（安徽省宿州市立医院肿瘤内科 安徽 宿州 234000）
【摘 要】目的：SOCS1沉默的iAPA（inhibition of antigen presentation attenuators） DC/CIK细胞治疗晚期恶性肿瘤惠者的安全性及近期临床疗效。方法：观察27例临床确诊为晚期恶性肿瘤的患者，iAPA DC/CIK治疗的不良反应、肝肾功能变化；治疗后肿瘤标记物、免疫指标和卡氏（KPS）评分的变化。结果：SOCS1沉默的iAPA DC/CIK细胞治疗不良反应发生率低，安全可靠；治疗后，肿瘤标记物有降低，CD3+、CD4+、CD8+的指标都有显著提高(P<0.05)，KPS评分不同程度的提高。结论：SOCS1沉默的iAPA DC/CIK细胞治疗晚期恶性肿瘤患者安全性好，近期临床疗效好，改善患者的生活质量。
【关键字】DC/CIK；SOCS1沉默；晚期恶性肿瘤；疗效；安全性
【中图分类号】R733 【文献标识码】B 【文章编号】1004-6194（2015）02-0434-02
【Abstract】obiecdve：To inwestigate the safety and clinical effects of SOCS1 silenced iAPA（inhibition of antigen presentation attenuators）DC/CIK on patients with advanced cancer.Methods:Twenty-seven patients with advanced cancer were treated with iAPA DC/CIK therapy .T lymphocyte subtypes and intra-cellular cytokines in peripheral blood of the patients were analyzed.Performance Status (KPS) and clinical effects were observed.The safety were also observed.Results:The ratios of CD3+,CD4+ and CD4/CD8 increased after treatment ,which showed significant statistical difference(<0.05).The effective rate of KPS was 96.296%. Conclusion: iAPA DC/CIK cell-therapy can improe functions and elevate life quality of the patients. iAPA DC/CIK celltherapy is likely to be an effective adoptive immunotherapy for advanced cancer.
【Key words】DC/CIK； SOCS1 silenced ；Advanced cancer；Clinicl effects；The safty
肿瘤是严重危害人民生活和健康的重大疾病之一。肿瘤的生物治疗已成为继手术、放疗、化疗后的第四种肿瘤治疗模式。在肿瘤的生物治疗中，以树突状细胞（Dendritic cell，DC）递呈肿瘤抗原诱导机体特异性抗肿瘤免疫，结合肿瘤抗原特异性CTL治疗的肿瘤生物治疗模式已成为目前临床试验研究的方向。SOCS1沉默的DC/CIK细胞技术: 是一种新型免疫细胞治疗技术，技术的核心系采用小干扰核糖核酸（siRNA）特异性阻断抗原呈递细胞（DC细胞）和淋巴细胞中关键的负调节因子，使其基因表达沉默，诱导机体突破自身对肿瘤的免疫耐受。我们主要观察患者SOCS1沉默的DC/CIK细胞治疗的近期临床疗效及临床安全性分析。
1 材料及方法
1.1 材料收集
