邵吉民[1]2001年在《大肠癌相关基因ST13/SNC6表达的蛋白质研究》文中研究指明大肠癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。现已明确包括癌基因、抑癌基因、错配修复基因、细胞周期调控相关因子突变等的一系列积累，形成了恶性肿瘤发生发展的基础，但仍不能完全解释大肠从正常上皮到癌转移的整个过程中的所有分子变化，且缺乏适合于大肠癌特异性诊断和治疗的目的基因。因此，大肠癌相关新基因的识别、克隆及其结构和功能的研究，对于阐明大肠癌的发生发展机理及大肠癌的防治具有重要意义。 为在分子水平寻找与人大肠癌发生发展相关的新因素，郑树等应用减式探针在正常人肠粘膜组织cDNA文库中，筛选到在正常人肠粘膜组织和肠癌组织中差异表达的新基因SNC6（Genbank登录号HSU17714），并对新基因的结构及功能在核酸水平作了一系列的研究，1998年被国际命名委员会命名为ST13（Suppression of Tumorigenicity 13）基因。ST13基因cDNA全长3145bp，ORF编码一个由369个氨基酸组成的蛋白质；该基因定位于染色体22q13区带，共有12个外显子及11个内含子；ST13 mRNA在不同肿瘤细胞系及组织中表达不一，在大肠癌组织中的表达低于大肠正常粘膜。ST13基因在大肠癌低表达可能与其上游表达调控的改变有关。转基因体外研究表明ST13基因过表达有抑制大肠癌细胞系生长的作用；荷瘤裸鼠体内实验观察到ST13基因有抑瘤作用，并使肿瘤转移能力下降。在NCBI最近公布的22号染色体的人类基因图谱中收录了ST13基因。上述研究结果显示ST13基因有望作为新的大肠癌负相关基因加以研究和利用。 基因的功能最终表现在其所编码的蛋白质。mRNA水平的研究能提供一些有关基因表达水平和组织分布等信息，但许多实验表明mRNA表达与蛋白质表达并非完全一致，蛋白质表达还存在翻译后加工修饰、降解、转运、定位以及蛋白质之间的相互作用等复杂现象。人类基因组计划的初步完成也意味着后基因组时代L 己经来临，以了解蛋白质在体内的活动规律和功能为基础的功能基因组研究正成DD 为主命科学研哭的页姿万同。为此，本买验在核酸水干对sT13 泉凶研五的是础Dl 上，诺一步研究ST13某因表达的蛋白质本身的特。吐，以期最终在蛋白质水平阐ll 明ST13 ＄因的结构乃功能。l11．ST3某因的原核表达及蛋白纯化：将ST13。DNAORF经PCR扩增，重组 l构建 ST13 cDNA／pGEX－4T－2凉核表达质粒。阳性豆隆质粒以 BamH限制性酶切l 和 DNA序列分析筛选。转化E．c。h凿表认GST．ST13融合蛋白。蛋白表达以 lISDSPAGE及Westernblot证实。GST－ST13融合蛋白主要存在于诱导表达菌的可 ll 溶性上清，经 Glutathione Sepharose 4B一步亲和层析纯化，表达量占大肠杆菌总 ll 蛋白20％，回收融合蛋白2．smMi，纯度达gi．3％。GST．ST13融合蛋白以凝血酶 lD 切得主u盯13齿日。D12．ST13 蛋白单克隆杭体的制各：以原核表达的 GST．ST13 融合蛋白免疫 lIBALB／C小鼠，按杂交瘤技术建立了3个持续分泌抗ST13蛋白单抗的细胞株，单ll 抗的 ELISA效价为旷～旷，Western blot证实该单抗在原核、培养细胞及组织水 ll 平均具有高肛的特异性，可用干检测组织表达的ST13 i自。制备ST13 i臼免授lD 莱和屏析杆，纯化诬茧抗。D13．ST3ffi白的生物学特性：以盯 单抗作免没组织化学和Western七＊，检ll 测 ST13蛋白在提取的组织总蛋白及各种组织切片中的表达，研究该蛋白的生化 ll 特征、细胞内定位及组织分布。以盯 单抗作Western七lot表阴，Lg核细胞、RIl 核细胞系及人大肠组织表达的 ST13蛋白的 SDS4？AGE表观分子量均为 50KD，比 lD 其计算分子量约大 10 KD（计算分子量 41二24 KD），但脱糖基化实验表明该齿臼 Dl 在直核细胞中不存在糖某化修饰。以 ST13 单抗作免疫组化表明该蛋白表达于 ll“SW480细胞、大肠猫膜上皮细胞浆，在胞浆中呈均匀分布；结合 ST13蛋白的氨 lD 某酸绸成及模拟立体结构亲水性计算机分析，推测该蛋白为细胞浆可溶性蛋臼分DD 子。在免疫组化己检测的大肠、十二指肠、胃、胰腺、肝、胆管、肺、’厅、乳腺、D121l 卵巢及子宫内膜等正常组织和／或肿瘤组织中，可见到ST13蛋白主要表达于上皮D 组织，均定位于细胞浆：结果还提示S＊13蛋白在各种正常及肿瘤组织中的表达D 程度不同，其中正常胃、大肠上皮组织呈强阳性表达，相应的癌组织呈低表达；l 乳腺、卵巢及子宫内膜癌组织表达高于相应的正常组织；正常肺泡上皮、支气管D 上皮为阴性或弱p［1性，肺低分化?
