赵平[1]2001年在《大鼠急性胰腺炎动物模型的建立和相关性肺损伤发生机制的初步研究》文中研究说明急性胰腺炎（acute pancreatitis AP）是一种由于胰管阻塞、胰管内压突然增高以及胰腺血液供应不足等原因引起的胰腺急性炎症，表现为胰蛋白酶激活后的胰腺自消化，引起胰腺和全身性炎症反应过程。在外科急腹症中它的发病率仅次于急性阑尾炎、急性肠梗阻、急性胆囊炎和胃、十二指肠穿孔，是普通外科常见急腹症之一。其发病率大约为40/10万。大约80％的急性胰腺炎症状较轻，很少或没有并发症，死亡率很低。但有20％的病人可发生胰腺坏死，激发全身性反应综合症[SIRS]，其死亡率高达40％。死亡多发生在发病后第一周内（占总体死亡的60％），死亡原因几乎都与呼吸衰竭有关。鉴于目前对急性胰腺炎相关肺损伤的发病机制还缺乏足够的认识，有必要加强其研究，以提高AP的临床诊治水平。 本研究在建立用不同浓度的牛胆酸钠（NaTc）逆行注射胆胰管诱发不同炎症反应程度AP动物模型的基础上，模拟AP由轻度水肿型逐渐发展至出血坏死型的临床病理过程。应用免疫组织化学方法检测了AP发生发展过程中，肿瘤坏死因子（TNF-a），细胞间粘附分子-1（ICAM-1）和一氧化氮合成酶（NOS）等关键炎症介质在胰腺和肺脏组织中不同的表达情况，初步探讨上述因子在AP发展过程中引起胰腺炎症和相关肺损伤的作用，为提高临床诊治水平提供实验基础。其主要结果和结论如下： 1．利用牛胆酸钠成功诱导大鼠急性胰腺炎不同病理过程动物模型。通过对术后活体动物观察；胰腺、肺脏水肿程度观察；血清、腹水酶学检测；胰腺大体病理形态；光镜、电镜观察，结果发现该系列动物模型炎症轻重明显，与临床上急性胰腺炎发生发展过程极其相似，同时具有模型稳定、重复性好等优点，不失为一种研究急性胰腺炎发病机制的理想动物模型。 2．正常大鼠胰腺和肺部组织内不表达TNFa。随着炎症的加重，巨噬细胞逐渐增多，TNF－a表达水平逐渐升高，提示TNF《是调节炎症反应的一个关键性炎症介质。 3。正常大鼠胰腺组织内不表达或低水平表达！CAM。1，随着炎症的加重，其表达逐渐升高，与炎症程度和内皮细胞损伤程度紧密相关，提示TNF化与凡AM4相互作用可诱导白细胞附壁、外渗，是内皮细胞和组织损伤及体液外渗的分子生物学基础。肺组织的ICAM－1 只在出血坏死型AP出现表达明显升高，提示它是远距离脏器损伤的一个主要的细胞因子。 4．正常大鼠胰腺和肺组织内不表达或低水平表达NOS。随着炎症的加重，其表达逐渐升高，与炎症程度和内皮细胞损伤程度紧密相关，提示它在炎症微循环中具有损伤和保护的双向调节作用。 5．电镜结果显示胰腺和肺部血管内皮细胞的结构破坏、细胞间连接受损，是胰腺炎相关性肺损伤的形态学基础。
刘明东[2]2010年在《JNK通路在急性胰腺炎相关性肺损伤的作用机制及丹参酮ⅡA的干预作用研究》文中研究说明研究背景急性胰腺炎是以胰腺间质水肿、出血、腺泡细胞空泡变性、坏死及炎症细胞浸润为病理特征、病变程度不一、结局难以预料的急性炎症性疾病。急性胰腺炎常伴有全身炎症反应,约20%发展为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP),其病死率可高达30%-50%。随着国人生活习惯和饮食结构的变化,我国急性胰腺炎(包括重症胰腺炎)的发病呈现增高的趋势。因此,SAP是目前我国常见的、严重威胁人类健康的重大疾病。急性胰腺炎相关性肺损伤(acute pancreatitis-associated lung Injury, APALI)是急性重症胰腺炎最早出现、最常见、也是最为严重的全身并发症。急性胰腺炎相关性肺损伤发病机制复杂,近年来很多实验性研究集中在炎性细胞和炎性介质激活途径上,一般认为肺损伤是全身炎症反应在肺部的局部表现,而肺脏由于其组织特异性易于发生炎性损伤。积累的大量证据表明胰腺实质中活化的单核巨噬细胞、多核粒细胞释放的TNF-α、LI-1和IL-6等多种促炎细胞因子不仅有助于启动急性胰腺炎局部炎症的形成和发展,而且也是导致包括肺损伤在内全身炎症反应的重要细胞因子,促炎因子的过表达不仅加重了急性胰腺炎的损伤程度,同时也加重了胰腺炎相关性肺损伤的的严重程度。所以降低重症胰腺炎肺组织中炎症因子的水平一直是人们研究如何治疗急性胰腺炎相关性肺损伤的方向。大量的动物实验证明,降低全身或肺组织中炎性细胞因子的水平对急性胰腺炎相关性肺损伤具有治疗作用。但是在急性胰腺炎相关性肺损伤的发病过程中引起肺组织中炎性细胞因子水平增加的原因和机制目前尚不清楚,只有在发病机制上找到原因才能给我们对急性胰腺炎相关性肺损伤的治疗带来理论指导,从而大大降低急性重症胰腺炎的死亡率。最近,JNK信号通路在急性胰腺炎发病中所起的作用越来越受到人们的关注。研究显示,在急性胰腺炎的动物模型中,JNK信号通路被激活,JNK信号通路的激活与炎症因子密切相关,JNK信号通路被激活是胰腺损伤的早期事件,运用JNK通路特异性阻断剂SP600125,可以通过抑制JNK信号通路的激活来下调TNF-α、ICAM-1、IL-1β等促炎症因子的表达,明显减轻胰腺的病理损害,对急性胰腺炎具有治疗作用。由此可见JNK信号通路在急性胰腺炎的发病过程中起着重要的作用。同时人们发现JNK信号通路的激活在肺损伤的发病过程中起着重要的作用,体外动物实验表明,JNK信号通路的激活在镍、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的急性肺损伤中起着重要的作用,而且应用特异性JNK信号通路阻断剂对肺损伤的治疗,特别是脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(一种被认为与急性胰腺炎相关性肺损伤有相同的发病途径)的治疗均取得了一定的效果。但到目前为止,JNK信号通路在急性胰腺炎相关性肺损伤中的作用机制尚不清楚。本实验分为两个部分：第一部分JNK通路在急性胰腺炎相关性肺损伤的作用及其机制；第二部分：丹参酮ⅡA对急症胰腺炎相关性肺损伤的干预作用。第一部分：JNK通路在急性胰腺炎相关性肺损伤的作用及其机制目的本研究旨在观察JNK信号通路在牛磺胆酸钠诱导的大鼠急性出血坏死性胰腺炎肺组织中的激活情况,并探讨JNK信号通路激活与肺组织损伤程度的相关性；同时应用特异性JNK通路阻断剂SP600125,进一步证实JNK信号通路激活在急性胰腺炎相关性肺损伤发病过程中所起的作用。方法SD大鼠72只,分为3组,每组24只。S组：假手术对照组,24只大鼠,开腹后翻动大鼠十二指肠并轻触胰腺数次,缝合腹部；SAP组：以1ml／kg的剂量逆行胰胆管注射灭菌5%牛磺胆酸钠,诱导大鼠急性出血坏死性胰腺炎模型,这种模型类似于人类的重症胰腺炎；SP600125干预组：在急性出血坏死性胰腺炎大鼠模型诱导前30分钟,以15mg／kg的剂量通过腹腔注射SP600125；每组分3小时、6小时、12小时和24小时4个时间点,各时间点大鼠数目为6只。按计划于各时间点处死大鼠,收集血清及胰腺和肺组织。肺水肿严重程度以肺组织湿干重比表示；以碘一淀粉比色法测定血清淀粉酶,ELISA方法测定肺组织TNF-α水平和工L-1β水平,H.E染色用于胰腺和肺组织损伤的病理学评价,采用分光光度计测定肺组织中髓过氧化酶(MPO)、免疫组化方法测定肺组织中ICAM-1表达,用Westernblot方法对肺组织中JNK和PJNK进行蛋白定量。