胡小兵[1]2002年在《血液中细菌灭活方法的筛选及评价》文中研究表明本课题以大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌为指示菌，对短波紫外线(UVC)法、活性炭碘消毒法、亚甲蓝(methylene blue MB)光敏法和8-甲氧补骨脂素(8-MOP)光敏法四种常见的消毒方法进行筛选。在确定最佳选用方法后，通过正交试验、单因素及双因素作用灭活细菌效果测定，筛选该方法灭活血液中细菌的最佳条件及影响因素，观察其灭活效果及动力学规律。并通过自动生化检测、SDS-PAGE电泳、交叉免疫电泳、酶联免疫吸附法(ELISA)、多聚赖氨酸粘附试验、ATP酶促反应和白细胞吞噬实验等方法，测定该方法处理后血液的主要成份和功能变化。 试验结果如下： 1．在筛选试验的最大作用剂量下，活性炭碘(3g／10ml)、8-MOP(300μg／ml)+UVA(3000μW／cm~2)、UVC(3000μW／cm~2)、MB(5μmol／l)+卤钨灯(30000Lux)作用40min，可以使血液中的大肠杆菌分别下降0.800log、1.920log、2.772log、2.552log，同时血浆游离Hb分别增加679.16mg／l、16.06mg／l、107.70mg／l、1.68mg／l；PT分别延长6.40s、4.60s、5.10s、0.80s。按照既能有效灭活血液中的细菌，又能保持血液的成份和功能没有明显变化的原则，初步筛选的消毒方法是MB光敏效应法。 2．正交实验显示，MB光敏效应对血液中细菌的灭活作用受MB含量、卤钨灯照射强度和照射时间等因素的影响。试验筛选的最佳处理条件(15μmol／LMB，40000Lux卤钨灯照射强度，40min作用时间，0.35mmol／l芸香苷)可以使大肠杆菌下降近5个对数级。MB与卤钨灯照射两因素的T／E值大于1，具有协同增效作用。 3．在最佳消毒条件处理下，MB光敏效应对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的灭活指数分别为5.20、2.21、0.83和1.08；当血液按1／4稀释后，可使血液中的绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的浓度分别下降4．05、2．09和3．04个对数级。 4．通过全自动生化分析、SDS．PAGE电泳、交叉免疫电泳、酶联兔疫吸附试验等技术分析，消毒血液的血浆中主要蛋白质的含量、分子量、抗原活性、抗体活性及凝血因子的活性无显着变化，基本维持在正常值范围。 5．多聚赖氨酸粘附试验、Ah酶促反应结果显示，在 10～40minMB光敏效应作用下，膜表面负电荷下降Tll．23％～25．49％，膜 Na＝K＋ATP酶在处理的20～30ndn时增加了7．60％～20刀7％，10Inin和40Inin时与处理前没有明显变化。 6．中性粒细胞吞噬功能测定结果显示，MB光敏作用 10～20 min时，中性粒细胞的 NPT吞噬显色反应呈增高趋势，20 min时阳性率增加 9．00％。继续照射，阳性率又逐渐降低，并与正常组相似。
许伟[2]2009年在《核黄素光化学法灭活单采血小板悬液中病原体的实验研究及其对血小板活性影响的探讨》文中提出目的(1)建立核黄素光化学法灭活病毒试验方法,探讨核黄素工作浓度与紫外线辐照剂量对灭活效果的影响。(2)探讨聚合酶链式反应(PCR)用于评价病毒灭活效果的可行性,探索病毒灭活评价的新方法。(3)观察PCR和细胞感染实验在评价核黄素光化学法对血小板中病毒灭活效果的一致性。方法:(1)以人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV AD169株)作为模型病毒,将病毒悬液和血小板按1:9比例混和,再分别加入终浓度为0,50,100,150及200μmol/L核黄素溶液,此时混和在血小板混悬液中HCMV的滴度为7.25±0.15logTCID50。含不同浓度核黄素的血小板病毒混悬液分别以辐照剂量为0,600,900,1200,1500及1800 mJ/cm2紫外光照射,按终点稀释法,在人胚成纤维细胞(HF)细胞长成单层的96孔细胞培养板上进行细胞对照、病毒对照、单纯核黄素对照、单纯紫外线对照及处理后样本病毒滴度的滴定,即以病毒细胞感染试验评价灭活效果,观察核黄素浓度以及紫外线辐照剂量对灭活效果的影响,根据正交试验原则选择最佳灭活条件。(2)根据HCMV的UL83保守区域设计2条引物,预期扩增病毒核酸长度分别是547bp和1505bp,提取核黄素光化学法灭活处理后血小板中的病毒核酸,以此作为PCR扩增的模板,进行非特异损伤后不同长度核酸片段(1505bp、547bp)的PCR扩增,同时与病毒细胞感染试验相比较,探讨核酸扩增技术对该灭活方法评价的可行性,以及病毒核酸扩增片段长度与病毒细胞感染性之间的关系。结果:(1)按照正交试验原则选择的最佳灭活条件为:工作浓度为150μmol/L的核黄素结合辐照剂量为1500mJ/cm2紫外光照射即可将滴度为7.25±0.15logTCID50的HCMV灭活至<0.50 log TCID50。(2)当核黄素工作浓度为150μmol/L、紫外线辐照剂量<1500mJ/cm2时,2条不同长度的HCMV核酸片段(547bp和1505bp)均能被扩增出来,而平行的细胞感染实验证明,处理后的HCMV仍具有感染性。