董庆华[2]2004年在《大肠癌相关基因ST13功能研究》文中提出大肠癌是常见的恶性肿瘤，占所有癌症的9％—15％。大肠癌的发病过程一般较长，从正常上皮、增生、腺瘤、原位癌到转移，有明显的阶段性。大肠癌发生发展的多基因参与、多步骤及多阶段的分子事件模式已明确包括癌基因、抑癌基因、错配修复基因以及细胞周期调控相关因子突变等。但这些仍不能完全解释大肠癌从正常上皮到癌转移的整个过程中的所有分子变化。 为寻找与大肠癌相关的新因素和分子事件，1993年本研究所应用减式探针从正常人的cDNA文库中筛选到正常人肠粘膜组织和肠癌组织中差异表达的新基因ST13，对ST13基因的结构、染色体定位、核酸和蛋白表达及功能所作一系列的研究表明：ST13基因组序列为32017bp，有12个外显子、11个内含子；核酸外显子为3127bp，内含子为28890bp；ST13基因定位于染色体22q13区带；其cDNA全长为3145bp，ORF编码一个由369个氨基酸组成的蛋白质；ST13基因在不同肿瘤细胞系及组织中表达不一，大肠癌组织中mRNA表达低于正常粘膜，但是不同方法研究ST13基因表达与临床病理特征的关系得出的结论并不一致；ST13蛋白主要分布于上皮，为细胞浆蛋白质，在多种组织有不同程度的表达；体内研究提示它可能与细胞生长和转移有关。 随后不久，美国Hartl研究组报道(Cell，1995)了一个与Hsc70相互作用的蛋白HIP(Hsc70-interacting protein)，明确其为一分子共伴侣蛋白，参与调节分子伴侣——真核细胞热休克蛋白Hsc70。HIP可与Hsc70的ATPase结构域结浙江大学博士学位论文合，帮助稳定Hsc70的ADP构象，使Hsc70高亲和底物蛋白，从而参与Hsc70与不同靶蛋白的相互作用。1996年，Smith研究小组从网状细胞裂解液中分离出P48蛋白，可与Hsp70、Hspgo、Hsp6o等结合，参与形成孕激素受体。根据序列分析，ST13与HIP、P48为同一蛋白分子。进一步研究明确了ST13分子存在多个分子功能区:N一端功能区、TPR(tetratrieopeptide repeats)功能区、GGMP重复序列、C端的p60/Stil区等。据此推测ST13蛋白具有与多种细胞凋亡子相互作用的潜在分子特性，可能为一新的凋亡子，对细胞凋亡的整体平衡起至关重要的调控作用。 本研究目的为:研究万刀3基因在大肠癌组织和正常配对组织中mRNA表达情况，明确S刀了基因表达与大肠癌临床病理特征之间的关系;研究S刀3基因和蛋白功能，明确S刀3是否参与细胞凋亡调控及可能作用机理。具体研究内容如下:1.用荧光定t pCR方法检侧SrIJ基因在大肠盛组级和细脑系中的裹达 用Real一time PCR方法检测50对大肠癌组织和正常配对大肠组织S刀3基因mRNA表达，另外检测了四株大肠癌细胞(SW480、SW62O、Lsl74T、RKO)和l株正常肠上皮细胞(N工C)的万刀3基因mRNA表达。结果表明ST13基因在大肠癌中的表达低于配对正常组织，差异有显着性(P<0.05)。ST13基因表达与肿瘤组织分化程度、组织分期程度、有无淋巴结转移、癌组织侵润程度等差异没有统计学意义。SW620细胞STj了基因表达最低，SW480和RKO细胞表达居中，Lsl74T和NIC细胞表达较高。2.用anti s.ns。转染法研究SnJ基因功能 构建antisense转染质粒peDNA3.l一/ST13，转染K562细胞后用G418筛选出6株克隆细胞和1株空载体对照细胞。K562细胞在antisense转染后，6个克隆细胞株中只有K5细胞ST13蛋白表达knockdown约40%，K5细胞对泰素和阿霉素的药物敏感性增加，相同浓度药物作用下，K5细胞存活率较空载体对照明显下降;细胞周期阻滞于GZ/M期。3.用引洲^技术研究STIJ鑫因功能 化学合成3种SIRNA，转染K562细胞后ST13蛋白表达knoekdown约40%，细胞对泰素和阿霉素的药物敏感性增加，相同浓度药物作用下，细胞存活率明显下浙江大学博士学位论文降;细胞周期变化不明显，GZ/M期略有上升;培养第6天细胞自发凋亡率对照为1.55%，siRNAI、siRNAZ、siRNA3分别增加到7.36%、14.5%和8.44%。另外构建瞬时表达siRNA质粒载体psileneerl.0 U6/ST13，细胞ST13表达knockdown不明显，细胞对药物敏感性略有增加，细胞周期无明显变化。4.sT13受白功能的研究 用免疫共沉淀方法明确HSp70是否与ST13相互作用，western一blot验证免疫共沉淀产物，结果表明ST13蛋白可与Hsp7O相互作用。