法，其中关于农杆菌介导的棉花遗传转化的研究颇多且研究机理较清楚。农杆菌介导的棉花遗传转化体系通常以下胚轴为外植体，经历组织培养的过程获得再生植株。但该遗传转化体系通常受到基因型限制、转化周期长、成胚率低等因素的限制。棉花茎尖分生组织具有发育成完整植株的能力，不受品种的限制及实验周期短。本文在前人的工作基础上对棉花茎尖分生组织遗传转化体系进行改良。目的：高速涡旋的玻璃粉创伤新陆早33成熟棉胚的茎尖分生组织，利用农杆菌介导法将gusA报告基因导入棉花，通过检测评估该方法的转化效率，探讨不同的转化条件（不同菌株、不同浓度、不同侵染方式、玻璃粉量及涡旋时间）对该方法遗传转化的影响。方法：棉花种子消毒后在无菌条件下用手剥离出棉胚，去除子叶后完全暴露出茎尖分生组织且不受损伤。2mL MS液体培养基、玻璃粉及棉胚转至10mL离心管，3000rpm高速涡旋创伤成熟棉胚后用农杆菌介导法侵染，设置了不同的单因素转化条件：两种菌种、叁种菌液浓度、不同侵染方式、叁种不同玻璃粉量及两个涡旋时间。GUS组织化学染色部分棉胚及石蜡切片观察棉胚转化情况，余下棉胚筛选培养出幼苗，移栽后对幼苗叶片进行卡那霉素初步筛选、PCR检测及GUS组织化学染色。结果：农杆菌LBA4404与GV3101分别侵染棉胚，GUS染色发现农杆菌LBA4404转化棉胚后较多细胞能被着色。GUS染色发现菌液浓度OD_(600)为0.8时棉胚的较多细胞被着色，能表达gusA的活性。采用不同的方法侵染棉胚，GUS染色发现方法1转化棉胚后较多细胞能被着色。玻璃粉量越大对棉胚的损伤越严重，即插入棉胚的玻璃粉量越多，GUS染色发现0.2g玻璃粉转化条件下棉胚及茎尖分生组织较多的细胞被染成蓝色。随着玻璃粉量加大，幼苗成活率降低，0.2g玻璃粉转化条件下成活12株幼苗，比较适宜。涡旋时间越长对棉胚及茎尖分生组织损伤越严重，即插入棉胚的玻璃粉量越多，成苗量下降，涡旋90s转化条件下成苗量较低，但转化效率有所提高，获得2株GUS阳性苗。将染色后的棉胚石蜡切片后发现茎尖分生组织被染色且多层细胞能被着色。移栽成活78株幼苗，成活率为72.2%，用高浓度（200g/L）卡那霉素筛选幼苗叶片，筛选效果不明显。PCR检测到3株幼苗能扩出494bp条带，GUS染色叶片后未被着色，为假阳性。结论：农杆菌LBA4404转化效果较好；菌液浓度OD_(600)为0.8时转化效果较好；方法1的侵染效果较好。不同玻璃粉量及涡旋时间越长对棉胚及茎尖分生组织损伤越严重，越难以发育出幼苗，但涡旋时间越长有利于转化。对幼苗检测后未获得转基因植株，该方法转化效率较低。
参考文献：
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