当核黄素工作浓度为150μmol/L、紫外线辐照剂量≥1500mJ/cm2时,547bp片段在各处理组中扩增仍为阳性,但1505bp片段扩增为阴性,平行的细胞感染实验证明了所试病毒被完全灭活。(3)核黄素光化学法灭活病毒后,1505bp的核酸扩增结果与平行的细胞感染试验结果一致,说明用核酸扩增检测技术也可以评价核黄素光化学法灭活病毒的效果。结论(1)影响核黄素光化学法灭活病原体效果的主要因素为核黄素工作浓度及紫外线辐照剂量;(2)核黄素结合紫外光才可以有效灭活血小板中病毒;(3)PCR和病毒细胞感染试验一样能够反映某些灭活病毒方法的效果,它将有助于解决无细胞感染模型病毒灭活效果评价等问题,也可做为现有病毒灭活评价方法的补充,使其评价结果更加可靠。目的(1)建立核黄素光化学法灭活细菌试验方法,探讨核黄素工作浓度与紫外线辐照剂量对灭活效果的影响。(2)研究核黄素光化学法处理对血小板生理和生化学指标的影响。方法(1)以大肠埃希菌作为革兰氏阴性菌的模型菌,表皮葡萄球菌作为革兰氏阳性菌的模型菌,将浓度为8.0logCFU/ml大肠埃希菌及表皮葡萄球菌菌液按1:100的比例分别加入血小板中,再加入终浓度为0,50,100,150及200μmol/L核黄素溶液至各份含菌的血小板,含不同浓度核黄素的菌悬液分别以强度为0,600,900,1200,1500及1800 mJ/cm2紫外光照射,以菌落计数计算处理后血小板含菌量,以正交试验原则选择最佳灭活条件。(2)以最佳灭活条件,分别处理含高浓度(6logCFU/ml)和低浓度(2logCFU/ml)模型菌的血小板,高浓度试验组处理后进行菌落计数,低浓度试验组处理后在血小板振荡仪放置5d后,用Bact/ALERT 3D系统进行监控,观察该方法灭活高、低细菌浓度的能力。(3)检测以最佳灭活条件处理后的含病毒/细菌的血小板及未处理血小板对照组的生理和生化学指标,观察处理前后的指标变化及各处理因素对上述试验结果的影响。结果(1)经工作浓度为150μmol/L核黄素结合紫外光1500 mJ/cm2处理后可对大肠埃希菌和表皮葡萄球菌达到有效灭活。(2)高浓度试验组处理后可将金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌灭活效率分别达99.9993%和100%。低浓度细菌灭活实验组,处理后放置血小板在振荡仪保存5d,然后用BacT/ALERT 3D微生物监测系统继续监控5d均为阴性。(3)经核黄素光化学法处理后的血小板生理和生化学指标略有改变,但和阴性对照比较P>0.05。结论(1)影响核黄素光化学法灭活细菌效果的主要因素为核黄素工作浓度及紫外光辐照剂量,核黄素光化学法可以有效灭活血小板中细菌,Bact/ALERT 3D系统可以评价细菌灭活效果。(2)以最佳实验条件处理后,血小板的生理和生化指标活性有所下降,但均在不影响输注效果的可接受范围内。
高明明[3]2014年在《不同血清型S.suis免疫保护效果评价以及反应原性蛋白的筛选》文中认为猪链球菌(Streptococcus suis，S. suis)是一种革兰氏阳性、兼性厌氧性球菌，根据荚膜多糖抗原特性的不同，可分为35个血清型，即1-34型和1/2型。其中2型流行最广，致病力也最强，但在近几年的流行病学调查中发现，7型和9型S. suis也是经常分离到的血清型。目前，全菌疫苗是研究的热点，但只能对同源菌或相同血清型提供保护，对于其他血清型的S. suis免疫保护效果不佳，针对一些毒力因子而研制的亚单位疫苗也已经制作出来，但由于其缺乏一定的免疫原性，而导致免疫效果不好。因此，为了更好的预防和控制S. suis病，提供有更好的保护效果的疫苗候选分子，我们选用3株S. suis分离株即2型S. suis GD、7型S. suis WH和9型S. suis ZD分别进行全菌灭活，灭活后以3×108CFU的剂量3次免疫小鼠，叁免后一周使用同源菌分别进行细菌攻毒试验，通过对抗体水平检测、血液、组织内细菌载量检测、病理变化观察以及存活率统计等指标，筛选出一株免疫保护效果好的菌株来进行下一步试验，即反应原性蛋白的筛选。动物实验结果显示，3株S. suis分离株在免疫小鼠后，均能刺激机体产生较高水平的抗体，而对照组小鼠没有抗体产生；经免疫的小鼠进行同源菌攻毒后，GD、WH、ZD组存活率分别为62.5%、87.5%和75%；血液、组织内细菌载量检测结果显示，免疫组小鼠血液、组织内的细菌载量均显着少于对照组，且WH免疫组小鼠血液内的细菌载量最低；病理变化观察结果显示，免疫组小鼠均未见明显病变，而对照组小鼠则呈现出典型的脑膜炎、心内膜炎等现象，病变严重。总结以上结果，7型S. suis WH灭活后全菌免疫小鼠，免疫效果最好，保护率最高，因此选用该菌株应用双向电泳结合蛋白质免疫杂交技术，对其进行反应原性蛋白的筛选。本实验应用免疫蛋白质组学技术建立了7型S. suis WH全菌蛋白的双向电泳体系，获得了分辨率及重复性良好的双向电泳（2-DE）图谱。并结合Western blot方法筛选到3个具有反应原性的蛋白质点，后经质谱鉴定其归属于1个蛋白，即乳酸脱氢酶（LDH）。生物信息学预测该蛋白分子质量为35420u，理论等电点为5.05，具有2个跨膜区，分别位于10-28位和110-129位。并根据预测分析成功模拟了蛋白质叁维结构。对其进行原核表达后，在目的蛋白大小处有明显条带，并结合Western blot方法验证其反应原性，结果显示LDH反应原性良好，有望作为预防S. suis病的有效疫苗候选分子。
