陈锋[1]2004年在《小麦Mlo基因原核表达、抗体制备及免疫金标记》文中进行了进一步梳理小麦白粉病是由小麦白粉病菌(Blumeria graminis f sp．tritici)引起的一类重要的真菌性病害，在我国尤其是北方各主要小麦产区发生非常严重。由于该病原菌生理小种多、变异快、品种抗性容易丧失，因此通过传统的方法很难有效控制它的危害。Mlo基因作为一类与植物广谱高效抗性相关的基因，在大麦中首先被发现，它的突变可以引发大麦对白粉病菌(Blumeria graminis f sp．hordei)绝大多数生理小种广谱、高效和持久的抗性。鉴于Mlo基因在植物广谱抗白粉病理论与应用方面的重要价值，我们希望通过分子细胞学的研究方法对小麦Mlo基因及其产物MLO蛋白的生物学功能进行研究，以期为将来小麦抗白粉病的分子育种工作提供理论依据。 本研究将编码小麦MLO蛋白羧基端约130个氨基酸多肽的基因片断克隆到表达载体pET-30a中，在大肠杆菌中表达了该多肽的融合蛋白。利用Ni~(2+)-NTA agarose柱纯化融合蛋白并免疫家兔制备了该蛋白的抗血清。Western blot和免疫胶体金标记分析表明所制备的抗体能与MLO蛋白特异性反应。 在获得小麦MLO蛋白抗血清的基础上，我们利用一抗缺失和一抗替换两种方法对小麦MLO蛋白在小麦叶片和白粉病菌中的定位进行研究。在标记过程中，我们首先研究了一抗标记时间对标记结果的影响，确定了一抗结合时间120分钟作为标记的标准时间。在此基础上，我们利用小麦MLO蛋白抗血清、大麦MLO蛋白MYP抗血清、Cl抗血清、纤维素抗血清、亲和素抗血清和免疫前兔血清对小麦MLO蛋白的免疫定位进行了系统研究。标记的统计结果表明：小麦MLO蛋白定位于小麦白粉病菌菌丝和分生孢子上。同时，在叶绿体中很有可能也存在MLO蛋白。
李凡, 胡东维, 陈锋, 崔晓峰[2]2005年在《小麦TaMlo基因的原核表达、抗体制备及细胞化学分析(简报)》文中认为白粉病菌(Blumeria graminis)是一类高度专化性的寄生真菌,可侵染650多种单子叶植物和 9000多种双子叶植物,能够引起多种麦类作物的白粉病,给农业生产带来巨大的损失。由于白粉病菌生理小种多、变异快,所以利用专化性抗病基因难以解决植物的持久抗病性问题。人们在研究大麦白粉病时．发现大麦Mlo基因的隐性突变可导致大麦对绝大多数白粉病菌生理小种的高效持久的广谱抗病性。Schulze-Lefert等多家实验室合作于1997年成功克隆了野生的 Mlo基因。进一步研究表明．该基因编码一种植物特有的具有7个跨膜区和羧基端长尾的膜蛋白(Mlo),它可能对植物细胞的坏死起负调控作用。但Mlo基因如何表达及其在白粉病菌发育中的作用机制尚不清楚。
冀宪领[3]2008年在《桑树黄化型萎缩病病原及其响应蛋白的蛋白质组学研究》文中进行了进一步梳理植原体病害是世界性植物病害,全球范围内均有不同程度的发生,给农林业生产造成巨大损失。桑黄化型萎缩病是桑树上的重大病害,常导致大片桑树毁灭,严重制约了蚕业生产的发展。由于植原体难以培养,对于植原体的研究进展缓慢,关于植原体诱导植物发病的分子机制知之甚少。自从植原体基因组序列测定完成后,基因组学的研究重心便从揭示植原体的所有遗传信息转移到从整体水平上对植原体的生物过程进行研究,特别是对基因组注解的验证性研究,而蛋白质组学研究便是其中的一项重要的内容。近年来对于桑树黄化型萎缩病发生分子机制的研究并没有取得实质性的进展,桑树萎缩病病原响应蛋白的研究在国内外尚未见报道。本研究通过对植原体蛋白质组学及桑树萎缩病病原响应蛋白的研究,以期为从分子水平上揭示桑树萎缩病的发生机理提供理论基础。本研究利用Shotgun策略对植原体表达的蛋白质组进行了分析。结合SDS-PAGE电泳与毛细管液相色谱-串联质谱技术,准确地鉴定了242种植原体蛋白质,其中包括参与氨基酸合成、细胞膜、中间代谢、细胞过程、能量代谢、不饱和脂肪酸和磷脂的代谢、核苷及核苷酸代谢、复制、转录、翻译、运输和结合蛋白和其它功能的相关蛋白质。除了上述已知功能的蛋白外,还鉴定了76种假定蛋白或保守的假定蛋白。所鉴定的蛋白质总量占预测的植原体蛋白质组的35%。