收集我院从2013年5月至2014年9月间采用SOCS1沉默的DC/CIK细胞治疗恶性肿瘤病人，共27例，女10例，男17例，年龄38-70岁；其中肺癌5例，食管癌2例，胃癌1例，结直肠癌3例，肾癌1例，乳腺癌1例，卵巢癌2例，前列腺癌2例，软组织肉瘤3例，宫颈癌1例，肝癌2例，鼻咽癌1例，脑瘤2例，子宫内膜癌1例，胃套细胞淋巴瘤1例。27例患者均接受过放化疗。患者入选标准：所有患者均经过病理学确诊，KPS评分>60分，预计生存期超过3个月，外周血白细胞数＞ 3 × 109 ／L，MCV必须大于30%、肝肾功能、血凝大致正常,无心、肺、肾、脑功能障碍，入选患者完成至少两次以上的SOCS1沉默的DC/CIK免疫细胞治疗。治疗期间未接受放化疗。
1.2 具体方法
1.2.1 外周单个核细胞的采集
治疗前签署知情同意书，常规检查血常规、肝肾功能、免疫四项、血凝四项、肿瘤标志物、流式细胞仪测淋巴细胞亚群、心电图；采血前6小时患者不可食用过度油腻食物；
用血细胞分离机循环采血，采血循环总量为3000毫升-5000毫升，收集外周血中单核细胞80-100ml，淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞（PBMC），获得纯度在90%以上的PBMC，种子细胞获取量为1x109-2x109；
1.2.2 在GMP细胞学实验室进行单核细胞的培养、扩增。
获取的PBMC在37℃，5%CO2贴培养箱中孵育。收集贴壁细胞即DC细胞，在第0天用含IL-4、TNF等细胞因子的培养基进行培养，隔天需半量换液，培养至第6天加入TNF-ɑ，iAPA因子细胞（iAPA因子由北京英默生物科技有限公司提供），第七天DC细胞成熟，其数量可以达到1-2 x 108。
收集悬浮细胞即CIK细胞，第0天加入含IFN-γ、抗CD3单抗等无血清生长培养基。24h后加入含IL-1、IL-2等无血清生长培养基。每2～3d更换培养基一次，补加IL-2。培养至第14天成熟。细胞数量可以达到5-6 x 109；
乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染者细胞培养在负压实验室进行。
1.2.3 质检
台盼蓝染色检测细胞活力；流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达；在电子显微镜下进行细胞数目人工计数；取少量培养物检测细菌、真菌、衣原体、病毒等。单核细胞及淋巴细胞扩增后，要求淋巴细胞比例90%以上，每次回输细胞数为＞1.5×109，细胞活率≥95%，CD3+CD56+≥20%，CD3+CD8+≥50%，不含细菌、真菌、支原体和内毒素；
1.2.4 细胞回输
第七天和第八天，成熟的DC细胞半量分别加入100ml生理盐水静脉回输；第十四、十五天，回输培养成熟的CIK细胞半量加入100ml生理盐水中静脉回输；
回输结束后第二天流式细胞仪测患者淋巴细胞亚群，肿瘤标志物在下一疗程治疗前复查。回输中、后尽量避免应用地塞米松等免疫抑制剂。治疗时机选择：一般放疗结束后5天，化疗结束后7天。两次生物治疗之间应该间隔2个月。
1.3 评价方法
回输时及回输结束后对其安全性进行评定：安全性评价包括不良反应观察、血常规、肝肾功能相关指标的改变；治疗两个疗程后对近期疗效的评定包括生活质量、病灶缓解情况、肿瘤标志物变化、免疫系统相关指标的改变。统计学方法采用SPSS 19.0 统计软件进行处理， P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1安全性评价
（1）不良反应观察 静脉回输过程中及回输后24 h 内患者是否出现发热、皮疹、呕吐、腹痛、呼吸困难、胸闷等不良反应。
至今已完成治疗27例患者中，有不良反应者3例（11.11%，3/27）：均表现为发热，最高达39.6℃，经对症处理即可缓解，发热时间一般回输的当天和第二天，并且初次治疗出现发热的患者，在后面每次治疗中均有发热出现。无腹痛、呕吐、皮疹、呼吸困难、胸闷等不良反应。
（2）血常规、肝肾功能相关指标改变
治疗前后患者血常规（白细胞、中性粒细胞、单核细胞、血小板），及肝肾功能（GLU／ALT／AST ／Alb／TBil／DBil／Cr／BUN）检测均无明显改变。
2.2 近期疗效评定
（1）生活质量：采用KPS评分标准，提高20分以上为显效；提高lO一20分为有效；提高10分以下至下降10分以内为稳定；下降10分以上为恶化。
27例患者在两疗程治疗结束后显效7例，有效12例，稳定7例，恶化1例。总有效率96.296%（26/27）.