靳志敏[4]2015年在《高效降胆固醇乳酸菌生物学特性、作用机制的研究及其在发酵香肠中的应用》文中提出从内蒙古不同地区采样得到的传统肉肠中对乳酸菌进行分离,并按肉品发酵剂筛选标准进行筛选,从而得到性能较优良适宜做发酵剂的8株乳酸菌,对其进行鉴定及胆固醇降解性能的体外筛选,筛选出胆固醇降解性能优良的菌株进行安全性评价并研究其对高脂小鼠胆固醇降解作用的影响；将菌株应用于羊肉发酵香肠中,研究其对发酵香肠品质及香肠中胆固醇含量的影响。结果表明：筛选得到的8株乳酸菌中植物乳杆菌X3-2B发酵性能及胆固醇降解性能优良。在模拟香肠环境的培养基中,其产酸能力与胆固醇降解性能较好。菌株接种量为2%、盐及葡萄糖的添加量都为2%、发酵pH为5及5.5时、在30℃条件下,植物乳杆菌X3-2B的降胆固醇性能最佳。植物乳杆菌X3-2B在培养24h和48h时总有机酸含量显着增高,且乳酸,抗坏血酸及苹果酸含量显着高于其它有机酸,草酸含量最低。植物乳杆菌X3-2B在发酵12h时其胆盐水解酶表达量最高。菌株细胞膜透性强于标准菌,更易通过胆固醇渗入细胞膜来降解胆固醇。对小鼠灌喂高、中、低剂量植物乳杆菌X3-2B研究菌株安全性,表明植物乳杆菌X3-2B属于无毒级别,肝细胞及肾脏无明显病变且无细菌移位现象。小鼠十二指肠肠绒毛长度长于结肠,显着长于盲肠(p<0.05),灌喂乳酸菌小鼠十二指肠,盲肠肠绒毛长度都高于对照组。结肠肠壁厚于盲肠厚于十二指肠,灌喂乳酸菌的试验组小鼠十二指肠与结肠肠壁厚小于对照组。对高脂小鼠灌喂植物乳杆菌X3-2B,以未食用高脂饲料小鼠为阴性对照组,只食用高脂饲料不做任何处理的小鼠为阳性对照组,发现植物乳杆菌X3-2B对小鼠血清及粪便中有机酸含量及胆固醇、甘油叁酯及胆汁酸含量都有影响,饲喂高脂饲料会增加小鼠血清中总胆固醇、甘油叁酯及胆汁酸含量及粪便中胆固醇、甘油叁酯及胆汁酸的排出量,灌喂植物乳杆菌X3-2B后小鼠血清中胆固醇,甘油叁酯及胆汁酸含量低于高脂组小鼠。高脂组与生理盐水组小鼠肝脏多数肝细胞轻度脂肪变性,极少部分肝细胞中度脂肪变性。而活菌组与灭活菌组小鼠肝细胞脂肪变性不明显,多数无明显病变；且植物乳杆菌X3-2B能减少高脂小鼠肝脏中胆固醇,甘油叁酯的含量。结肠中胆汁酸含量高于回肠,高脂组小鼠结肠中胆汁酸含量最高,且高于活菌组与灭活菌组,高于对照组。血清脂质水平与肝脏脂质指标有一定的相关性。以植物乳杆菌X3-2B(LP组),标准菌植物乳杆菌(CLP组)制作发酵香肠,并以自然发酵组为对照组。植物乳杆菌X3-2B为发酵剂制作的羊肉干发酵香肠的乳酸菌数及细菌总数显着增加,且加速了发酵香肠pH值及Aw的下降(P<0.05),亚硝酸盐及TVB-N含量显着低于对照组(P<0.05)；质构相关指标及色泽优于对照组。LP组及CLP组香肠中游离脂肪酸含量高于对照组,在加工及贮藏过程中胆固醇含量呈下降趋势,而对照组无显着变化。植物乳杆菌X3-2B的添加使得发酵香肠胆盐水解酶相对表达量高于标准菌组高于对照组。试管中BSH表达量与香肠中胆固醇含量在0.01水平下正相关,香肠中乳酸菌数与BSH在试管中的表达量在0.01水平上呈负相关,与香肠胆固醇含量在0.05水平上呈负相负相关。
周伟业[5]2014年在《核黄素光化学灭活血液中细菌的方法学及其机理研究》文中进行了进一步梳理背景输血医学的快速发展是现代医学发展的重要保障,但输血在发挥临床特殊疗效的同时也伴有一定的遭遇输血不良反应或并发症的风险。输血风险主要涵盖免疫性风险与病原体感染风险两大类。病毒、寄生虫和细菌等病原微生物可通过输血途径感染人体,构成感染性输血风险。近年来由于血液病毒标记物检测技术及病毒灭活技术的发展,病毒性输血风险的发生率已大幅度降低,其中输血HBV、HIV、HBV感染的风险均已低于1/106。随着输血传播病毒风险的不断降低,血液的细菌污染所引发的输血不良后果越来越引起关注。即使在发达国家,22℃震荡保存血小板的细菌污染率长期徘徊在1：2000-1：3000,在某些国家和地区血小板细菌污染率更是达到1%以上,且其中多数具有多重耐药性。血液制品中细菌污染初始量通常为10-100个/每袋,现有的检测手段难以达到如此低的检测限,且现有的检测方法耗时较长、对技术和设施的要求高,不具有普遍应用的可能性。为从根本上杜绝血小板细菌污染的风险,人们寄希望于借助核黄素光化学病原体灭活方法对血小板制品进行细菌灭活。核黄素(Riboflavin,RF或RB)本身为一种人体维生素(维生素B2),其光照后的产物光黄素也为正常的人体代谢产物,是目前所知最为安全的的光化学物质,但用此方法灭活血小板制品中的细菌尚有诸多方法学和机理方面问题有待解决。本实验室前期研究表明核黄素光化学法可以有效灭活血浆中的病毒及淋巴细胞。因此,本研究目的在于研究核黄素光化学法用于血液细菌病原体灭活的适宜方法及其可行性,建立一种适合我国国情的大批量血小板细菌灭活技术,为我国输血安全进一步提供保障。目的探讨并确定批量进行核黄素光化学血小板细菌灭活的最适技术参数,研究不同光化学淬灭剂对核黄素光化学反应的影响及其对血小板的保护作用,为最终建立高效的核黄素血小板病原体灭活技术提供实验研究铺垫和理论依据。方法1.采用300-550nm段不同波长紫外光和可见光作为激发光,照射含不同浓度核黄素,添加了定量大肠杆菌的血浆,处理后涂板培养1d后计数并计算细菌下降滴度,确定合适的激发光波长。