观察细胞在热休克条件下 (42℃作用1小时、45℃作用10分钟)ST13蛋白表达变化、细胞周期变化及其对药物敏感性变化，结果表明热休克后4小时ST13和Hsp70蛋白表达量明显增加，此时细胞对药物的敏感性降低，细胞周期在热休克前后变化不明显。最后用无细胞重组系统5100，观察加入ST13InAb或GST一ST13后Pro一Caspase3/Caspase3、pro一Caspaseg/Caspaseg、Hsp7o、ST13蛋白的表达量变化，明确sT13蛋白是否参与细胞凋亡，结果表明5100在加入ST13mAb后，Hsp70表达量降低，ST13表达降低，Pro一Caspaseg/Caspaseg表达量增高，Pro一Caspase3/Caspase3表达量变化不明显。 结论:1 .5刀3基因在大肠痛中的表达低于配对正常组织，结合临床病理特征统计学差 异不明显。2 .Knockd~K562细胞夕刀3基因后，细胞对药物敏感性增加，细胞自
白文启, 梁小波, 李建民[3]2005年在《大肠癌负相关基因ST13的研究进展》文中指出ST13基因是近几年中国医学研究者新发现的一种与大肠癌发病有关的负相关基因。已被N C BI作为新基因接受。其序列与伴侣分子p48完全相同,如O R T为1.1kb,编码氨基酸369个,蛋白质计算分子量为41.324,SD S蛳PAG E表现相对分子质量约4.8×104,故被认为是同一蛋白。ST13/p48还称H ip或热休克蛋白结合蛋白。ST13基因定位于人染色体22q13,cD N A全长3145bp。就ST13基因的历史、属性、染色体定位、蛋白表达、实验室检测方法和基因的功能研究方法作一综述。
徐伟乐[4]2010年在《ST13基因多态性与结直肠癌发病风险的关联研究》文中提出目的:ST13基因(Suppression of Tumorgenecity13 Gene)是一种应用减式杂交技术筛选出来的结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)负相关基因, ST13基因多态性与CRC发病风险的研究国内外均尚未见报道,本研究旨在探讨ST13基因rs5758098A/G、rs138335G/C、rs138344C/G单核苷酸多态性(SNP single nucleotide polymorphisms)与CRC遗传易感性的关系,从分子生物学水平为结直肠癌的预防和诊治提供依据。方法:本研究采用病例-对照研究方法,收集200例结直肠癌患者和200例健康对照个体的静脉抗凝血各5ml,同时记录其病史和个人相关资料。采用蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法提取外周血白细胞DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性( polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法分别对rs5758098 A/G、rs138335G/C、rs138344C/G叁个SNP位点进行基因分型。数据统计分析采用SPSS11.5版软件包(SPSS Company, Chicago, Illinois, USA)进行,P<0.05认为有统计学意义。病例组与对照组的年龄差异行t检验,性别差异行四格表χ2检验,用卡方检验比较各位点基因型频率的观察值与预期值并进行Hardy-Weinberg平衡分析。两组间的基因型分布比较采用行×列表χ2检验。以非条件Logistic回归法计算经年龄、性别校正的表示相对风险度的比值比(odds ratio, OR)及95%可信区间(confidence interval, CI)。结果:1健康对照组中的rs5758098 A/G、rs138335G/C、rs138344 C/G叁个多态位点的基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。2 ST13基因rs5758098 A/G多态的A、G等位基因频率在病例组和对照组分别为84.3%、15.7%和83.0%、17.0%,两组相比无显着差异(P>0.05);A/A、A/G、G/G 3种基因型频率在病例组和对照组中分别是:69.0%、30.5%、0.5%和70.5%、25.0%、4.5%,两组比较有显着性差异(P=0.023)。