如此大通量地对植原体蛋白质组进行鉴定国内外还未见报道,该研究不仅为植原体蛋白质组学研究提供了技术参考,同时提供了一个具有参考价值的植原体蛋白质数据库,为更好地理解植原体的生物过程的功能和机制奠定了基础。本研究结合蛋白质双向凝胶电泳和质谱技术,利用差异蛋白质组学策略研究了桑树受植原体侵染后叶片蛋白表达谱的变化。利用ImageMasterTM 2D Platinum软件分析,共检测到500多个叶片可溶性蛋白,发现有37个蛋白点差异表达,其中18个被下调,19个被上调。质谱分析共鉴定出18个蛋白点,代表了15种不同的蛋白。被鉴定的蛋白包括Rubisco大亚基、景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶、Rubisco活化酶、防御相关蛋白、蛋白酪氨酸磷酸化酶、NUDIX/mutT类水解酶家族蛋白、成熟酶K、Kunitz型蛋白酶抑制剂-1、20S蛋白酶体亚基、放氧复合体的33 kDa前体蛋白、苹果酸脱氢酶、甲硫氨酸亚砜还原酶、Gm-ck32857、F-box蛋白、未知蛋白。这些蛋白涉及到光合作用、氨基酸代谢、核苷酸代谢、信号传导及调控、防御应答、转录等多个生理过程。本研究为从分子水平上揭示桑树萎缩病的发生机理提供了理论基础。景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)是卡尔文循环过程中的关键酶。本研究利用RACE技术得到桑树景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因全长cDNA,命名为MSBPase (GenBank登录号:DQ995346)。MSBPase全长为1 527 bp,该序列含有一个1 179 bp的完整开放读码框,编码393个氨基酸,蛋白质理论分子量约为42.6 kDa,等电点为5.85,其氨基酸序列与其它植物中已分离的SBPase有很高的同源性。对MSBPase编码的蛋白质(命名为MSBPase)进行结构预测分析表明,该蛋白富含无规卷曲(Coil),高达64.29%,其次是α-螺旋(Helix),为22.19 %,而β-折迭(Strand)只有13.52 %。将MSBPase编码区插入原核表达载体pET30a (+),并转化到大肠杆菌菌株BL21中,经过IPTG诱导,MSBPase融合蛋白在BL21菌株中成功表达。将得到的MSBPase编码区插入植物表达载体pBI121中,构建了MSBPase植物表达载体pBI121-SBP。将植物表达载体pBI121-SBP,采用农杆菌介导的方法,转化拟南芥,经卡那霉素筛选获得若干再生植株。经Northern和Western杂交分析,证明MSBPase在转基因拟南芥中已成功得到表达。MSBPase在拟南芥中超表达可以提高拟南芥叶片的SBPase活性和净光合速率,叶片淀粉和可溶性糖含量增加,植物生长旺盛,干物质积累增加,开花提前。本研究为桑树基因工程提供了有效的候选基因,为深入研究SBPase的分子调控机制奠定了基础。1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活化酶(RCA)广泛存在于光合生物中,它是一种由核基因编码的叶绿体蛋白,具有调节Rubisco活性的功能。本研究根据RCA的保守区域设计一对兼并引物,通过PCR扩增,获得RCA的基因功能区的中间片段,利用RACE技术获得RCA的基因cDNA的3'端片段。对获得的基因片段所编码的氨基酸进行BLAST分析,结果表明,其与GenBank中报道的其它植物来源的RCA有较高的同源性。RCA的部分编码区插入原核表达载体pET30a(+),并转化到大肠杆菌菌株BL21中。经过IPTG诱导,RCA的部分编码区在BL21菌株中成功表达。将得到的RCA基因片段反向插入植物表达载体,构建了RCA基因反义表达载体pBI121-RCA。本研究为深入研究光合作用的机理以及阐明RCA与1,5-二磷酸核酮糖羧化酶相互作用和调控关系奠定了基础。