2.添加I型猝灭剂(自由基猝灭剂)甘露醇、维生素C,Ⅱ型猝灭剂(活性氧簇ROS猝灭剂)组氨酸、色氨酸,同样进过光照处理后考察细菌下降滴度从而确定光敏反应类型并筛选出合适的猝灭剂。3.通过减少内滤效应以确定最佳的灭活器材。4.光照处理血小板并添加Ⅱ型猝灭剂(活性氧簇ROS猝灭剂)色氨酸、谷胱甘肽、N乙酰半胱胺酸、硫辛酸,保存血小板至3d或者5d,考察选用的猝灭剂对核黄素光化学处理后血小板保存效果是否影响。结果1.313nm与420nm激发光可以有效的灭活血浆中的大肠杆菌21og/ml以上。2.313nm作为激发光、细胞培养板为灭活器材时,维生素C有明显的助灭活效果,其他猝灭剂均未对核黄素细菌灭活效果产生影响。在血袋中所有猝灭剂均未对灭活效果产生影响。3.拉薄PVC血袋、降低液层厚度等措施可以明显提高对大肠杆菌和表皮葡萄球菌的灭活效果,下降滴度约为31og/ml。4.维生素C与硫辛酸不利于血小板保存,还原型谷胱甘肽可以有维持血小板保存至5d。结论1.本实验系统研究了核黄素光化学血小板细菌灭活的最适核黄素添加剂量、最适照射光源和强度以及透光材料等参数,具体条件为：核黄素添加终浓度50μM,激发光波长313nm,照射剂量5J/ml,照射时间30min,照射温度22-27℃,照射器材PVC血袋厚度d=0.26mm,振动频率60r/min。与国外同类设备每次只能处理2人份血小板相比,本实验所确定的参数可以有效的灭活血浆中的大肠杆菌与表皮葡萄球菌约3log/ml,并具有大规模处理多人份血小板的潜力,为最终建立规模化核黄素光化学血液病原体灭活方法提供了实验基础和理论依据。2.在核黄素光化学灭活细菌的机理方面,1)首次证明添加猝灭剂对核黄素光化学灭活病原体的效果无负面影响。2)发现含巯基的Ⅱ型猝灭剂谷胱甘肽(GSH)可以有效保护经核黄素光化学法处理的血小板保存效果,这一发现系国际首次报道。3)发现氧含量较高的环境不利于核黄素光化学法对血浆中细菌的灭活,基于此可知核黄素灭活血液中的细菌依赖于非氧途径的I型反应。4)明确核黄素发生的内滤效应是影响灭活效果的重要因素。
包银莉[6]2015年在《肠道外致病性大肠杆菌免疫保护性抗原的筛选及其脂多糖抗溶菌酶的机制》文中研究说明大肠埃希菌俗称大肠杆菌,是一类在自然界中广泛分布的革兰阴性菌。根据其致病性及致病机理的不同,大肠杆菌被划分为共生型大肠杆菌(Commensal Escherichia coli)、肠道致病性大肠杆菌(Intestinal pathogenic Escherichia coli,IPEC)以及肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli,ExPEC)。肠道外致病性大肠杆菌是一类机会致病菌,长期地无症状地定殖于宿主肠道中。当宿主环境适宜时,能引起宿主的肠道外感染。ExPEC主要包括禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)、致新生儿脑膜炎大肠杆菌(Neonatal meningitis-associated Escherichia coli,NMEC)以及尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli,UPEC)。APEC可引起多种家禽的急性或慢性感染,导致全身、多组织器官的病变。人源ExPEC可以导致新生儿脑膜炎以及尿道感染。ExPEC潜在的人畜共患性严重威胁人类和动物的健康,加强对ExPEC防控的研究,对养禽业和公共卫生均具有重要的意义。在ExPEC的防控中目前存在着两个难题。首先,依赖于抗生素的防控造成了大肠杆菌耐药菌株的涌现以及抗生素残留问题,需要新的替代方法。大肠杆菌血清型众多,疫苗间交叉保护力弱,限制了疫苗免疫防控手段的开展。其次,ExPEC的致病机理不清楚。与IPEC相比,在致病过程中,ExPEC面临的环境更加复杂,需要躲避更多的宿主天然免疫系统的杀伤机制。目前虽然在ExPEC中鉴定出大量的毒力相关因子,但是这些毒力因子在致病过程中的作用仍然不是十分清楚。而关于ExPEC抵抗宿主天然免疫系统的机制更是知之甚少。本研究一方面试图通过蛋白质组学方法筛选ExPEC保护性抗原,并对其作为亚单位疫苗的可能性进行评估,另一方面通过转座子突变文库以及基因缺失技术,研究ExPEC躲避宿主天然免疫系统中溶菌酶杀伤作用的机制。1.APEC临床分离株的毒力评估根据菌株分离的时间和地点,从2007年～2011年在南京周边地区等地分离的467株鸭源APEC临床分离株中,挑取32株菌株作为代表菌株。通过新生SD大鼠细菌性脑膜炎模型,对这些菌株的毒力以及跨血脑屏障的能力进行了检测。并且利用PCR方法,从种系发育群和毒力因子分布两方面对受测菌株的分子特性进行分析。结果显示:各APEC菌株对新生SD大鼠的致死率从0%～100%不等,菌株间毒力差异较大。其中,有26株菌株能够从新生SD大鼠的脑脊液中重新分离获得,说明这些菌株具有穿透血脑屏障的能力。种系发育群分析发现,所有8株B2群菌株均能跨过血脑屏障,且其中4株菌株对新生大鼠的致死率接近100%,提示B2群菌株毒力更强,更易导致脑膜炎的发生。在毒力因子分布试验中,仅hlyA未在受测菌株中扩增出目的条带,其他基因均有分布。Cnf1/2的检出率最低,在1株不具有穿透血脑屏障的APEC菌株中检出。