与A/A基因型相比,携带A/G和G/G基因型均可增加CRC发病风险(OR=8.600, 95% CI=1.070~69.089和OR=10.671, 95%CI=1.299~87.647)。根据个体吸烟史进行分层分析发现,在不吸烟人群中,与A/A基因型相比,携带A/G和G/G基因型可明显增加CRC的发病风险(OR=8.175, 95%CI=1.015~65.871和OR=10.939, 95%CI=1.318~90.802)。未发现ST13基因rs5758098A/G SNP对吸烟人群CRC发病风险的影响(OR=0.923, 95%CI=0.361~2.357)。根据个体饮酒史进行分层分析发现,与A/A基因型相比,携带A/G和G/G基因型可明显增加不饮酒人群中CRC的发病风险(OR=8.427, 95%CI=1.046~67.880和OR=11.554, 95%CI=1.396~95.645)。未发现ST13基因rs5758098A/G SNP对饮酒人群CRC发病风险的影响(OR=1.347, 95%CI=0.491~3.700)。3 ST13基因rs138335 G/C多态的C、G等位基因频率在病例组和对照组分别为48.8%、51.2%和53.0%、47.0%,两组相比无显着差异(P>0.05);C/C、G/C、G/G 3种基因型频率在病例组和对照组中分别是:25.0%、47.5%、27.5%和31.5%、43.0%、25.5%,两组比较也无差异(P>0.05)。与G/G基因型相比,携带G/C、C/C基因型对CRC的发病风险无明显影响( OR=1.360,95%CI=0.798~2.315和OR=1.389,95%CI=0.866~2.228)。根据个体吸烟、饮酒状况进行分层分析发现,与G/G基因型相比,携带G/C和C/C基因型与CRC的发病风险无明显相关性。4 ST13基因rs138344 C/G多态的C、G等位基因频率在病例组和对照组分别为91.8%、8.2%和94.0%、6.0%,两组相比无显着差异(P>0.05);C/C、C/G、G/G 3种基因型频率在病例组和对照组中分别是:85.5%、12.5%、2.0%和88.0%、12.0%、0.0%,两组比较也无差异(P>0.05)。与C/C基因型相比,携带G等位基因型(C/G+G/G)与CRC的发病风险无明显相关性(OR=1.240,95%CI=0.694~2.217)。根据个体吸烟、饮酒状况进行分层分析亦发现,与C/C基因型相比,携带G等位基因型与CRC的发病风险无明显相关性。结论:1本研究结果提示:ST13基因rs5758098 A/G SNP可能与结直肠癌的发病风险有关,携带A/G和G/G基因型可显着增加CRC发病风险,尤其是在不吸烟和不饮酒人群中。2 ST13基因rs138335 G/C SNP可能与结直肠癌的发病风险无关。3 ST13基因rs138344 C/G SNP可能与结直肠癌的发病风险无关。
陈功星[5]2004年在《肿瘤相关基因ST13、MK和PLK1转录调控的研究》文中研究说明肿瘤是多个因素共同作用于组织细胞，使这部分组织细胞失去机体控制，转化为对机体正常生命现象不利的严重疾病，已经了解到它的发生、发展是内外因素共同作用的结果，外在生物、物理、化学致病因素通过内在的免疫、基因等因素，在不同的个体表现差异。内外因素作用的一个重要途径，就是使肿瘤相关基因异常表达。与肿瘤相关的基因分为两大类：癌基因和抑癌基因，癌基因与肿瘤正相关，抑癌基因则与肿瘤负相关，癌基因的活化与抑癌基因的失活，往往成为肿瘤发生、发展的重要因素。基因以表达的蛋白质形式发挥作用，从基因到蛋白遵循着中心法则，要经过转录和翻译两个环节，转录复杂而精细，由转录起始、延伸、终止和mRNA丰度调节等几个步骤完成从DNA到mRNA的过程，转录起始和mRNA丰度调节尤为重要，是影响基因表达的关键步骤，直接关系到基因功能的发挥。从这两个方面对肿瘤相关基因研究，有可能了解基因的表达情况，认识肿瘤相关基因的意义，据此找到新的肿瘤诊治方法。 ST13(Suppression of Tumorigenicity 13)基因、MK(Midkine)基因和PLK1(polo-like kinase 1)基因是近来发现的新基因，目前的研究表明它们与某些肿瘤关系密切，表达水平影响着肿瘤的发生、发展。本文将从转录起始方面探索 浙江大学博士研究生论文ST13基因转录起始区的功能特征，及其对基因表达的影响。