宋传生[4]2014年在《泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶及tRNA-异戊烯基焦磷酸转移酶基因研究》文中研究表明泡桐丛枝病是由植原体引起的一种重要的林木病害，在中国发生和分布于北至山海关，南到长江流域的广大范围内，是国内极具代表性的植原体病害，给泡桐生产造成了严重危害，具有重要的研究价值。胸苷酸激酶催化磷酰基从ATP转移到dTMP形成dTDP，是叁磷酸胸苷从头合成和补救途径的关键酶。该酶广泛存在于各种生物中，是DNA合成过程中的重要限速酶，对于生物的生存必不可缺。本文对泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶基因进行了克隆、测序、多态性分析、原核表达及纯化、体外酶活性测定、对转化大肠杆菌生长和繁殖的影响以及该基因在植原体中的表达等研究，为植原体的繁殖、致病机理研究、病害治疗的新药物设计与筛选及病害综合防治等研究奠定了基础。本研究设计引物并PCR扩增了泡桐丛枝植原体河北平山株系（PaWBPs）和江西吉安株系（PaWBJan）的tmk基因，直接和克隆测定tmk序列，利用DNAMAN、MEGA等软件进行序列多样性、序列变异、蛋白功能域、系统进化等比较分析。结果表明，从PaWBPs和PaWBJan中克隆测序的93条和41条tmk-a中，分别鉴定出52和24种不同的序列，tmk-a ORF可被划分为两类，tmk-a-1为639bp，tmk-a-2为627bp，PaWBPs株系tmk-a-1与tmk-a-2序列条数的比值约为2.5，而PaWBJan株系为3.3，PaWBPs有5个相同的tmk-a-1序列与PaWBJan的一个tmk-a-1序列及枣疯植原体tmk-Y序列完全一致。因多位点突变，PaWBPs含假基因比例达48.1%，PaWBJan的为41.7%；tmk-b基因为单一序列，两株系的tmk-b核酸序列相似性为99.8%，编码蛋白仅有一个氨基酸差异。Tmk-a和tmk-b中都具有胸苷酸激酶的3个保守功能域。系统进化分析显示，泡桐丛枝植原体的两个株系的所有tmk-a序列都与枣疯植原体tmk-X和tmk-Y等聚为一个进化枝I中；而tmk-b与小麦蓝矮tmk-2等聚为另一进化枝III，基于tmk-b序列和基于16S rDNA序列构建的系统进化树一致，tmk-b有助于植原体16Sr组水平的分类，而tmk-a可用于植原体株系变异和遗传多样性分析。对从泡桐丛枝（PaWB）植原体中获得的3个预测的同源蛋白TMK-a-1、TMK-a-2及TMK-b与已报道的小麦蓝矮（WBD）、洋葱黄化（OY-W）植原体的TMK-a、TMK-b的氨基酸序列进行了比对和相似性分析，结果显示PaWBPS TMK-b与WBD TMK-2和OY-W TMK-b之间的相似性分别为95.65%和99.03%；PaWBPS TMK-a-1与PaWBPSTMK-a-2的相似性为90.57%，且二者与WBD TMK-1和OY-W TMK-a之间的相似性为87.32%-94.26%；而PaWBPS、WBD、OY-W叁种植原体的TMK-a与TMK-b之间的相似性仅为22.22%-25.95%。构建了PaWBPS TMK-b、TMK-a-1、TMK-a-2的pET28a原核表达载体，对PaWBPS TMK-b、TMK-a-1、TMK-a-2叁种蛋白分别进行了原核表达，经Ni-NTA柱纯化后进行了酶催化活性测定，结果表明，PaWBPS TMK-b具有较高的胸苷酸激酶活性，为85.960.74U·mg-1，而PaWBPS TMK-a-1和TMK-a-2几乎没有胸苷酸激酶活性。通过生长曲线的测定，研究了在BL21（DE3）大肠杆菌细胞中表达的PaWB TMK-a-1、TMK-a-2和TMK-b蛋白对细菌生长和繁殖的影响，结果表明，PaWB TMK-a-1、TMK-a-2和TMK-b对对数生长后期大肠杆菌的繁殖都有显着的促进作用，PaWB TMK-b对大肠杆菌繁殖的促进作用最明显，PaWB TMK-a-1和TMK-a-2次之，并且PaWB TMK-a-1和TMK-a-2对细胞繁殖的促进作用的强弱无明显差异。该研究结果也表明，体外测定无胸苷酸激酶活性的PaWB TMK-a-1和TMK-a-2可能在植原体细胞内以不同于TMK-b的方式发挥着重要功能。