GimB和neuC是NMEC重要的毒力因子,检出率分别为9.375%和12.5%,分布于具有穿透血脑屏障的APEC菌株中,提示它们可能在APEC跨血脑屏障的过程中也发挥重要的作用。在检测的16个毒力相关因子中,14个基因分布于菌株DE205B。该菌株将作为研究APEC免疫保护性抗原的研究对象。2.APEC免疫保护性抗原的筛选及免疫效果的评价大肠杆菌血清型众多,疫苗的交叉保护力差,成为大肠杆菌疫苗研发的一个难题。为了寻找具有交叉保护力的亚单位疫苗,免疫蛋白质组学以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)被运用于APEC的免疫保护性抗原的筛选。提取APEC菌株DE205B(02:K1)的全菌蛋白,经二维电泳分离后,与鸭抗DE205B高免血清反应。结果鉴定出14个具有免疫反应性的蛋白点,分别代表11个不同的蛋白,包括外膜蛋白A(OmpA)和鞭毛蛋白(FliC)两个已知的免疫原。分子伴侣家族成员GroEL和另外8个蛋白是首次在APEC中发现的具有免疫反应性的蛋白。通过体外表达系统,成功表达了9个基因的重组蛋白。Western blotting结果显示,7个重组蛋白能够与鸭抗DE205B高免血清反应,其中重组蛋白GroEL、OmpA和FliC显示出较强的免疫反应性。攻毒保护实验结果显示,与已知的免疫原性蛋白OmpA和FliC一样,重组蛋白GroEL能够刺激动物机体产生高水平抗体,有一定的交叉免疫保护力。因此,GroEL可能是一种理想的免疫原,可作为APEC亚单位疫苗的候选对象。3.NMEC抗溶菌酶相关基因的筛选及缺失株的构建致新生儿脑膜炎大肠杆菌属于肠道外致病性大肠杆菌,是导致新生儿细菌性脑膜炎最主要的革兰阴性致病菌。在致病过程中,NMEC需要躲避宿主的先天免疫系统,在宿主的血液中存活并且增殖。溶菌酶是先天免疫系统中重要的防御物质之一,广泛的分布于宿主各组织细胞中,发挥着抵抗病原微生物入侵和清除入侵病原菌的作用。近年来虽然多种大肠杆菌溶菌酶抑制因子被发现,但是大肠杆菌逃避溶菌酶介导的杀伤作用的机制仍然不是十分清楚。因此,本试验利用PUT mini-Tn5 Km质粒,构建了一个含有15000个转座子突变株的突变文库用以筛选抗溶菌酶菌株NMEC38中与溶菌酶抗性相关的基因。结果鉴别出25个突变株,分别代表20个基因。其中,14个基因编码多种生物合成相关的酶,包括多糖的合成;1个基因编码DctM家族转运蛋白;1个基因编码PTS依赖的二羟基丙酮激酶操纵子调节蛋白;其余4个基因编码多个假定蛋白,具体功能未知。在这些转座子突变株中,菌株F172对溶菌酶敏感性最高。对转座子插入位点分析发现,包括F172在内的9个菌株(代表6个基因)的插入位点均位于galF至gnd基因簇之间。利用λred同源重组方法构建了galF至gnd基因簇内溶菌酶抗性相关基因的缺失株并进行了特性分析,结果显示与野生株相比,缺失株对溶菌酶的抗性均显着下降,且外膜的通透性也有不同程度的增加。4.NMEC脂多糖抑制溶菌酶活性的鉴定及分析脂多糖是革兰阴性菌所特有的细胞壁成份,具有广泛的生物学功能。在前期试验筛选获得的20个与溶菌酶抗性相关的基因中,6个基因位于galF至gnd基因簇。在大肠杆菌中,该基因簇常常与脂多糖O抗原的生物合成有关。为了研究这些基因在病原菌抗溶菌酶过程中的作用,提取了野生株NMEC38、缺失株和互补株的脂多糖。SDS-PAGE结果显示,野生株NMEC38的LPS图谱呈现多条条带,以梯级状排列;而缺失株LPS图谱中仅在靠近胶底处出现1～3条条带,说明缺失株的LPS结构发生了改变。Western blotting结果证实缺失株LPS缺失了O特异性侧链多糖部分。溶菌酶抑制试验和凝胶过滤层析试验证实NMEC38 LPS能够结合溶菌酶,抑制溶菌酶活性,协助病原菌抵抗溶菌酶的杀伤作用。利用酸水解法,进一步将野生株LPS裂解为O特异性侧链多糖和脂质A两部分。结合试验证实不论是侧链多糖还是脂质A均能与溶菌酶结合。但是,溶菌酶水解酶活性抑制试验显示只有O特异性侧链多糖能够抑制溶菌酶水解酶活性,提示脂多糖对溶菌酶的抑制作用是通过0特异性侧链多糖发挥作用。
杨立军[7]2016年在《禽致病性大肠杆菌aroA和luxS双缺失株的构建及其菌蜕疫苗的制备》文中提出禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(AWian Pathogenic Escherichia coli, APEC)弓起的禽类急性、慢性传染病的总称,以气囊炎、肝周炎和心包炎为主要特征,是养禽业常见的传染病。目前该病的防控主要通过抗生素治疗及疫苗免疫,但抗生素滥用导致的耐药和药残问题,严重威胁养禽业的健康发展和公共卫生安全；而传统疫苗,由于禽大肠杆菌的血清型较多,不能对该病提供有效防控,亟需开展新型疫苗的研制。菌蜕(Bacterial ghost, BGs)是通过调控噬菌体裂解基因E在革兰氏阴性菌中表达而形成无细胞质及细胞器的细菌空壳,是一种关于疫苗、药物及呈递系统的新技术。与传统疫苗相比,菌蜕疫苗具有制备简单、使用安全、运输方便等优点。本研究通过构建禽致病性大肠杆菌DE17(O2血清型)aroA及aroA luxS双缺失疫苗株,并开展菌蜕疫苗的研制及免疫效果评价,以期为禽大肠杆菌病的防控提供参考。