结果假手术对照组3hr、6hr、12hr、24hr血清淀粉酶分别为501±85、512±91、518±94和532±86,胰腺病理损伤评分为0；肺脏病理损伤评分为0,肺湿干重比为2.29±0.10、2.22±0.23、2.17±0.11和2.31±0.13；肺脏MPO活性为1.33±0.56、1.56±0.43、1.51±0.23和1.47±0.48；肺组织IL-1β含量为80.3±21.2、92.3±23.5、87.3±19.4和89.7±22.1；肺组织TNF-α含量为70.6±21.2、67.6±19.8、68.4±19.5和74.5±22.6；肺组织ICAM-1免疫组化阳性积分S组0.11±0.01、0.17±0.02、0.14±0.02和0.16±0.09；PJNK相对光密度值为0.65±0.12。SAP组3hr、6hr、12hr、24hr血清淀粉酶分别为2506±215、3701±264、4101±411和3212±295；胰腺病理损伤评分8.24±0.63、10.65±1.02、14.00±0.96和14.09±0.75；肺脏病理损伤评分为3.0±0.4、4.7±0.7、7.5±0.3和6.5±0.7；肺湿干重比为3.52±0.42、3.96±0.15、4.53±0.08和4.26±0.12；肺脏MPO活性为5.64±0.76、6.44±0.77、7.19±0.83和7.36±0.71；肺组织IL-1β含量211.2±19.3、315.4±34.2、399.2±43.2和353.4±38.3；肺组织TNF-α含量为348.5±42.8、433.5±63.4、394.3±56.3和365.3±39.9；肺组织ICAM-1免疫组化阳性积分为0.8±0.09、104±0.11、1.44±0.12和1．22±0.13；PJNK相对光密度值为1.03±0.22、1.24±0.17、1.38±0.21、1.28±0.24。与假手术对照组相比,SAP组在各个时间点的血清淀粉酶、胰腺病理损伤评分和肺脏病理评分均显着增高(P<0.05),我们成功的建立了重症胰腺炎相关性肺损伤的动物模型,SAP组个时间点的肺湿干重比、MPO活性、IL-1β含量、TNF-α含量、ICAM-1表达均明显增高,JNK蛋白总量无变化,但各时间点的PJNK蛋白均显着高于假手术对照组(P<0.05)。应用特异性JNK信号通路阻断剂SP600125后,检测肺组织3hr、6hr、12hr和24hr肺脏病理损伤评分为2.1±0.3、3.2±0.2、6.0±0.7和4.0±0.3；肺湿干重比为SP600125组3.08±0.09、3.54±0.22、3.35±0.16和3.01±0.38；肺脏MPO活性为3.36±0.36、4.27±0.52、5.16±0.26和5.46±0.61(单位：u／g)；肺组织IL-1β含量为154.3±11.2、221.4±21.5、289.4±23.4和267.7±15.1(单位：pg／mg)肺组织TNF-α含量为243.8±32.3、317.6±22.8、272.3±20.5和225.5±32.6(单位：pg／mg)；肺组织ICAM-1免疫组化阳性积分为0.59±0.18、0.77±0.20、0.84±0.23、0.93±0.31；PJNK相对光密度值为0.69±0.14、0.58±0.22、0.85±0.17、0.18±0.05。与SAP组相比,SP600125组各个时间点的肺湿干重比、MPO活性、IL-1β含量、TNF-α含量、ICAM-1表达均明显降低,JNK蛋白无明显变化,但PJNK蛋白显着降低,同时肺脏病理损伤评分明显改善(P<0.05)。通过相关性比较我们发现,肺组织PJNK表达与肺病理损伤评分存在显着相关性(P<0.05)。结论：1、利用5%牛磺胆酸钠逆行大鼠胰胆管注射可建立良好的APALI动物模型,为研究APALI的机制及探讨防治策略提供了试验平台。2、JNK通路激活是重症胰腺炎相关性肺损伤发病的早期事件,其激活可能参与了APALI的发生和发展。3、应用JNK通路阻断剂对急性胰腺炎相关性肺损伤有治疗作用,第二部分：丹参酮ⅡA对急症胰腺炎相关性肺损伤的治疗作用目的评价传统中药丹参酮的有效单体丹参酮ⅡA对大鼠急性胰腺炎相关性肺损伤是否具有治疗作用,并初步探讨其治疗机理。方法SD大鼠72分为3组,每组24只。S组：假手术对照组,24只大鼠,开腹后翻动大鼠十二指肠并轻触胰腺数次,缝合腹部；SAP组：以lml／kg的剂量逆行胰胆管注射灭菌5%牛磺胆酸钠,诱导大鼠急性出血坏死性胰腺炎模型,这种模型类似于人类的重症胰腺炎；丹参酮ⅡA组：在急性出血坏死性胰腺炎大鼠模型诱导前30分钟,以20mg／kg的剂量通过腹腔注射丹参酮ⅡA。每组分3小时、6小时、12小时和24小时4个时间点,各时间点大鼠数目为6只。按计划于各时间点处死大鼠,收集血清及胰腺和肺组织。肺水肿严重程度以肺组织湿干重比表示；以碘一淀粉比色法测定血清淀粉酶,ELISA方法测定肺组织TNF-α水平和IL-1β水平,H.E染色用于胰腺和肺组织损伤的病理学评价,采用分光光度计测定肺组织中髓过氧化酶(MPO)、免疫组化方法测定肺组织中ICAM-1表达,用Westernblot方法对肺组织中JNK和PJNK进行蛋白定量。结果S组肺湿干重比为、2.12±0.23、2.15±0.11和2.33±0.23；肺脏MPO活性为1.23±0.26、1.66±0.33、1.54±0.21和1.42±0.28；肺组织IL-1β含量为82.3±11.2、95.3±21.5、82.3±18.4和92.7±21.1；肺组织TNF-α含量为72.6±11.2、69.6±13.8、69.4±12.5和77.5±21.6；肺组织ICAM-1免疫组化阳性积分S组0.11±0.01、0.17±0.02、0.14±0.02和0.16±0.09；SAP组肺脏病理损伤评分为3.1±0.3、4.6±0.6、7.6±0.3和6.6±0.7；肺湿干重比为3.62±0.43、3.98±0.35、4.54±0.28和4.27±0.12；肺脏MPO活性为5.66±0.66、6.47±0.73、7.21±0.84和7.41±0.72；肺组织IL-1β含量212.2±18.3、319.4±32.2、402.2±41.2和357.4±34.3；肺组织TNF-α含量为351.5±41.8、443.5±53.4、397.3±51.3和365.3±37.9；肺组织ICAM-I免疫组化阳性积分为0.81±0.09、1.14±0.11、1.45±0.12和1.26±0.13。应用丹参酮ⅡA干预后,我们检测肺组织中3hr、6hr、12hr和24hr时间点各项指标的结果分别为：肺湿干重比为3.17±0.29、3.24±0.22、3.49±0.26和3.21±0.38；肺组织MPO活性为4.03±0.39、4.75±0.55、5.66±1.26和5.45±0.719(单位：u／g)；肺组织IL-1β含量为174.3±15.2、211.4±17.5、297.7±21.4和277.9±15.6(单位：pg/mg);肺组织TNF-α含量为253.8±27.3、337.6±22.3、312.3±22.5和311.5±32.6(单位：pg／mg)；肺组织ICAM-1免疫组化阳性积分为0.63±0.15、0.82±0.19、1.01±0.23和0.96±0.31；肺脏病理损伤评分为2.2±0.3、3.6±0.2、6.3±0.7和5.1±0.3；PJNK相对光密度值为1.15±0.08、1.05±0.23、1.34±0.18、0.74±0.16。与SAP组相比,PJNK蛋白显着减少(P<0.05),肺组织湿干重比、肺组织中MPO活性、细胞因子IL-1β和TNF-α的含量、肺组织中ICAM-1的表达均显着性减少(P<0.05),同时肺脏病理损伤评分显着改善(P<0.05)。结论1、丹参酮ⅡA对实验动物的APALI具有治疗作用2、抑制JNK信号通路可能是丹参酮ⅡA治疗作用的重要机制