在mRNA丰度调节方面，通过siRNA(small interferenee RNA)knoek一down袱和PLKI基因表达，了解特异化学合成小干扰RNA(SIRNA)在转录调控方面的作用，及其抗肿瘤的生物学意义。 方法与结果 第一部分:肿瘤相关ST13基因5’端启动区功能研究 根据GeneBank上公布的ST13基因全序列，查找5’端非编码区序列，运用生物信息软件分析可能的功能碱基序列片段，发现以第一个外显子5’端为转录起始位点的669bp。595一+74)序列中，含有两个CpG岛，分别是206bp介179一+28)和271bp(一540一270)，整个片段含有以SPI为主的65个转录因子结合位点，未发现TATA框。 在此基础上结合已有的研究成果，分别从5’端和3’端两个方向设计缺失系列碱基序列引物，以PGLZ一Bas ic一1894为模板进行PCR扩增，电泳割胶回收目的片段，与pGEM一T Easy载体进行TA克隆，限制性内切酶消化鉴定阳性克隆，测序分析，目的片段与PGLZ系列报告载体亚克隆成pGLZ系列报告重组分子，经限制性内切酶消化验证，构建了系列ST13基因碱基序列缺失片段与pGLZ系列报告载体重组的瞬间表达质粒。 提取纯化瞬间表达质粒和内参照pSV一旦一Galactosidase质粒，定量，用脂质体共同转染SW620细胞，48小时后，裂解细胞取上清，分别测试荧光素酶与半乳糖昔酶活性，以半乳糖营酶的表达校正荧光素酶的活性，比较ST13基因不同大小碱基序列片段，对下游报告基因荧光素酶表达的作用，发现669bp(一595~+74)序列为含有增强子的转录启动区。 用实时定量PCR(Real一Time PCR，RT一PCR)法分析Beap一37、SMMC一7721和SW620细胞株中ST13基因的表达情况，并用Western Blot法测试了这叁株细胞中的ST13蛋白表达，ST13基因在mRNA水平呈现Beap一37>SMMC一7721)SW620，表达水平均较 渐扛大学俘士研宪生伦文高，而蛋白水平表达则看不出差异。 构建的瞬间表达重组质粒pGLZ一Bas ie一669，转染Beap一37、SMMC一7721和Sw620细胞，检测荧光素酶活性，发现重组质粒pGLZ一Bas ic一669在SW62O细胞中的表达活性，要明显高于其它两株细胞。 第二部分siRNA knock一do肋袱基因表达证NA的研究 提取肝细胞癌SMMC一7721细胞株中的总RNA，测定浓度，逆转录成cDNA，利用荧光标记探针，以GAPDH基因cDNA为内参照，在同一PCR反应体系中，Real一TimePCR(RT一PCR)观测GAPDH基因和MK基因的cDNA扩增过程，选定适当的参数，采集CT值，用GAPDH的表达相对定量MK的表达，建立了基因表达相对定量PCR方法。 设计化学合成针对MK基因表达mRNA的6种特异SIRNA双链，经脂质体转染SMMC一7721细胞，处理一定时间后，提取总RNA逆转录成cDNA，RT一PCR检测，以内参照GAPDH基因的表达相对定量MK基因表达的mRNA，处理组对比空白对照，发现6种75nM的siRNA作用48小时后，均敲除了MK基因表达的50%以上，其中MDKZ、MDK3和MDKS叁组敲除mRNA达97%以上，浓度、时间曲线表明，这叁种51 RNA在1 onM处48小时达到较理想的作用效果，敲除了MK基因表达mRNA的70%以上。 按照以上条件，用细胞制片染色、流式细胞计数、DNA电泳，均未发现S朋C一7721细胞在细胞周期、凋亡方面的改变。 用RT一PCR法分析37例大肠癌临床样本，发现27例明显降低，10例变化无统计学意义。 第叁部分siRNA knoek do，ns贾480细胞中PLKI基因表达的研究 50nM浓度的10种化学合成的特异性PLKI基因SIRNA，经质脂体转染SW480细胞，作用24小时后，RT一PCR检测，均敲除了PLKI基因表达mRNA达25%以上，其中Pl、P4和Pg叁种siRNA在80%以上
田吉顺, 郑树[6]2006年在《大肠癌相关基因ST13研究进展》文中提出肿瘤抑制基因13(ST13)是用减数杂交技术在cDNA文库中筛选到的大肠癌相关基因,其在大肠癌中的表达低于周围正常黏膜组织。通过序列分析可知,ST13蛋白与热休克蛋白70互作蛋白(Hip)为同一蛋白,参与调解蛋白分子折迭、转运、降解等过程。现综述目前对ST13蛋白分子结构、分子共伴侣作用以及与肿瘤相关的研究。