1)禽致病性大肠杆菌流行病学调查2015年,自江苏、安徽、福建等省部分养殖场分离、鉴定139株大肠杆菌,其中从病禽中分离到20株APE Co血清型检测结果表明,O1血清型(11株)、O2血清型(14株)和078血清型(14株)占分离菌株总数的28%,APEC总数的50%。表明O1、 O2、 O78血清型仍然为APEC的优势血清型。参照美国临床和实验室标准化研究所(CLSI)制定的抗菌药物敏感性试验执行标准,选取14种抗菌药对分离菌株进行耐药性检测,结果表明,99%以上分离菌株对红霉素、克林霉素和利福平耐受。此外,86%的分离菌株对10种以上抗生素耐受,57.3%的菌株对13种药物都耐受。对分离菌株的毒力基因检测结果表明：iucD (82%), tsh (58.6%), iss (55%)和irp2(44.6%)有较高的分布率,而cva/CVI(19.3%), attA (14.3%), papc (4.3%)和vaf (6.7%)毒力基因分布率均低于20%。表明iss、 tsh、iucD和irp2为APEC的保守基因,推测其可能在APEC致病过程中发挥重要作用。2) DE17△aroA和DE17△aroA △luxS的构建及生物学特性研究本研究通过同源重组技术,构建了DE17 aroA缺失株(DE17△aroA)和DE17 aroA luxS双缺失株(DE17△aroA △luxS),并对其生物学特性进行研究。以7日龄樱桃谷鸭作为实验动物进行LD5o测定,结果表明DE17的LD5o为1×104CFU, DE17△aroA 的 LD50为3.8x105CFU, DE17 △aroA △lvxS的LD5o为1.76x106CFU,与野生株相比,缺失株毒力分别下降了38和176倍。对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的黏附、入侵结果表明,与野生株DE17相比,缺失株DE17△aroA的黏附、入侵分别下降了25.8%和29.3%p<0.05),而DE17△aroA △luxS的黏附、入侵下降了36.5%和42.5%(p<0.01)。体内分布结果显示：与野生株DE17相比,缺失株DEM △aroA和DE17△aroA △luxS在樱桃谷鸭肝脏、脾脏和血液中的载菌量下降了743、1000、1700倍和8400、11300倍。表明缺失aroA和luxS基因显着降低其致病性。此外,aroA基因缺失或者aroA luxS基因双缺失,细菌运动性下降。上述结果表明,缺失aroA口luxS基因后,APEC的毒力下降,致病性降低。3)菌蜕质粒的构建在本实验室前期构建的pUC19-△CI857-E-rrnB溶菌质粒和pUC19-CI857-E-rrnB-pl-SN溶菌质粒基础上,构建了pUC19-△CI857-E-rrnB-pl-SN溶菌质粒,实现了其可在37℃C进行菌蜕的制备,提高了菌蜕的制备效率。利用构建的质粒制备DE17菌蜕,结果表明DE17可以在37℃正常培养,灭活效果检测表明灭菌效率可达99.99%。对制备菌蜕的电镜观察结果表明,成功制备不含胞质的菌蜕。为了提高菌蜕疫苗的安全性,加强菌蜕的灭活效果,本研究通过pUC19-△CI857-E-rrnB-p1-SN溶菌质粒中的SN实现对DE17菌蜕基因组的完全降解。同时采用菌蜕冻干或添加40 μg/mL庆大霉素的方法,实现对菌蜕的100%灭活,保证了菌蜕疫苗的安全性。4)免疫保护实验为了评价菌蜕疫苗的免疫效果,本研究对7日龄樱桃谷鸭分别免疫甲醛灭活疫苗和菌蜕疫苗,2周后进行攻毒,评价各组疫苗的免疫保护率。结果表明,利用DE17,DE17△aroA和DE17△aroA △luxS制备的甲醛灭活疫苗(加佐剂),对樱桃谷鸭的免疫保护率分别为50%,70%和80%,表明DE17缺失aroA和luxS基因后具有更高的免疫原性。利用DE17和DE17△aroA △luxS菌株制备的菌蜕疫苗,在不加佐剂情况下,免疫樱桃谷鸭后,仍能提供80%的免疫保护率,而不加佐剂的甲醛灭活疫苗仅能提供30%的免疫保护,表明菌蜕疫苗不但具有较高的免疫保护性,而且具有佐剂作用。运用ELIS A检测不同免疫组樱桃谷鸭的抗体水平,结果表明,菌蜕疫苗能诱导更高水平的抗体产生。本研究构建了DE17△aorA和DE17△aroA △luxS缺失株,利用PUC19-△CI857-E-rrnB-pl-SN成功制备了高效灭活的菌蜕,在动物免疫实验上表现出比传统甲醛灭活疫苗更高的保护效率,是一种良好的候选疫苗,为运用菌蜕疫苗开展禽大肠杆菌病的防控提供新思路。
张腾霄[8]2008年在《吩噻嗪光敏剂修饰磁性微粒的制备及其在病毒灭活中的应用》文中研究说明本文研究了表面修饰有环氧乙烷基和羧基的功能化磁粒的制备,将对血液或血液制品中的HIV、HBV及HCV等病毒有很强的光诱导灭活作用的吩噻嗪类染料,如天青A和天青B,通过化学反应共价偶联到硅烷化的磁粒上的几种方法,制备了既可灭活血液或血液制品中的病毒、又可以用磁性分离方式将其彻底去除的血液净化材料。该材料应用于几种血液样品中指示病毒PRV的灭活,建立了用CPE实验结合Reed-Muench法评价其灭活病毒的效率的方法,鉴定了所合成的光敏剂修饰磁性微粒的光诱导的病毒灭活活性。材料合成部分中,首先用化学共沉淀法制备Fe_3O_4磁流体,磁流体经硅烷化修饰分别得到表面羧基化和环氧化的磁性载体。羧基化磁粒用EDC或DCC活化剂介导酰胺缩合反应将AA或AB固定;环氧化磁粒用采用金属叁氟化物催化、离子超声催化和碱催化等3种方法,催化环氧乙烷基和芳香胺的开环加成反应,从而将AA或AB固定。