吴爱荣[3]2007年在《褪黑素对重症急性胰腺炎大鼠及趋化因子MCP-1、MIP-2表达影响的实验研究》文中研究说明第一部分褪黑素对重症急性胰腺炎大鼠影响的实验研究目的探讨褪黑素(MT)对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠及其相关性肺损伤的保护作用和可能的作用机制。方法35只SD大鼠随机分为假手术组(SO)组、重症急性胰腺炎(SAP)3h、6h、12h组和MT 3h、6h、12h处理组。采用4%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射制备SAP动物模型,MT组在诱导SAP前0.5h给予腹腔注射MT20mg/kg。检测血淀粉酶、乳酸脱氢酶(LDH)、胰腺及肺组织湿干比、胰腺及肺组织中脂质过氧化物(MDA)、髓过氧化物酶(MPO),观察胰腺和肺的病理组织学改变。结果SAP组各时间点血清淀粉酶、胰腺及肺组织湿干比、胰腺及肺组织中脂质过氧化物(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)均较假手术(SO)组明显增高,3h、6h、12h胰腺及肺的病理损伤呈进行性加重(P<0.05或P<0.01)。MT组各时间点血清淀粉酶、胰腺及肺组织湿干比、胰腺及肺组织中脂质过氧化物(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)均较相应时间点SAP各组显着降低,3h、6h、12h胰腺及肺的病理损伤较SAP相应时间点明显减轻(P<0.05或P<0.01)。结论MT能明显改善SAP时胰腺及肺组织的病理损伤,其保护作可能与清除氧自由基有关。第二部分褪黑素对重症急性胰腺炎大鼠趋化因子MCP-1、MIP-2表达的影响目的探讨褪黑素(MT)对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)与巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2)表达的影响。方法35只SD大鼠随机分为假手术组(SO)组、重症急性胰腺炎(SAP)3h、6h、12h组和MT 3h、6h、12h处理组。采用4%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射制备SAP动物模型,MT组在诱导SAP前0.5h给予腹腔注射MT20mg/kg。采用实时定量RT-PCR法检测胰腺及肺组织中MCP-1mRNA与MIP-2mRNA的表达,经免疫组化检测肺组织中MCP-1与MIP-2及NF-κB蛋白的表达。结果SAP各组胰腺及肺组织中MCP-1mRNA与MIP-2mRNA表达较SO组明显上调,并随SAP病变的加重表达逐渐增强。浸润到肺组织的白细胞明显增多并表达NF-κB、MCP-1蛋白和MIP-2蛋白(P<0.05或P<0.01)。MT处理后各组胰腺及肺组织中MCP-1mRNA与MIP-2mRNA较SAP组表达明显下调,浸润到肺组织的白细胞表达NF-κB、MCP-1蛋白和MIP-2蛋白较SAP组减少(P<0.05或P<0.01)。结论趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)与巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2)在SAP的发病机制中可能具有重要作用,MT在SAP中的保护作用可能与下调胰腺及肺组织中MCP-1及MIP-2表达有关。
陆奕[4]2010年在《骨髓间充质干细胞对重症急性胰腺炎大鼠损伤胰腺的组织修复作用》文中认为急性胰腺炎是常见急腹症之一,其中约10-20%的患者可发展为重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis,SAP)。SAP发病凶险,预后差,临床死亡率高。目前,临床上对SAP的治疗仍以抑制胰酶分泌和合成,预防性应用抗生素和营养支持等保守治疗为主,缺乏特异有效的治疗方法。据报道,骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)参与了急性胰腺炎的发病过程,动员MSCs可减轻SAP病情,改善其预后。本课题以SAP大鼠模型为研究对象,给予SAP雌性模型大鼠输注同种属雄性来源的MSCs,观察移植后SAP大鼠胰腺的病理损伤修复情况,明确同种异体来源的MSCs能否在SAP病理状态下迁移至损伤的胰腺组织,及不同微环境对MSCs迁移、分化的影响,初步探讨MSCs对SAP大鼠胰腺损伤修复的机制。一、骨髓间充质干细胞的原代和传代培养目的：建立骨髓间充质干细胞原代及传代的培养方法,通过培养传代,扩增出足量的骨髓间充质干细胞,为以后的实验做准备。方法：在无菌条件下剪去大鼠双下肢,分离股骨,于超净台上剪开骨端,用10%胎牛反复冲洗髓腔直至骨干发白,1000rpm离心5分钟,弃上清,按5x105／cm2密度接种于含10%胎牛的DMEM+F12培养基中培养。24h内观察细胞的贴壁情况,此后,每12h观察细胞贴壁情况,待细胞生长至培养瓶面积80%时传代。首次传代后继续定期观察、传代。传至第叁代(P3)时,胰酶消化,收获细胞并计数。进行流式检测及细胞活力测定。结果：约24h后MSCs开始贴壁,贴壁后MSCs呈纺锤形及叁角形等形态,并趋向集落样生长。经传代培养后,细胞成份逐渐得到纯化,至P3代时细胞形态单一MSCs占90%以上。流式细胞检测结果显示,代表MSCs的CD29+CD44+CD45-细胞群,经过传代培养,其所占比例逐渐增大,细胞群的组成逐渐趋于单一,至P3代时,CD29+CD44+CD45"细胞群达到95%以上。培养至P3代时细胞活力最好,约为96%,P4代后活力逐渐下降。结论：本部分实验建立了稳定的MSCs原代和传代培养方法。获得的MSCs经贴壁传代培养,纯度达95%以上,流式鉴定结果显示为CD29+CD44+CD45细胞群。这为下部分实验提供了充足的MSCs产品。二、重症急性胰腺炎大鼠模型的建立目的：制作SAP动物模型,为研究胰腺损伤修复提供简便、可靠、重复性及可比性均较好的模型,了解大鼠SAP模型的病程规律,并为下一步实验提供关键的时间点。方法：雌性SD大鼠46只,体重250-300g,随机分为2组：正常对照组(CON组,n=6)；SAP造模组(SAP组,n=30)。SAP组分为4h、12h、24h、48h、72h 5个时间点,每个时间点有6只大鼠。CON组大鼠3只不做任何操作处理,3只腹腔注射生理盐水2次。另取大鼠10只,均SAP造模,观察72h死亡率。造模前12h起禁食,自由饮水,将L-精氨酸溶于9g/L生理盐水中配制成浓度为20g/L的L-精氨酸溶液,调整pH值至7.0左右,2次腹腔注射(2.5g/kg体质量),中间间隔1h。在造模后4h、12h、24h、48h、72h处死动物,检测血清淀粉酶,获取胰腺、肺等组织,固定、石蜡包、切片、H&E染色,依据schmidt及Mayer评分法进行评分。并观察叁组动物72h的存活情况。结果：造模后血清淀粉酶水平4h(4684±1844.4U/L)、12h (6940±1451.5U/L)、24h(9981±2901.6U/L)、48h (3431±1368.5U/L)、72h(1498±1865.9U/L)均显着高于正常对照组(P<0.05)。其中造模后24h组血清淀粉酶水平显着高于其他各组(P<0.05)。连续观察72h以上,正常组大鼠死亡率为0,SAP组大鼠死亡率为40%。