本研究制备了PaWB tmk-a-1、tmk-b及16S rDNA（对照）基因DNA探针，用泡桐丛枝植原体RNA在42℃和68℃杂交条件下进行的Northern blot结果显示，泡桐丛枝植原体中含有大量表达的16S rRNA；但16S rDNA探针也能从健康泡桐总RNA中检测到杂交信号；然而用PaWB tmk-a-1、tmk-b探针并未检测到PaWB tmk-a-1和tmk-b基因mRNA的杂交信号，这可能是由于tmk-a-1和tmk-b基因表达的mRNA的量很低或该基因存在尚不清楚的特殊时空表达特性导致的。另外，通过对PaWB16S rDNA与拟南芥、烟草、毛果杨等植物叶绿体16S rDNA及线粒体rRNA序列比对分析后发现，PaWB16S rDNA与这些物种的叶绿体16S rDNA序列相似性值均在70%以上，据此推测，用PaWB16SrDNA探针从健康泡桐总RNA中检测到的杂交信号很可能源于和PaWB16S rDNA高度同源的泡桐叶绿体16S rDNA或线粒体rRNA。用纯化的原核表达蛋白免疫德国大白兔，分别制备了PaWB TMK-a-1和TMK-b的多克隆抗体。对泡桐丛枝植原体蛋白进行的Western blot、FITC免疫荧光显微镜及免疫电镜结果表明，表现典型丛枝症状的泡桐组培苗体内仅检测到PaWB TMK-a-1和TMK-b蛋白微弱的表达。然而，利用PaWB TMK-a-1和TMK-b抗体从健康泡桐总蛋白中也检测到了和PaWB TMK蛋白大小相似的Western blot印迹条带，用FITC免疫荧光显微镜在健康泡桐茎部皮层细胞也观测到该蛋白特异荧光。通过对PaWB TMK-a-1、PaWB TMK-b、AtTMPK全长及来源于转录组测序的泡桐TMK蛋白的部分氨基酸序列进行的比对和抗原决定簇序列分析发现，以上4种蛋白为同源蛋白，并且它们的多个抗原决定簇序列之间有高度的相似性，据此可推测，这些高度相似的抗原决定簇可能是健康泡桐总蛋白中出现交叉血清学反应的原因。利用PaWB TMK-a-1和TMK-b抗体进行的免疫电镜表明，泡桐细胞核和叶绿体上有大量的免疫胶体金颗粒，这也从亚细胞水平揭示了健康泡桐在Western blot印迹时出现条带的原因和蛋白可能的存在部位。本研究结果也为植原体与寄主植物可能存在的内共生学说提供了有力的实验证据。tRNA-IPT基因编码的蛋白tRNA-异戊烯基焦磷酸转移酶（EC2.5.1.8）,能催化二甲烯二磷酸（DMAPP）的异戊烯基转移到前体tRNA分子反密码子附近的腺嘌呤残基上。tRNA的这种修饰能够影响蛋白质翻译的保真度及效率；这种被修饰的tRNA降解产生异戊烯基腺嘌呤，可能具有细胞分裂素活性。通过测定转化有PaWB tRNA-ipt基因的大肠杆菌生长曲线，研究了PaWB tRNA-IPT蛋白对细胞生长和繁殖的影响，结果表明，PaWBtRNA-IPT对大肠杆菌的生长和繁殖具有显着的促进作用。比较转化有tRNA-IPT和tRNA-IPT（基因内部发生了碱基突变导致tRNA-IPT蛋白的编码提前终止）的大肠杆菌生长曲线后发现，在0.25至1.0mM IPTG诱导时，转化tRNA-IPT和pET28a空载体大肠杆菌的繁殖都受到IPTG的明显抑制，而转化有tRNA-IPT的大肠杆菌的繁殖几乎未受抑制。该结果表明PaWB tRNA-IPT突变体能够克服IPTG对大肠杆菌生长的抑制作用。为了进一步研究该基因的功能，本研究成功构建了PaWB tRNA-ipt基因的植物表达载体Cam35S-GFP tRNA-IPT。用花粉管介导法进行拟南芥转化试验，对收获种子进行转化效果测定，但结果未检测到外源基因的整合。
参考文献：
[1]. 小麦Mlo基因原核表达、抗体制备及免疫金标记[D]. 陈锋. 浙江大学. 2004
[2]. 小麦TaMlo基因的原核表达、抗体制备及细胞化学分析(简报)[J]. 李凡, 胡东维, 陈锋, 崔晓峰. 实验生物学报. 2005
[3]. 桑树黄化型萎缩病病原及其响应蛋白的蛋白质组学研究[D]. 冀宪领. 山东农业大学. 2008
[4]. 泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶及tRNA-异戊烯基焦磷酸转移酶基因研究[D]. 宋传生. 中国林业科学研究院. 2014
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