初步比较各种方法,发现碱催化的方法使光敏剂偶联量效果最好,然后进一步对碱催化的合成方法优化以提高偶联量。用优化的合成方法制备该材料,并检测批内和批间差异,考察了偶联量的稳定性。UV-Vis分光光度法测定AA和AB的偶联量分别达到50nmol/mg和37 nmol/mg。研究了光敏剂的吸光度与溶液酸碱度的关系,为用盐酸溶解磁粒分光光度法测定偶联量提供了指导。研究了AA和AB的碱性稳定性,得到两者氧化分解的pH上限值分别为11.5和12.0,为合成体系优化中pH值的确定提供了指导。以DPCI为单线态氧捕捉剂,用氧化-萃取光度法测定单线态氧产率,来分析磁粒的光敏剂的偶联量,鉴定了光敏剂修饰磁粒的光敏活性。选用PRV为指示病毒,从光照时间、光敏剂修饰磁粒用量等影响光化学效应的主要因素入手,优化了光化学灭活病毒的体系,并应用于血浆、血红蛋白溶液及人血液代用品(聚合猪血红蛋白)中指示病毒的光化学灭活。结果显示该磁性材料灭活效果优良,能使被试样品中病毒滴度下降达4个LgTCID_(50)以上。光敏剂修饰磁粒把磁性微粒的优良生物相容性、磁场中的易分离性与吩噻嗪光敏剂灭活病毒的高效性相结合,将很可能是用于血液净化的新型材料。
王文彬[9]2016年在《乳及乳制品中主要食源性致病菌的免疫快速检测方法研究》文中研究说明鲜乳及其生产过程中食源性致病菌的污染是乳制品安全的主要威胁之一。传统的培养方法虽然准确,但耗时较长、步骤繁多、检测效率低,食品企业和基层检验机构亟需一种准确、简便、快速、成本低的分析手段来监测原料、生产过程及最终产品中的致病微生物。本文调查了乳及乳制品中主要的食源性致病菌,以大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌5种主要肠毒素、沙门氏菌、单增李斯特菌作为研究对象,并根据不同细菌的特点筛选、制备免疫原,来筛选特异性好、交叉均一的单克隆抗体,并基于配对抗体建立了准确、简便、快速、低成本的免疫分析方法,应用于乳品中的快速检测。首先,为建立大肠杆菌O157:H7特异型的免疫分析方法,采用煮沸灭活的大肠杆菌O157:H7为免疫原免疫小鼠,经过细胞融合、筛选,制备了特异性识别大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体,通过两两配对获得了配对抗体并建立了大肠杆菌O157:H7特异型的ELISA和胶体金试纸条方法,检测限(P/N≥2.1)分别为1.1×105 CFU/m L和3×105 CFU/m L,与其它常见细菌无交叉反应。同时,用western blot研究发现配对抗体识别的抗原位点均为分子量为37 k Da的大肠杆菌O157:H7膜蛋白。第二,为建立金黄色葡萄球菌5种主要肠毒素(SEA,SEB,SEC,SED,SEE)的免疫分析方法,分别采用5种重组表达的肠毒素为免疫原制备了单克隆抗体,并通过配对和筛选获得了5种肠毒素的最优配对抗体,分别建立了相应的ELISA和胶体金试纸条方法。5种肠毒素ELISA方法的实际检测限分别为0.15、0.08、0.14、0.12、0.25μg/kg。并进一步开发了可以同时检测5种肠毒素的多重胶体金试纸条方法,应用于乳品中金葡肠毒素的检测。第叁,为建立沙门氏菌属的免疫分析方法,首先制备了鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白和脂多糖LPS的单克隆抗体,发现脂多糖单抗配对检测鼠伤寒沙门氏菌的灵敏度较好,建立的ELISA和胶体金试纸条方法的检测限分别为104 CFU/m L和1.3×105 CFU/m L,与O抗原相同的乙型副伤寒沙门有交叉反应,与其它沙门氏菌无交叉反应。同时采用NaIO4和EDC法合成了沙门氏菌脂多糖的完全抗原用于免疫小鼠,制备了沙门氏菌属特异性的LPS单抗,基于配对抗体建立了沙门氏菌属ELISA方法,对12株不同O抗原的沙门氏菌的检测限为1.3×105-1.2×106 CFU/m L。基于属特异性LPS单抗5H12和Na IO4合成的LPS包被原,开发了一种基于竞争反应的沙门氏菌属胶体金试纸条方法,可以成功检测到测试的12株沙门氏菌,最低检测限在106 CFU/m L,与其它常见细菌无交叉反应。第四,为建立单增李斯特菌特异性的免疫分析方法,首先,采用P60蛋白为免疫原制备了单克隆抗体,发现这些单抗均一识别李斯特菌属。基于配对抗体,建立了李斯特菌属的ELISA方法和胶体金试纸条方法,对测试的8株单增李斯特菌和4株李斯特菌均可检测,检测限为105-106 CFU/m L,与其它测试细菌无交叉反应。同时,合成了Pep D多肽并用SMCC法与载体蛋白BSA偶联作为免疫原,制备了单增李斯特菌特异性的单克隆抗体,发现PepD多肽单抗可与李斯特菌属单抗配对并建立单增李斯特菌P60特异性的双抗体夹心ELISA方法和胶体金试纸条方法,并成功将8株单增李斯特菌与4株李斯特菌区分出来,并与其它测试细菌无交叉反应。第五,为了对传统的金黄色葡萄球菌肠毒素B双抗体夹心ELISA方法进行增敏,在修饰4-NTP的金纳米粒子表面还原特定厚度的Ag层,合成了具有强拉曼活性的、内部包裹有4-NTP的金银核壳结构的纳米颗粒,表面修饰金葡肠毒素B抗体后,在微孔板上实现了肠毒素B拉曼检测,该方法的最低检测限为1.3 ng/kg,相比传统的双抗体夹心ELISA方法降低了25倍,可以用于牛奶中低含量金黄色葡萄球菌肠毒素B的检测。