史影[7]2004年在《新型丝氨酸蛋白酶SNC19生物学特性及肿瘤转移功能的研究》文中进行了进一步梳理肿瘤的发生发展是一个多因子参与多阶段的复杂过程。随着肿瘤分子生物学的飞速发展，越来越多的分子事件被大家所认识。探明各种相关因素，寻找新的肿瘤诊断与治疗的靶基因、靶蛋白，不仅对揭示肿瘤的发病机制具有重要意义，也为肿瘤的早期诊断及治疗甚至预防提供了依据。 为在分子水平寻找与人大肠癌发生发展相关的新因素，浙江大学肿瘤研究所应用减式杂交技术在正常人肠粘膜组织cDNA文库中，筛选到在正常人肠粘膜组织和肠癌组织中差异表达的新基因SNC19。并对该基因的序列结构、染色体定位、mRNA的表达及功能作了一系列的研究。研究表明：SNC19的基因组DNA全长为50420bp，包括19个外显子：cDNA全长为3142bp，共编码855个氨基酸，预计分子量为95KD。基因被定位于11号染色体q24-25区。其mRNA的表达主要分布在上皮来源的组织和细胞中。原位杂交显示大肠癌淋巴结转移组癌旁粘膜SNC19 mRNA表达阳性率(64.7％)高于无淋巴结转移组(15.4)，有显着性差异(P＜0.05)。对SNC19编码蛋白的功能区进行预测显示它是一个Ⅱ型跨膜蛋白，其N端在膜内，C端在膜外，由较短的胞内区，跨膜区和较长的胞外区组成，在胞外区的羧基端具有丝氨酸蛋白酶活性区域。该预测提示作为一种跨膜丝氨酸蛋白酶，它可能参与细胞表面的蛋白水解，介导一系列细胞功能乃至肿瘤的侵润转移等行为。飞 浙汀大学俘士研充生伦文 与此同时，肠keuchi等在人前列腺癌细胞系PC一3中克隆得到一新的丝氨酸蛋白酶基因MT-SPI，所报道序列与sNC19完全一致，并获得了其丝氨酸蛋白酶的水解底物PARZ和sc一uPA[6，7〕。Lin.CY等在人乳腺癌细胞系T-47D及乳汁中分离得到了一种新的丝氨酸蛋白酶MatriPtase，其cDNA序列为SNclg的一部分，所缺为N端的一段序列，并在体外证明可水解pro一uPA和pro一HGF/sF形成活性upA和HGF/sF侈91。而EPithin和XMT-sPI分别是小鼠和非洲爪蟾中获得的与sNC19同源性极高的基因[l0.川。uPA和HGF/sF均被认为与ECM的降解及肿瘤细胞的侵润非常相关，因此我们推测sNC 19舰T-spl/m aptriptase可能是一转移相关基因，它和其它蛋白因子一起构成一个复杂的调控网络共同影响肿瘤的侵润和转移。目前尚需更多的证据来证实上述观点。 为进一步研究SNC19与肿瘤转移的关系，了解该蛋白质的表达水平、翻译后加工、定位及蛋白质之间的相互作用、内外部环境条件对它的影响，即蛋白质本身的特性及功能研究显得非常必要。为此，我所制备了针对SNC19膜外区(氨基酸565一855)的单克隆抗体，并经筛选，克隆化培养和特异性检测，最后挑选出单克隆抗体株ZMGg。在此基础之上，本论文作了如下研究:1 .SNclg编码蛋白在肿瘤细胞系和组织中的表达及分布 用所选SNC19单克隆抗体株ZMGg对乳腺癌细胞系BCAP37、大肠癌细 胞系C0LO205、SW480、SW620中SNC19蛋白的表达状况进行检测，发现 在前叁种细胞系中主要特异性条带出现在120KD处，而SW620中未检测到 该条带。在所选的叁个大肠癌肿瘤组织中出现了120KD、95KD和75KD叁 种条带。用该单抗对细胞及组织标本做免疫组化，所选C0LO205细胞和食 道鳞癌组织标本的鳞癌细胞中、大肠癌组织癌细胞、子宫内膜癌组织癌细胞浙江大学俘士研究史伦文 中SNC 19蛋白表达均为阳性，并可见细胞膜阳性现象。2 .SNC19编码蛋白在真核细胞中加工及明胶酶活性研究因在第一部分的实验中发现所选肿瘤细胞系用ZMGg单抗检测到SNC19蛋白的主要形式为1 20kDa，比预计分子量95kDa大。而所选肿瘤组织中SNC19蛋白的形式有多种。因此推测SNC19蛋白存在翻译后加工。为证明该观点并检测真核表达sNC19蛋白的功能，本实验构建了PseetagZA一sNC19(ORF)真核表达质粒，并转染至真核细胞BCAP37中表达，产物经NiZ气nitrilotriaeetat。柱亲和纯化，用anti一His单抗检测得到120KD和75KD两种形式，证明了翻译后加工的存在。明胶酶活性检测发现75KD的具有较强的明胶酶活性，120KD和原核表达的全长SNC19(ORF)一GST融合蛋白均未检测到该活性。3.SNC19蛋白对细胞生物学行为的影响为观察SNC19蛋白与细胞生长、增殖、迁移、粘附等与肿瘤生长及转移密切相关的细胞生物学行为的关系，利用单抗阻断法设计了一系列细胞生物学实验。和对照组相比，SNC19蛋白被阻断后，细胞生长周期、平板克隆形成率均无明显差异，细胞迁移能力下降，短时间内细胞的同质、异质粘附能力增强，随后粘附能力的差异逐渐减小。4.SNC19结合蛋白的研究利用免疫共沉淀法用SNC19单克隆抗体ZMGg从BCAP37细胞中钓到一结合蛋白，经胶内酶解及Q一TOF串联质谱测序得到一段含16个氨基酸残基的序列，经生物信息学查询确定为aetin(F一aetin)。用NetPhos软件对SNC19蛋白膜内区的磷酸化位点进行分析显示在SNC19蛋白膜内区24位氨基酸残基上有一个丝氨酸残基磷酸化位点，它的匹配率达到0.971。用anti一SNC19 mAb浙汀大学俘士研究浇伦文封闭SW480细胞，24小时后用罗丹明一鬼笔环肤染