（2）疗效评价：可测量病灶客观缓解率（OR）。用CT或彩超测量病灶大小（双径测量），按WHO 规定的评定肿瘤近期疗效标准，即每2 个疗程后作评价，分为病灶完全缓解(CR)，病灶部分缓解(PR)，病灶稳定(SD)，病灶进展(PD)
27例患者中CR 0例，PR10例，SD 15例，PD 2例，OR 92.592%（25/27） 。
（3）治疗前后肿瘤标记物的检测
检测患者的SOCS1沉默的DC/CIK细胞治疗前后的肿瘤标记物 (CEA、cAl25、SCC、AFP、CA199)的改变情况：27例中12例下降；14例无变化；0例升高。
（4）细胞治疗前后免疫系统的影响
27例患者细胞回输后均表现精神状态良好，治疗前后前后患者免疫系统相关指标如表1所示，治疗前后患者的外周血中CD3+、CD4+细胞均有明显的上升(P<0．05)
（5）肿瘤进展和生存观察
27例患者SOCS1沉默的DC/CIK细胞治疗2-7疗程结束以后，随访结果5例死亡，9例病情稳定，13例患者有不同程度的病情进展。
3 讨论
原发性肝癌具有起病隐匿、病程短、进展快、恶性程度高、生存期短等特点，发现时多属晚期，故临床治疗难度大，患者生活质量差，病死率高，严重危害着人类的生命和健康。原发性肝癌的治疗在于早发现、早治疗，以往外科切除手术一直是原发性肝癌的主要治疗手段[1]。但原发性肝癌是在肝炎和肝硬化的基础上发生，越来越多证据显示其多为多中心性发生。手术切除(特别是肿瘤位于接近第一肝门部位时)直接影响肝脏储备功能；手术中挤压可能导致肿瘤细胞的转移；手术后患者全身的免疫机能受到抑制；多中心起源的病例治疗难度大，无法彻底清除肝内所有病变(包括亚影像学微小多发病变)。以上诸多因素存在导致单纯外科手术切除肝癌模式难以进一步提高原发性肝癌患者的生存率[2]。基于肝癌的局部治疗上经验的逐步总结和积累以及疗效的提高，肝癌的治疗模式从原先单一的外科手术治疗逐渐演变到目前的多学科综合治疗。
目前认为,肝癌的发生、发展与机体的免疫功能状态密切相关[3],肝癌患者免疫功能低下是肝癌容易复发和转移的重要原因之一。因此,如何将现有治疗原发性肝癌的主要手段手术及介入微创治疗与肿瘤的细胞免疫治疗有机的结合起来是目前探讨的热点O 近年来的临床试验研究表明过继细胞免疫治疗对抑制原发性肝癌的复发和转移具有重要作用[4].
本实验研究中的SOCS1沉默的iAPA细胞的核心系采用小干扰核糖核酸（small interfering ribonucleic acid, siRNA）特异性阻断抗原呈递细胞（如DC）和淋巴细胞中关键的负调节因子（如SOCS1基因），使其基因表达沉默，诱导机体突破自身对肿瘤的免疫耐受，进而提高肿瘤免疫治疗的临床疗效。其主要特点在以下3方面：（1）通过抑制SOCS1的表达，可有效突破自体免疫耐受，增强疗效；（2）iAPA技术选择广谱肿瘤抗原Survivin和MUC1负载DC，可增强DC对特异性抗原的呈递能力；（3）iAPA技术可有效促进肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞CTL的增殖与活化，同时抑制负调节Treg细胞表达。本研究结果显示中，iAPA DC/CIK细胞回输后患者外周血T淋巴细胞亚群中CD3+，CD4+效应细胞的比例和CIM+／CD8+比值显著上升，CD8+T效应细胞比例下降，反映了机体免疫功能得到不同程度的改善，增强了清除肿瘤细胞的能力，使肿瘤细胞对机体的免疫抑制减弱；肝癌患者回输iAPA DC/CIK细胞后，体内NK细胞数量明显提高，对清除残存肿瘤细胞，抑制肿瘤的复发具有重要作用。
本研究中细胞的制备执行了严格的质控标准，使用的试剂符合SDA的安全标准，操作均在符合GMP要求的实验室中进行，并多次进行多次的细菌、真菌、支原体和内毒素检测，结果均为阴性，才进行回输，确保治疗的安全性；采用自体iAPA DC/CIK细胞，避免使用异体细胞可能带来的免疫排斥反应；在治疗过程中，除发热外无其他明显不良反应，目前认为 生物治疗中患者中度发热是机体免疫功能正常反应的结果，该反应对治疗有益[5]。绝大多数无其他严重不良反应，有较好的耐受性。以上充分说明了iAPA DC/CIK细胞治疗的安全性。在生活质量上，通过KPS 评分对患者进行体能状态评估发现，治疗后KPS 评分总有效率96.296%；此外，大多数患者乏力、食欲不振及精神状态差等临床症状有明显改善。从SOCS1沉默的DC/CIK细胞治疗对患者的肿瘤标记物和免疫系统的影响来看，治疗前后肿瘤标志物下降或稳定，无升高。临床客观缓解率OR达到92.592%。
综上所述，SOCS1沉默的DC/CIK细胞治疗恶性肿瘤具有，毒副作用低，安全性好，近期疗效可。对手术、放疗、化疗已无适应症的患者可以提高免疫功能，缓解和减轻临床症状，改善生活质量。为晚期恶性肿瘤的治疗提供了一种新的有效手段。
参考文献：
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论文作者:李红
论文发表刊物:《中国慢性病预防与控制》2015年2期
论文发表时间:2016/3/23
标签：细胞论文; 肿瘤论文; 患者论文; 肝癌论文; 免疫论文; 疗效论文; 沉默论文; 《中国慢性病预防与控制》2015年2期论文;