显微镜下观察正常对照组胰腺组织结构清晰,腺泡小叶完整,间质无渗出。SAP组造模后4h即可见胰腺间质水肿,大量炎细胞浸润。12h胰腺腺泡细胞坏死。24h可观察到胰腺组织大片坏死,出血及明显炎细胞浸润。48h坏死加重,腺泡小叶结构严重破坏,可见皂化斑。72h胰腺组织坏死到达最高程度。胰腺病理评分显示,造模后4h起,胰腺病理评分即显着升高,至造模后72h胰腺病理评分达到高峰。结论：本部分实验成功复制出L-精氨酸诱导的大鼠SAP模型,该模型制作方法简单,价廉,不需特殊材料及设备,可重复性好,损伤小,病变程度在不同的胰腺部位比较均匀一致,克服了其他模型需行剖腹术等缺点,大大减少了外源性细菌污染的机会,且与人类SAP的病程及组织学改变相似。是研究急性胰腺炎发病机制及防治措施较为理想、值得推广的动物模型。并且发现,SAP 24h时模型动物的胰腺病理损害最为严重,死亡率达高峰,因此,在后部分的实验中,我们选择24h为SAP模型的主要观测时间点和干预治疗时间点。叁、同种异体骨髓间充质干细胞移植对实验性重症急性胰腺炎的病情减轻作用目的：明确同种异体来源的骨髓MSCs能否减轻SAP大鼠病情,能否对大鼠损伤胰腺发挥保护或修复作用。方法：将SD大鼠随机分为2组：SAP+MSCs移植组(n=20):SAP大鼠接受同种异体MSCs移植治疗；SAP+培养基输注组(n=20):SAP大鼠接受等体积培养液。MSCs传代培养方法同第一部分。SAP动物模型制作方法同第二部分。MSCs移植组于SAP造模后24h输注P3代以上MSCs,约5-7×107/只。培养基输注组则于SAP造模后24h输注等体积培养液,2组大鼠均于输注后24h处死其中10只大鼠,抽取心尖血,测血清淀粉酶值,获取胰腺组织,一部分用于抽提RNA行RT-PCR检测TNF-a、IL-1βmRNA表达情况,另一部分组织用于H&E染色,并行胰腺病理评分。剩余10只大鼠用于观察72h存活情况。结果：SAP+MSCs移植组大鼠的胰腺病理评分显着低于SAP+MSCs移植组(P<0.05)。两组大鼠的血清淀粉酶水平差异比较无统计学意义,但各时间点SAP+MSCs移植组血清淀粉酶水平相对较低。MSCs移植输注组胰腺组织TNF-a,IL-1βmRNA表达显着低于SAP+培养基输注组(P<0.05)。MSCs移植组大鼠的72h生存率显着高于培养基输注组。结论：MSCs移植治疗可以降低SAP模型大鼠胰腺TNF-a,IL-1βmRNA的表达水平,减轻SAP大鼠胰腺病理损伤,改善SAP病情,提高SAP大鼠的存活率。四、同种异体骨髓间充质干细胞向重症急性胰腺炎大鼠胰腺的迁移和分化目的：观察同种异体MSCs在正常大鼠与SAP大鼠胰腺组织中的迁移、分化情况,了解不同微环境对MSCs迁移、分化的影响,初步探讨MSCs对SAP大鼠胰腺损伤修复的机制。方法：将雌性SD大鼠随机分为3组：正常+MSCs移植组(n=10)：正常大鼠接受同种异体MSCs移植输注；SAP+MSCs移植组(n=10)：SAP大鼠接受同种异体MSCs移植治疗；SAP+培养基输注组(n=10):SAP大鼠输注等体积培养液。MSCs取自雄性SD大鼠,其传代培养方法同第一部分,传至第叁代后,经DAPI标记染色。SAP动物模型制作方法同第二部分,为雌性SD大鼠。MSCs及培养基移植输注方法同第叁部分。叁组大鼠均于移植输注后72h处死大鼠,获取胰腺组织标本,病理评分胰腺炎症损伤程度,采用原位杂交(Chromogenic in situ Hybridization, CISH)的方法追踪MSCs迁移、运动的轨迹,并将原位杂交与CK19及a-淀粉酶免疫组化染色共定位。结果：移植入的MSCs可以迁移至受体大鼠各脏器。且无论是正常胰腺还是SAP受损胰腺,MSCs均能迁移至胰腺组织中,但不同的微环境对MSCs的招募能力不同,正常+MSCs移植组中迁移入的MSCs呈散在分布于腺泡细胞、胰岛、胰管及血管上皮细胞中,SAP+MSCs移植组中迁移入的MSCs多集中分布在某些腺泡细胞、胰岛细胞或胰管上皮细胞中,我们还发现无Y染色体阳性显色的胰腺组织损伤较严重,腺泡结构破坏明显,有较多坏死组织及炎细胞浸润,而Y染色体阳性显色部位,腺泡结构较为完整。并经免疫组化染色证实迁移入的MSCs能分化为表达CK19的胰腺干细胞、胰管上皮或胰岛细胞及表达a-淀粉酶的胰腺腺泡细胞。结论：炎性损伤的胰腺组织具有招募MSCs的能力,MSCs能定向迁徙和分化为部分胰腺组织细胞,并能减轻大鼠胰腺局部的炎症反应。全文小结本课题采用L-精氨酸2次腹腔注射法成功诱导SAP大鼠模型,通过对SAP病情指标的评估,确定24h为MSCs移植时间点。采用贴壁法,对MSCs进行原代和传代培养,进而应用同种异体MSCs移植治疗SAP,发现MSCs移植,可以降低SAP模型大鼠胰腺TNF-a,IL-1βmRNA的表达水平,减轻SAP大鼠胰腺病理损伤,改善SAP病情,提高SAP大鼠的存活率。炎性损伤的胰腺组织具有招募MSCs的能力,MSCs能定向迁徙、定居和分化为部分胰腺组织细胞。
明广峰[5]2012年在《PBEF在重症急性胰腺炎并发急性肺损伤中的作用机制研究》文中研究说明研究背景重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)合并急性肺损伤(acute lung injury, ALI)起病急剧,病情进展凶险,常导致约30%-40%的死亡率。细胞因子和炎症介质的过度释放增强肺微血管内皮细胞的通透性而导致肺水肿是ALI主要病理机制之一。前B细胞克隆增强因子(pre-B-cell colony-enhancing factor, PBEF)是一种新发现与肺损伤发生密切相关的肽类激素。既往资料显示,PBEF参与了多种肺损伤的病理过程,主要与增强肺微血管内皮细胞的通透性而导致肺水肿的发生密切相关。但PBEF在SAP并发ALI发病机制中的作用未见报道,本实验在国内外首次对其进行研究。第一部分血清PBEF水平与重症急性胰腺炎并发急性肺损伤的相关性研究目的：检测SAP并发ALI或ARDS患者和轻症急性胰腺炎患者血清样本中PBEF、TNF-α和IL-8表达。方法：收集19例SAP并发ALI、13例SAP并发ARDS及32例轻症急性胰腺炎患者的血清样本,采用双夹心ELISA方法检测血清样本中PBEF、TNF-α和IL-8表达水平。比较分析PBEF、TNF-α和IL-8表达水平与SAP并发ALI进程的相关性。结果： SAP并发ARDS和并发ALI患者血清中的PBEF检测值显着高于轻症急性胰腺炎的患者,SAP并发ARDS患者的PBEF亦高于并发ALI患者的PBEF水平,差异均具有统计学意义(P<0.05)。同时检测TNF-α和IL-8可以得到相似的结果,并且血清PBEF与TNF-α和IL-8水平具有正相关性(r=3.215,P=0.012；r=4.247,P=0.019)。结论：SAP并发ALI或ARDS的患者血清中PBEF、TNF-α和IL-8的浓度较轻症急性胰腺炎患者血清中高；且血清中PBEF的浓度与TNF-α和IL-8的浓度分别呈正相关。第二部分PBEF在重症急性胰腺炎并发急性肺损伤大鼠模型肺组织中的表达目的：检测SAP并发急性肺损伤的大鼠模型肺组织中PBEF、 TNF-α和IL-8中的表达水平。方法：采用去氧胆酸钠逆行注入大鼠胰胆管方法诱发构建SAP并发ALI的动物模型。实验大鼠随机分为2组：假手术组(SHAM组),胰腺炎并发肺损伤组(ALI组),每组24只。