刘凤琴, 李素红, 李建民[8]2006年在《SNC6基因在大肠癌中的表达及与其生物学行为的关系研究》文中研究说明目的通过观察SNC6基因在大肠癌中的表达,结合临床病理及随访资料探讨其与生物学行为之间的关系。方法随机抽取经过山西省肿瘤医院1991—1992年诊治,有较完整的临床病理及随访资料的大肠癌病例92例,对每例病例的蜡块重新连续切片。其中苏木素-伊红(HE)切片按照最新的临床和组织学分类标准重新复习。其余切片采用免疫组织化学SP方法,进行单克隆抗体SNC6基因标记。用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。使用χ2检验,Kaplan-Meier生存分析。结果大肠癌SNC6基因表达与患者年龄、性别、肿瘤部位、组织学类型、淋巴结转移以及肿瘤的临床分期均无明显相关性(P>0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示:随着SNC6的表达增强,患者的生存时间明显延长,生存率明显提高。结论SNC6的表达与肿瘤的预后有关,是判断肿瘤预后的重要指标。SNC6可以作为判断大肠癌预后的一个独立指标。
孙立峰[9]2004年在《SNC19/ST14基因的表达对大肠癌细胞生物学特性及其转移相关基因表达的影响》文中指出近年来肿瘤的发病率和死亡率呈上升趋势，复发和转移是恶性肿瘤致死的重要原因。随着肿瘤分子生物学的飞速发展，肿瘤转移的分子机制成为最热门的研究领域之一，但迄今对转移机制仍缺乏明确详尽的解释。目前已认识到，肿瘤的转移是一系列持续选择的过程，包括：肿瘤细胞对细胞外基质(ECM)的识别、对ECM的降解、细胞迁移、在脉管内转运播散以及转移器官的选择。其中恶性细胞与ECM的相互作用被认为是恶性肿瘤细胞转移过程中最关键的分子事件之一。肿瘤细胞必须识别和降解其周围的ECM才能发生侵润和转移。因此研究ECM降解酶对认识和控制肿瘤转移具有重要的意义。与肿瘤细胞的侵润有关的一种ECM降解酶家族被称为丝氨酸蛋白酶家族包括(尿激酶型(uPA)，弹性蛋白酶(elastase)，组织蛋白酶G(cathepsin G))等。最近又发现一个丝氨酸蛋白酶家族的新成员--Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶家族(type Ⅱ transmenbrance serine proteases，TTSPs)，其家族成员广泛分布于各种组织细胞的膜上，参与降解ECM、水解活化细胞膜蛋白、与细胞骨架相互作用及信号传导等作用，而且可能还与肿瘤细胞的侵润转移有关。SNC19／ST14／MT-SP1／Matriptase基因被认为是TTSPs基因家族的一个成员。 SNC19基因是1993年浙江大学肿瘤研究所郑树教授等应用减式杂交技术从正常大肠cDNA文库中筛选到的一个大肠癌新相关基因，1995年被Genbank作为新基因登录，1998年国际基因命名委员会将SNC19命名为ST14。随后，从不同物种的组织细胞、乳汁和肿瘤细胞系中，得到多个SNC19／ST14基因的同源产物，如Matriptase，膜型丝氨酸蛋白酶(membrance-type serine proteinase-1，MT-SP1)，Epithin，XMT-SP1，Matriptase-2和M-matriptase-2。SNC19／ST14蛋白现被命名为ST14／MT-SP1／Matriptase／TADG-15；EC 3.4.21。蛋白酶活化受体—2(proteinase-activated receptor 2，PAR2)、浙偏工，冤学仁件d匕月丸亡比论文单链尿激酶型纤维酶原激活剂(Urokinase一type plasminogen aetivator，u队)的前体一sc一uPA和肝细胞生长因子/扩散因子(Hepatocyte growth几etor/scatterfaetor，HGF/SF)的前体一pro一HGF/SF被证实是MT-Spl彻atriptase的作用底物「8，。