郭东春[10]2012年在《多杀性巴氏杆菌兔体内差异表达基因及其突变株构建的研究》文中研究说明多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P. multocida）能够引起多种动物感染，导致急性、败血性传染病，包括禽霍乱、牛出血性败血症、猪肺炎和猪萎缩性鼻炎、兔出血性败血症。多杀性巴氏杆菌属于革兰氏阴性菌，巴氏杆菌科巴氏杆菌属，主要以荚膜抗原和菌体抗原区分血清型，荚膜抗原有5群，分别为A、B、D、E、F群；菌体抗原分为16个型，分别为1、2、3、4、5、、16。本菌呈世界性分布，已给养殖业造成巨大的经济损失，是重点防控的疫病之一。本研究以兔源多杀性巴氏杆菌C51-17菌株为研究对象，采用选择性捕获转录序列技术对C51-17菌株分别在感染兔肝脏组织和BHI培养基培养的条件下的差异表达基因进行筛选。结果表明：通过选择性捕获转录序列技术鉴定到31个基因，按照其编码蛋白的功能分为5大类：新陈代谢和应激蛋白，细胞表面蛋白，调节蛋白、转运蛋白和3个未知功能蛋白。利用Real-timeRT-PCR对差异表达基因进行转录水平的验证，结果表明：purF、lon、dnaB、ftsQ和glpT等5个的基因与BHI培养基中生长的C51-17菌株的基因转录水平相比，C51-17菌株在感染兔肝脏组织中5个基因的转录水平均上调，上调了1.61～13.55倍。将C51-17菌株热休克蛋白70基因（dnaK）克隆到原核表达载体pPro-EXHTb进行序列分析和原核表达，诱导表达重组DnaK蛋白，进行抗原性和免疫原性分析，测定其生物学活性。结果表明：C51-17菌株的dnaK基因与其他多杀性巴氏杆菌菌株dnaK基因在核苷酸水平的同源性均在99.2%以上，与其他种属的细菌的dnaK基因的同源性在82.3%～97.5%；成功表达了C51-17菌株重组DnaK蛋白，分子量为70kDa，与预期大小一致，以可溶性的形式存在；Western blot试验证明，重组DnaK蛋白具有良好的抗原性；纯化的DnaK蛋白分别按照50μg/只和150μg/只免疫ICR小鼠，对致死性剂量的C51-17菌株的保护性分别为1/5和2/5；重组DnaK蛋白具有粘附细胞活性，并能抑制多杀性巴氏杆菌对细胞的粘附作用；将dnaK基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1构建真核表达质粒转染细胞，检测蛋白在细胞中的定位，结果表明：DnaK蛋白主要定位于细胞的细胞质中。采用正向筛选同源重组技术构建C51-17菌株ΔdnaK突变株和ΔaroA突变株，利用PCR对突变株进行鉴定，分析其遗传稳定性、生长特性和致病性。结果表明：成功构建了多杀性巴氏杆菌ΔdnaK突变株和ΔaroA突变株，连续传代20代，它们遗传稳定；ΔdnaK突变株和ΔaroA突变株与亲本菌的体外生长曲线表明，ΔdnaK突变株和ΔaroA突变株与亲本菌C51-17的体外生长曲线基本一致。ΔdnaK突变株和ΔaroA突变株对ICR小鼠的致病实验结果表明：腹腔注射ICR小鼠，ΔdnaK突变株在剂量为1.0×10~2CFU时对小鼠有致死性，而ΔaroA突变株在剂量为1.0×10~6CFU时对小鼠无致死性；而亲本菌C51-17在剂量为1.0×10~2CFU对小鼠是完全致死性的。ΔdnaK突变株对小鼠的致病性无明显减弱，ΔaroA突变株对小鼠的致病性是减弱的。本研究采用选择性捕获转录序列技术筛选C51-17菌株在感染兔肝脏中和BHI培养的条件下的差异表达基因，利用Real-time RT-PCR对差异表达基因进行转录水平的验证。同时，采用正向筛选同源重组技术构建C51-17ΔdnaK突变株和ΔaroA突变株。多杀性巴氏杆菌正向筛选同源重组构建突变株的技术与选择捕获转录序列技术鉴定到的多杀性巴氏杆菌兔体内差异表达基因相结合，为进一步研究多杀性巴氏杆菌致病机理和减毒新型基因工程疫苗奠定基础。
参考文献：
[1]. 血液中细菌灭活方法的筛选及评价[D]. 胡小兵. 第叁军医大学. 2002
[2]. 核黄素光化学法灭活单采血小板悬液中病原体的实验研究及其对血小板活性影响的探讨[D]. 许伟. 安徽医科大学. 2009
[3]. 不同血清型S.suis免疫保护效果评价以及反应原性蛋白的筛选[D]. 高明明. 石河子大学. 2014
[4]. 高效降胆固醇乳酸菌生物学特性、作用机制的研究及其在发酵香肠中的应用[D]. 靳志敏. 内蒙古农业大学. 2015
[5]. 核黄素光化学灭活血液中细菌的方法学及其机理研究[D]. 周伟业. 华东师范大学. 2014
[6]. 肠道外致病性大肠杆菌免疫保护性抗原的筛选及其脂多糖抗溶菌酶的机制[D]. 包银莉. 南京农业大学. 2015
[7]. 禽致病性大肠杆菌aroA和luxS双缺失株的构建及其菌蜕疫苗的制备[D]. 杨立军. 扬州大学. 2016
[8]. 吩噻嗪光敏剂修饰磁性微粒的制备及其在病毒灭活中的应用[D]. 张腾霄. 西北大学. 2008
[9]. 乳及乳制品中主要食源性致病菌的免疫快速检测方法研究[D]. 王文彬. 江南大学. 2016
[10]. 多杀性巴氏杆菌兔体内差异表达基因及其突变株构建的研究[D]. 郭东春. 中国农业科学院. 2012
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