通过检测大鼠模型的血清胰淀粉酶、血气分析和局部病理改变,确定SAP并发ALI的动物模型构建是否成功；应用肺损伤评分对SAP并发ALI的动物模型的肺脏进行病理组织学损伤评分；采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测SAP并发ALI发生时肺脏组织中PBEF、TNF-α和IL-8mRNA和蛋白的表达水平。结果：通过对大鼠模型的胰腺病理改变、胰淀粉酶和血气分析结果分析提示成功建立的大鼠动物模型符合重症急性胰腺炎的病理改变。分别在造模后4小时、8小时、12小时取标本观察相应数据。我们在光镜下初步比较了SHAM组和ALI组实验大鼠的肺组织病理改变结果发现,SAP并急性肺损伤组的肺损伤评分在造模后4小时即可见升高,12小时内逐渐升高差异有统计学意义(P<0.05)；SAP并急性肺损伤组的肺湿/干比值明显增加,并随时间延长逐渐加重,较SHAM组差异具有统计学意义(P<0.05)。我们运用荧光实时定量PCR检测了PBEF、TNF-α和IL-8mRNA在相应时间点SAP并发ALI模型肺脏组织中的表达情况。结果显示：各时间点ALI组PBEF mRNA、TNF-α mRNA和IL-8mRNA表达较SHAM组显着上调,差异有统计学意义(P<0.05)。采用Western blot方法检测了同一批标本中相同时间点的PBEF、TNF-α和IL-8蛋白的表达,结果显示蛋白表达亦明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：从动物模型的肺组织水平观察到了PBEF、TNF-α和IL-8叁者在SAP并发急性肺损伤时表达增高。第叁部分PBEF介导人肺微血管内皮细胞急性损伤的分子机制目的：通过体外培养肺细胞肺微血管内皮细胞(PMVEC),采用基因重组和转染技术,在PBEF过表达或抑制并细胞因子TNF-a刺激的条件下,观察IL-1p、IL-6和IL-8表达水平的改变；同时,检测在特异性抑制P38、ERK1/2、JNK和PI3K信号通路的条件下的表达改变,探讨PBEF在SAP并发ALI中的作用分子机制。方法：构建pEGFP-N1-PBEF-EGFP过表达重组质粒和慢病毒pLKO.1-PBEF-SiRNA干扰质粒,转染体外培养的PMVEC细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测PBEFmRNA和蛋白表达水平；流式细胞仪检测PBEF过表达对PMVEC细胞凋亡的影响。细胞因子TNF-α分别刺激pEGFP-N1-PBEF和pLKO.1-PBEF-SiRNA转染的PMVEC细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测IL-1β、IL-6和IL-8表达水平。进一步在分别阻断P38(阻断剂为U0126)、ERK(阻断剂为SB203580)、JNK(阻断剂为SP600125)和PI3K信号通路(阻断剂为LY294002)条件下,TNF-a诱导PBEF过表达的PMVEC细胞,荧光定量PCR和Western Blot检测IL-1β、IL-6和IL-8表达水平。结果：(1)重组质粒pEGFP-N1-PBEF酶切和测序鉴定结果显示符合后续实验的要求。转染PBEF过表达载体后,PBEF表达水平明显提高,其中mRNA水平为对照的10倍左右,较对照组差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,PBEF过表达可以促进HPMEC发生细胞凋亡,较对照组差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)TNF-α诱导和PBEF过表达载体转染时,IL-1β、IL-6和IL-8表达明显增强,且以10ng/mL浓度的TNF-α诱导后,IL-1β、IL-6和IL-8表达增强更明显(P<0.05)。(3)pLKO.1-PBEF-SiRNA转染细胞后PBEF表达抑制率约为85%,PBEF siRNA能明显抑制PBEF的表达,TNF-α诱导同时进行PBEF siRNA转染后,PBEF可以对抗TNF-α的诱导作用,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)用SB203580抑制P38通路后,IL-1β、IL-6和IL-8表达下降具有统计学意义(P<0.05)；PD98059抑制ERK通路后,IL-1β、IL-6和IL-8表达下降亦具有统计学意义(P<0.05)。用SP600125抑制JNK通路后仅IL-8表达水平下降比较明显,差异具有统计学意义(P<0.05)；用LY294002抑制PI3K通路后,IL-1β、IL-6和IL-8表达变化差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论：1,在PMVEC中,TNF-α和PBEF有协同作用；2,本研究首次发现在PMVEC中PBEF可能主要通过P38和ERK通路进行信号转导而促进IL-1β、IL-6和IL-8表达。
李峰[6]2010年在《姜黄素对重症急性胰腺炎大鼠急性肺损伤作用的实验研究》文中研究说明目的:探讨姜黄素(Curcumin)对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)大鼠急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的作用及其可能机制。方法:健康清洁级SD大鼠45只,随机分为A组(假手术组)15只、B组(SAP组)15只、C组(SAP+姜黄素干预组)15只。对逆行胰胆管穿刺注射法加以改进,采用5%的牛磺胆酸钠诱导大鼠SAP以及相关性ALI模型。叁组大鼠均于术后6小时再次剖腹。肉眼观察腹腔和胰腺的大体病理学改变。采血检测动脉血氧分压(PaO2)、二氧化碳分压(PaCO2)以及血清淀粉酶活性。收集胰腺组织,切片观察。延长切口进胸,肉眼观察胸腔和肺的大体病理学改变。取左肺,测算肺湿/干重比值。取右肺,制作石蜡标本切片观察:予苏木素-伊红(HE)染色,显微镜下观察并评分;采用免疫组织化学SABC法检测核因子-κB(nuclear factor kappa binding,NF-κB)蛋白的表达情况并进行半定量分析。结果:1术后6小时B、C组大鼠胰腺大体、镜下观察呈SAP改变,且C组病变较B组减轻。2术后6小时B、C组大鼠肺大体、镜下观察呈ALI改变,且C组病变较B组减轻。3叁组大鼠术后6小时肺组织的镜下病理学评分分别为:A组:0.33±0.49、B组:7.33±0.98、C组:5.27±0.80;其中A组<B组、C组(P<0.01),B组>C组(P<0.01)。4叁组大鼠术后6小时血清淀粉酶的活性分别为:A组:1063.20±112.39 U/L、B组:7319.27±201.37 U/L、C组:4252.87±199.41 U/L;其中A组<B组、C组(P<0.01),B组>C组(P<0.01)。5叁组大鼠术后6小时的PaO2分别为:A组:95.67±2.97 mmHg、B组:54.47±3.34 mmHg、C组:73.47±4.03 mmHg;其中A组>B组、C组(P<0.01),B组<C组(P<0.01)。6叁组大鼠术后6小时的PaCO2分别为:A组:37.40±2.90 mmHg、B组:54.73±3.24 mmHg、C组:45.00±2.48 mmHg;其中A组<B组、C组(P<0.01),B组>C组(P<0.01)7叁组大鼠术后6小时的肺湿/干重比值分别为:A组:4.13±0.34、B组:9.05±0.39、C组:6.14±0.28 mmHg;其中A组<B组、C组(P<0.01),B组>C组(P<0.01)。8叁组大鼠术后6小时肺组织中NF-κB p65的阳性表达率分别为:A组:0%、B组:100%、C组:60%;其中A组<B组(χ~2=5.96 P<0.01)、A组<C组(χ~2=4.92 P<0.01)、B组>C组(χ~2=2.07 P<0.05)。9术后6小时B、C组大鼠肺组织中NF-κB的表达与肺损伤的严重程度呈显着正相关关系(B组:rs=0.589 P<0.01;C组:rs=0.803 P<0.01)。结论:1 SAP大鼠ALI时,肺组织中存在着NF-κB的过度表达,并与肺部病变的严重程度呈正相关关系,提示NF-κB在APALI发生、发展的过程中发挥着重要的作用。2姜黄素对SAP大鼠ALI具有保护作用,其机制与抑制肺组织中NF-κB的表达有关。