u队与ECM的降解及肿瘤细胞的侵润密切相关，而HGF/SF能刺激肿瘤细胞相互作用、基质粘附、迁移、侵润和血管生成‘’‘，。SNC19/ST14/MT一SPI有丝氨酸蛋白酶的结构域，具有胰蛋白酶样活性，可直接降解ECMls，。另外，我所用原位杂交方法发现淋巴结转移组大肠癌旁粘膜SNC19表达阳性率(64.7%)高于无淋巴结转移组(巧.4%) (P<0.05)。国外学者研究发现MatriPtase/MT一SPI还高表达于前列腺、乳腺癌、子宫颈癌组织中”5，’6.”，;本所通过免疫共沉淀方法及Q一TOF MS/MS测序发现，SNC 19/ST14蛋白与细胞骨架蛋白F一actin能相互作用。这些研究结果显示SNC 19/S T14/MT-SPI/MaPtriPtase可能与肿瘤的转移相关，可能参与了肿瘤侵润和转移过程。但无直接的证据表明SNC 19/S T14是促进还是抑制转移以及其影响转移的具体机制。为了进一步研究SNC 19/sT14/MT-Spl/Maptriptase在肿瘤侵润和转移过程中所起的作用，本论文作了以下研究: 1、建立稳定表达况NCI刃夕T14全长阅读开放窗(ORF)的大肠癌细胞系一RKO一SNC19/ST14 构建况NC了隽害T14全长口丑F的真核表达重组质粒，并用阳离子脂质体转染入不表达况NCI洲兮T14基因的结肠癌细胞系RKO细胞中，转染细胞在选择培养液中克隆化培养，筛选稳定表达况NCZ州夕T14基因的细胞，得到一株群体细胞RKO一SNC19/ST14一1和一株单克隆细胞RKO一SNC19/ST14一2;RT-PCR和Real一TirnePCR可检测到两株细胞都有及NCI勿污T14基因的表达;Western Blot检测到两株细胞都表达一约86.5KD的况NC了久6.TI4蛋白;免疫组化显示况N亡Z刃夕TI4蛋白主要表达于RKO一SNC19/ST14细胞浆和细胞膜。RKO细胞表达况NCI火夕T14后，丝氨酸蛋白酶的活性明显升高。 2、采用Mieroarray和Real一Time PeR技术，检测RKo细胞表达￡Nc了孵T14基因后，肿瘤转移相关基因表达的变化 5人乞了马书7’14基因在大肠癌RKO细胞中表达后，影响了26个转移相关基因的表达;有巧个基因表达的变化可产生促进肿瘤细胞转移的效应，有n个基因表达变浙叁工大学博士.学位论义化可抑制肿瘤细胞转移;其中变化最显着的抑制转移的基因有青元冰~I(增加了约550倍);变化最显着的促进转移的基因有:IG矛’2(增加了约1500倍)，ETSZ(增加了约230倍)，I创材况ETV4(增加了约600倍)，MGA万(增加了约840倍)，而ETSZ柳ETv4是一类较为关键的转录因子，使几打沙乃，M刹”柳弄了dsPin等的表达发生变化而促进肿瘤细胞转移;另外研究发现，在检测基因表达差异时，Real-Time尸C左与几打‘roarray法能够得到基本一致的结果。 3、研究RKO细胞表达左NC了势份T14基因后，其细胞生物学行为的改变 体外试验:用MTT法分别测定细胞的群体倍增时间(To)，与ECM的粘附能力的变化;流式细胞仪测定细胞周期的变化;罗丹明一鬼笔环肤标记细胞的骨架蛋白F
参考文献：
[1]. 大肠癌相关基因ST13/SNC6表达的蛋白质研究[D]. 邵吉民. 浙江大学. 2001
[2]. 大肠癌相关基因ST13功能研究[D]. 董庆华. 浙江大学. 2004
[3]. 大肠癌负相关基因ST13的研究进展[J]. 白文启, 梁小波, 李建民. 肿瘤研究与临床. 2005
[4]. ST13基因多态性与结直肠癌发病风险的关联研究[D]. 徐伟乐. 河北医科大学. 2010
[5]. 肿瘤相关基因ST13、MK和PLK1转录调控的研究[D]. 陈功星. 浙江大学. 2004
[6]. 大肠癌相关基因ST13研究进展[J]. 田吉顺, 郑树. 国际肿瘤学杂志. 2006
[7]. 新型丝氨酸蛋白酶SNC19生物学特性及肿瘤转移功能的研究[D]. 史影. 浙江大学. 2004
[8]. SNC6基因在大肠癌中的表达及与其生物学行为的关系研究[J]. 刘凤琴, 李素红, 李建民. 山西医药杂志. 2006
[9]. SNC19/ST14基因的表达对大肠癌细胞生物学特性及其转移相关基因表达的影响[D]. 孙立峰. 浙江大学. 2004
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