崔洪章[7]2017年在《PBEF在重症胰腺炎肺损伤发病机制中的作用及清胰汤干预的实验研究》文中认为急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是临床上一种常见的急性腹部疾病,约有15~20%的患者发展成为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)。SAP的病情发展迅速,并发症多,因而在临床上死亡率一直居高不下。在SAP发展的早期阶段,肺部是首先受到损伤的胰外器官,造成急性肺损伤(acute lung injury,ALI),ALI的进一步发展可以导致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),ARDS是SAP早期死亡的重要原因。SAP导致ALI的发病机制有多方面的因素,涉及到内毒素、肠屏障、微循坏、炎性介质和细胞因子连锁反应等多个相关的环节。机体过度失控的炎症反应以及促炎介质的大量释放可能是在ALI的发生中起关键性作用的因素,这一点国内外专家和学者已经形成共识。前B细胞克隆增强因子(pre-B-cell colony-enhancing factor,PBEF)是一种肽类激素,作为具有促进B前体细胞成熟功能的细胞因子于1994年首次被发现。PBEF的主要生理学功能为调控B细胞的细胞增殖、分化、凋亡等。2005年,美国学者叶水清教授等对ALI动物模型和病人的PBEF基因多态性进行了研究,发现PBEF在ALI诊断中具有生物标志作用,也提示其在急性肺部疾病的基因诊断中具有潜在的应用价值。研究表明,PBEF参与了脓毒症患者和机械通气所致的急性肺损伤。在对一些疾病的研究中还发现,PBEF可以延缓中性粒细胞(polymorphonuclear leukocytes,PMN)凋亡,PMN的凋亡延迟会导致炎症因子释放增多,加重炎症反应。有学者在对急性胰腺炎的研究发现,患者血液中的PBEF表达量与疾病发展程度呈正相关。多年的临床观察和实验研究已经证实,中药清胰汤通过通里攻下、清热解毒、活血化瘀、疏肝理气等机制能够有效治疗急性胰腺炎,并在临床上得到了广泛的应用。其组方中的大黄和芒硝为是典型的通里攻下药,也是《伤寒论》经典名方——大承气汤的主要组成部分,具有峻下热结、软坚润燥、破痞除满等功效。大黄的主要活性成分——大黄素(emodin)已被证实具有多种药理学功能。近年来的研究发现,清胰汤可以减轻sap导致的炎症反应、改善sap导致的器官损伤等等,对于防止sap的进一步发展发挥重要作用。虽然对于清胰汤在sap中的作用已经有较多报道,但是对于清胰汤在sap中的作用机制仍不十分清楚。本课题主要探讨清胰汤及大黄的主要活性成分大黄素是否通过抑制pbef、促进pmn细胞凋亡而对sap发挥治疗作用,以期从新的角度探讨急性胰腺炎肺损伤的发病机制。并进一步探究清胰汤治疗sapali的作用机理,为临床上中西医结合治疗重症急性胰腺炎肺损伤提供进一步的实验依据。本研究制备了sap-ali大鼠模型,检测了对照组、sap模型组、药物处理组大鼠血清淀粉酶的含量,并对肺、胰组织进行he染色及tunel染色观察组织病理特征以及细胞凋亡情况,检测肺、胰组织的湿/干重比来评估组织水肿情况,综合探究清胰汤对sap大鼠的治疗作用;通过免疫组化方法观察肺、胰组织中pbef蛋白的表达情况,通过real-timepcr和westernblot实验观察外周血pmn中pbef的基因和蛋白的表达情况;并对外周血pmn细胞进行凋亡检测以及凋亡相关蛋白的表达情况,探究清胰汤对肺和胰腺组织中pbef的表达及pmn细胞凋亡的影响。在体外细胞实验中,利用lps刺激外周血pmn细胞模拟体外炎性环境,并用大黄素干预后检测细胞凋亡和凋亡相关蛋白的表达情况。第一部分:清胰汤对重症急性胰腺炎大鼠急性肺损伤治疗作用的观察目的:观察清胰汤对模型的治疗作用,探讨清胰汤对sap大鼠肺胰组织损伤、组织水肿以及肺胰细胞凋亡的影响。方法:采用向胰胆管内逆行注射牛黄胆酸钠溶液的方法制备大鼠sap模型,用碘-淀粉比色法检测血清淀粉酶水平,用he染色观察肺和胰腺的病理学变化;用tunel法检测肺和胰腺组织中细胞凋亡情况,测量肺、胰组织湿/干重比来评估组织水肿程度。结果:sap大鼠血清淀粉酶水平明显升高,清胰汤能够有效降低淀粉酶水平;he染色结果显示,清胰汤可以改善sap造成的肺和胰组织出血、炎性细胞浸润等情况;湿/干重比检测结果显示,sap模型大鼠的肺、胰组织水肿严重,在经过清胰汤处理之后得到明显改善;tunel检测显示,与sap模型组相比清胰汤处理组大鼠肺、胰细胞凋亡比例明显减轻。结论:清胰汤能够降低sap大鼠血清淀粉酶的水平,能够缓解sap造成的肺、胰组织水肿、细胞坏死等病理学表现,抑制肺、胰细胞凋亡。第二部分:清胰汤对重症急性胰腺炎大鼠肺损伤作用机理探讨目的:探讨清胰汤对sap大鼠模型肺和胰腺组织pbef的表达、pmn细胞凋亡的影响及清胰汤治疗sap的分子机制。方法:采用免疫组化检测各组大鼠肺、胰组织中pbef的表达;从大鼠外周血中分离pmn细胞,用real-timepcr法检测pbefmrna水平的表达情况;用westernblot法检测pbef蛋白水平的表达情况;应用annexinv-fitc/pi法对pmn细胞进行染色,并通过流式细胞术检测pmn细胞的凋亡比例;用westernblot检测凋亡相关蛋白fas、fasl、bax、cleavedcaspase-3、bcl-xl的表达。结果:免疫组化结果显示,在sap大鼠的肺、胰组织中pbef表达量增加,在经过清胰汤处理之后,pbef表达量下降;real-timepcr和westernblot结果显示,在pmn细胞中,清胰汤能够下调pbef的表达;流式细胞术检测pmn凋亡结果显示,sap大鼠的pmn细胞凋亡比例显着低于对照组,经过清胰汤处理之后该比例有明显提高;对其他凋亡相关的蛋白westernblot结果显示,清胰汤上调fas、fasl、bax、cleavedcaspase-3的表达,下调bcl-xl的表达。结论:清胰汤能够下调sap大鼠肺和胰腺组织pbef的表达,促进sap大鼠的pmn细胞凋亡并影响凋亡相关蛋白的表达。清胰汤可能是通过下调pbef表达来促进pmn细胞凋亡,进而对sap起到治疗作用。第叁部分:体外实验研究大黄素对pmn细胞的促凋亡作用目的:通过体外实验进一步验证大黄素能够促进pmn细胞凋亡,探讨大黄素促进pmn凋亡的相关机理。方法:分离正常大鼠外周血中的pmn细胞并用lps诱导细胞模拟体外炎性环境,给予相应的药物处理;运用流式细胞技术,采用annexinv-fitc/pi双染法检测pmn细胞的凋亡比例;用westernblot检测凋亡相关蛋白fas、fasl、bax、cleavedcaspase-3、Bcl-xL的表达。结果:凋亡检测结果显示,LPS能够显着抑制PMN细胞凋亡,而大黄素能够拮抗这一作用;Western blot得出了与体内实验一致的结果,即大黄素上调了促凋亡基因Fas、FasL、Bax、cleaved caspase-3的表达,下调了抗凋亡基因Bcl-xL的表达。结论:1.大黄素能够促进PMN细胞凋亡;2.大黄素可能通过影响PMN细胞凋亡的死亡受体途径和线粒体途径中相关蛋白的表达促进细胞凋亡;3.通过诱导PMN细胞凋亡,大黄素具有治疗其他炎症反应的潜能。
佚名[8]2002年在《作者索引》文中认为(按汉语拼音字母顺序排列,索引论文前3位作者)AAdrian W Gelb Development 0f anaesthesiology (15):1 345一1346艾玉峰应用带蒂皮瓣、肌皮瓣修复小腿骨外露、骨髓炎创面 (2):183 组织工程骨复合骨
熊玉霞[9]2009年在《泻心汤有效组分对重症急性胰腺炎相关性肠/肺损伤的保护作用与机制研究》文中研究指明目的重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是常见的急腹症,常并发肠和肺等胰外器官损伤,目前尚缺乏特异有效的治疗手段。中西医结合的治疗效果远好于单纯西医常规治疗,大黄及含大黄的复方已成为SAP临床重要的辅助疗法之一。大黄游离蒽醌-黄芩总黄酮是本课题从已完成的国家自然科学基金课题中筛选出的泻心汤抗内毒素有效组分配伍,大黄游离蒽醌和黄芩总黄酮能否具有保护SAP相关性肠／肺功能损伤的作用?配伍后是否发挥协同增效作用?本研究拟通过逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠建立SAP大鼠动物模型,在SAP诱导后3、6、12h动态观察血清淀粉酶(AMS)、肠／肺组织病理学、湿干重比、组织匀浆丙二醛(MDA)／一氧化氮(NO)／髓过氧化物酶(MPO)水平、肠／肺组织微血管通透性等多个肠／肺损伤指标的改变,以期了解SAP时肠和肺损伤之间的关系,为SAP临床治疗时肠肺同治提供理论依据,同时观察大黄游离蒽醌-黄芩总黄酮配伍对SAP相关性肠／肺损伤的干预效应,并从改善微循环障碍、抗炎抗氧化损伤、调节细胞因子水平、抑制核转录因子等多角度探讨大黄游离蒽醌-黄芩总黄酮配伍肺肠保护功能的作用机制。方法逆行胰胆管注射3.5%牛磺胆酸钠建立SAP大鼠动物模型；假手术对照组：用等剂量的无菌生理盐水替代牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射；泻心汤有效组分干预组：在SAP大鼠模型诱导前8小时和2小时,以200mg/kg的剂量分别灌胃给予大黄总游离蒽醌、黄芩总黄酮和二者配伍溶液。按计划于3、6和12小时各时间点处死各组大鼠,收集血清、小肠和肺组织。H.E染色用于小肠和肺组织损伤的病理学评价；湿肠／肺组织称重后,置于烤箱中烘烤至恒重,测定组织湿／干重比；酶化学法测定肺和肠组织匀浆中MPO、MDA和NO含量；比色法测定肺和肠组织中EBD含量,以反映组织微血管通透性；放射免疫法测定血清TNF-a和IL-1β水平；PTAH染色显示肺和肠组织微血栓；免疫组织化学法测定肠和肺组织COX-2,NF-κB和ICAM-1的表达；RT-PCR检测肠和肺组织中COX-2mRNA,iNOS mRNA和TFmRNA的表达。结果第一部分：与假手术对照组比较,SAP诱导后各时相点肺和肠组织病理学评分、湿干重比、MDA,NO、MPO和EBD含量等均明显增加(p<0.01)。大黄游离蒽醌、黄芩总黄酮和二者恶配伍具有非常突出的肺／肠保护作用,各药物干预组均明显改善SAP大鼠的肺和肠病理学损伤程度,降低病理学评分；各药物干预组均明显降低了SAP大鼠肺和肠组织各时间段MPO活性、MDA及NO水平；同样,肺和肠组织EBD含量和组织湿干重比也明显降低。各药物干预组中尤以配伍组的作用更优。第二部分：SAP诱导后各时相点大鼠血清TNF-a和IL-1β水平明显升高；PTAH染色显示SAP大鼠肺和肠组织可见较多的血栓形成,血栓多数分布于中小血管及末梢血管,部分主干血管也有血栓形成；免疫组织化学结果显示,牛磺胆酸钠诱导后,大鼠肺和肠组织NF-κB、ICAM-1和COX-2蛋白表达均明显上调；同样,肠和肺组织中COX-2mRNA,iNOS mRNA和TFmRNA的表达亦明显上调,以上各指标与假手术对照组比较差异具有显着性(p<0.01)。与SAP组比较,大黄游离蒽醌-黄芩总黄酮配伍除了对肠组织12小时COX-2表达的抑制作用不明显,对肺组织3和12小时、肠组织3和6小时ICAM-1表达的抑制作用不明显外,对其余指标均具有明显抑制效应。结论(1)SAP诱导后从3小时起即并发明显的肠和肺组织损伤,且肺和肠损伤之间具有显着相关性,本研究中尽管肺和肠损伤之间未显示出明显的因果关系,但SAP时同时存在肠和肺组织的损伤是一个基本事实,研究结果提示SAP治疗时,不管是西医还是中医,除了常规疗法外,还应考虑同时对肠和肺损伤进行治疗,研究结果不仅为SAP时肠肺同治提供了理论依据,也为SAP早期防治MODS提供了理论依据。(2)大黄游离蒽醌、黄芩总黄酮和二者的配伍明显降低血清AMS水平；改善SAP大鼠肠和肺组织的病理性损伤程度；明显降低肺和肠组织中MPO和MDA含量,减少中性粒细胞的滞留程度,降低中性粒细胞对肺和肠组织的炎性损伤和氧化应激损伤程度；明显降低肺和肠组织湿干重比、NO和EBD含量,改善组织微血管通透性和微循环障碍,具有非常突出的肺／肠保护作用,其中尤以配伍组的作用更突出,两药配伍后协同增效。(3)大黄游离蒽醌-黄芩总黄酮配伍可降低中性粒细胞对肺和肠组织的炎性损伤和氧化应激损伤程度,但其抗炎和抗氧化应激作用可能不是通过抑制ICAM-1途径实现的；该配伍抑制COX-2 mRNA的转录和蛋白的表达、抑制TF mRNA的转录,这可能是其改善肺和肠微循环障碍的重要机制；该配伍可通过抑制TNF-α、IL-1β和NO的产生,进而减轻其介导的炎症级联放大效应,减轻全身炎症反应和器官功能损伤程度：大黄游离蒽醌-黄芩总黄酮配伍明显下调了NF-κB蛋白的表达,由于NF-κB是调控TNF-α, COX-2、iNOS和ICAM-1等转录活化的主要核转录因子,由此,我们推测大黄游离蒽醌-黄芩总黄酮配伍降低肺和肠组织上述因子的表达可能是通过抑制NF-κB活性的途径实现的。
以敏[10]2012年在《桃仁改善不同病因所致血液循环障碍的药效及相关分子机制研究》文中提出血液循环障碍(blood circulation disorder, BCD)是各种原因导致的局部或全身血液循环不足,造成组织器官缺血缺氧等损伤,以及机能、代谢的障碍或衰竭,甚至威胁生命的一种病理生理状态。微循环障碍(microcirculation disturbance, MCD)则主要指局部微血流与微血管水平发生的功能或器质性紊乱,从而造成局部血液灌注的障碍。血液循环障碍相关疾病一直是临床治疗中较为棘手的问题。中医寒凝血瘀证(cold stagnation and blood stasis syndrome)简称寒证(HS),瘀热互结证(heat stagnation and blood stasis syndrome)简称热证(RS)。研究发现,寒证和热证与一些BCD相关疾病关系密切。中药在治疗寒证和热证中医表征的同时,还有明显改善其BCD的效果。因此,寻找安全、有效的中药防治BCD相关疾病,研究中药的相关药效特性、作用机制具有重要意义。中药桃仁(Taoren)为蔷薇科植物桃的种仁,已被证明有扩张血管、增加器官血流量、抑制血小板聚集、抗凝血、抗血栓、促纤溶等作用。本课题组前期研究表明,桃仁等中药能治疗不同病理环境下(寒证和热证)的中医表征,其药效可能与不同致病因素所致的BCD不同有关,但尚未对其具体不同特点深入研究。目前也尚未见对不同致病因素所致BCD的中药研究报道。因此,为了进一步认识寒证和热证大鼠模型全身及局部BCD的特点,认识桃仁对两证BCD的药效特性、作用机理及不同特点,我们对两证模型及桃仁干预的影响进行了深入研究及对比分析。研究分叁部分：第一部分：寒凝血瘀证和瘀热互结证模型血液循环障碍的特点研究目的：研究寒证和热证大鼠模型全身及局部血液循环障碍的不同特点。方法：将实验大鼠随机分为4组,每组10只：寒证正常组、寒证模型组、热证正常组,热证模型组。以-18±2℃冰柜冷冻,2小时×2次／天,连续7天建立寒证大鼠模型；腹腔注射角叉菜胶溶液连续6天,第7天皮下注射活性干酵母溶液,建立热证大鼠模型。造模第8天对各组动物观察指标：(1)观察动物中医表征,确立造模成功；(2)用微循环检测仪观察耳廓微循环血流速(Fve)、血流态(Fsc)变化；(3)用血流变检测仪检测腹主动脉血粘度(Vis)、血纤维蛋白原含量(Fib)；(4)用组织病理学(HE、PASM、改良PTAH)及病理图像分析法,观察及测量心、肺、肝、肾、脾微小动脉管径(Adia、s-Adia)、微小静脉管径(Vdia、s-Vdia)、肾血管球充盈面积(Gare)、血栓形成率(Trat)、器官实质损伤严重程度评分(Isco)。结果：(1)两证模型均出现了相应中医表征；(2)血流速两证均明显降低,血流态评分仅有热证明显降低；(3)全血粘度两证均明显增加,纤维蛋白原含量仅有热证明显增加；(4)小动脉管径仅有寒证明显增大,肾血管球充盈面积两证均明显增高；微动脉、微静脉、小静脉管径两证均无明显变化；血栓形成率两证均明显增高；实质细胞损伤评分除热证无明显肺损伤外,两证器官损伤评分均明显增高。结论：间歇低温冷冻法和角叉菜胶复合注射法可成功建立寒凝血瘀证和瘀热互结证模型。寒证和热证均存在血液循环障碍,其全身表现为血流速降低、血粘度增加；局部表现为微小血管径变化、血栓形成增加、器官实质细胞损伤。寒证与热证血液循环障碍的不同之处：血流态评分(寒证无明显变化,热证明显降低)、纤维蛋白原含量(寒证无明显变化,热证明显增高)、小动脉管径(寒证明显扩张,热证无明显变化)和器官损伤的范围(寒证有明显肺损伤,热证无明显肺损伤)等方面。第二部分：桃仁对寒凝血瘀证和瘀热互结证血液循环障碍的药效研究目的：研究桃仁对寒证和热证大鼠血液循环障碍的药效特点。方法：将实验大鼠分为两批,第一批随机分为4组,每组10只：寒证正常组、寒证模型组、寒证桃仁治疗组、寒证川芎对照组；第二批大鼠随机分为4组,每组10只：热证正常组、热证模型组、热证桃仁治疗组、热证丹参对照组。第一批大鼠按照第一部分方法建立寒证模型；同时寒证桃仁治疗组、寒证川芎对照组每天灌胃给予相应药液,连续7天。第二批大鼠按照第一部分方法建立热证模型；同时热证桃仁治疗组、热证丹参对照组每天灌胃给予相应药液,连续7天。第8天各组动物观察指标：(1)微循环检测仪观察耳廓血流速(Fve)、血流态(Fsc)变化；(2)血流变仪检测血粘度(Vis)、血纤维蛋白原含量(Fib)变化；(3)组织病理学及病理图像分析法,观察各器官小动脉管径(Adia)、肾血管球充盈面积(Gare)、血栓形成率(Trat)、器官实质损伤严重程度评分(Isco)等指标的变化。结果：桃仁治疗后,两证治疗组血液循环(1)血流速两证均明显增快,血流态评分两证均无明显变化；(2)血粘度两证均有明显降低,纤维蛋白原含量两证均无明显变化；(3)小动脉管径寒证明显减小,热证明显增大；肾血管球充盈面积寒证无明显变化,热证明显减小：血栓形成率两证均无明显变化；器官实质损伤评分除脾脏两证均无明显变化外,肾损伤评分两证均明显降低,心、肺、肝损伤评分寒证均明显降低,热证均无明显变化。结论：桃仁对寒凝血瘀证和瘀热互结证的血液循环障碍有改善作用,表现为使两证全身血流速加快、血粘度降低,使局部血管舒缩状态改变、使肾的损伤降低。桃仁改善两证循环障碍作用的不同之处是,使寒证小动脉收缩,使热证小动脉扩张；保护寒证心、肺、肝实质细胞,而对热证心、肺、肝实质无明显保护作用。第叁部分：桃仁改善寒凝血瘀证和瘀热互结证血液循环障碍的相关分子机制研究目的：研究寒证和热证的分子表达特点及不同之处、桃仁干预后两证相关分子表达的变化及不同之处,探讨其可能的机制。方法：利用第二部分大鼠器官标本(心、肺、肝、肾、脾),共8组(分组同第二部分),进行相关分子病理学检测(免疫组化、TUNEL细胞凋亡、原位杂交)。检测的分子包括：(1)血小板／内皮细胞粘附分子CD31、血管内皮生长因子VEGF; (2)血管内皮细胞凋亡、凋亡抑制蛋白Bcl-2、凋亡诱导蛋白P53；(3)核因子NFκB p65及mRNA、抑制物IκB-a及mRNA;(4)肝CD68阳性巨噬细胞及其蛋白Caspase-1 p20; (5)血管周细胞a-SM-actin、血管平滑肌细胞AT1、ADRB2表达情况。结果：两模型的分子表达：(1)血管内皮细胞：CD31表达寒证无明显变化,热证明显增高；VEGF表达两证均无明显变化；细胞凋亡两证均明显增多；Bcl-2表达寒证不变而热证减弱；P53(突变型)表达寒证减弱而热证不变；NFκB蛋白表达寒证减弱且无核内活性,但其mRNA表达增强,而热证有核活性增强,但其mRNA表达不变；IKB蛋白表达寒证不变且无核活性,但其mRNA表达增强,而热证有核活性,但其mRNA表达不变；(2)肝巨噬细胞数量寒证明显减少,热证不变；Caspase-1 p20表达两证均无明显变化；(3)血管壁a-SM-actin、AT1表达均不变,ADRB2表达两证均减弱。桃仁干预后分子表达的变化：(1)血管内皮细胞：CD31表达寒证明显增强,热证不变；VEGF表达寒证不变,热证明显减弱；细胞凋亡两证均不变；Bcl-2表达寒证不变,热证明显增强；P53(突变型)表达两证均无明显变化；NFκB蛋白寒证出现明显核内活性,但其蛋白及mRNA表达不变,而热证核活性不变,其蛋白及mRNA表达均增强；IKB蛋白表达寒证减弱且无核活性,其mRNA表达不变,而热证其核活性减弱,但其蛋白及mRNA表达均不变；(2)肝巨噬细胞数量寒证明显增多,而热证不变；Caspase-1 p20表达强度两证均无明显变化；(3)血管壁a-SM-actin、ADRB2表达均无明显变化,AT1表达寒证明显增强,热证表达不变。结论：(1)与寒证血液循环障碍关系密切的分子有P53(突变型)、NFκB、IκB、ADRB2,且P53诱导的内皮细胞凋亡增多、巨噬细胞活性降低导致的修复能力下降可促进寒证发生发展；而反复的低温-复温条件所致的血管内皮、平滑肌严重损伤,可能是其NFκB、ADRB2功能降低的原因之一。(2)与热证血液循环障碍关系密切的分子有CD31、Bcl-2、NFκB、IκB、ADRB2,且CD31介导的血管内皮粘附性增高、Bcl-2抑制所致的内皮细胞凋亡增多、NFκB活性增强所致的各种炎症因子产生和释放,可能是热证发生发展的重要因素。(3)寒证中受桃仁影响的分子有：CD31、NFκB、IκB、AT1,其中CD31、NFκB活性增强可能不利于血液循环障碍的恢复,而AT1介导的血管强烈的收缩反应、巨噬细胞活性增强,可能是桃仁改善寒证血管麻痹、促进血流及损伤修复的重要因素。(4)热证中受桃仁影响的分子有：VEGF、Bcl-2、NFκB、IκB,其中VEGF减弱、Bcl-2增强可能是其维持细胞凋亡不变的重要原因；NFκB活性不变但转录增强,则可能与IκB活性降低关系密切,且可能不利于血液循环障碍的恢复。桃仁改善热证血液循环的因素尚待深入研究。
参考文献：
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