张淑红[1]2004年在《枣树抗枣疯病生理机制的研究》文中研究表明枣树是我国重要的经济林树种之一，在我国大部分地区广泛种植。枣疯病是由植原体引起的枣树上一种毁灭性系统侵染病害，给我国的枣树生产造成巨大的经济损失。本研究采用嫁接病皮的方法接种病原，以嫁接病原后的不同枣树品种和单株为试材，观察其田间生长状况，嫁接情况并对体内的病原进行PCR检测鉴定；病理生理学方面，生长季节内对嫁接枣树不同品系抗病植株和感病植株枣吊内过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、吲哚乙酸氧化酶(IAAO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性及POD、IAAO同工酶进行了测定和比较；同时，对不同枣树品系叶片的酚类物质、绿原酸、蛋白质、氨基酸含量进行了比较和研究，旨在进一步从生理生化的角度探讨枣疯病问题，为枣疯病的研究提供一些基础数据。主要试验结果如下： 1．枣树通过嫁接病皮可以传病，用聚合酶链反应(PCR)技术对枣树体内的病原进行检测，结果发现，在所有嫁接枣树植株内都能检测到植原体的存在，抗病婆枣单株、蛤蟆枣内病原浓度相对较低，婆枣感病株和酸枣病株病原浓度较高，胡瓶枣内病原浓度也比较高。病菌的存在与否和枣树的发病症状间没有直接关系，一些抗病性强的品种和单株尽管体内含有植原体，但不表现症状。 2．用分光光度法对枣树枣吊内POD、PPO、IAAO、PAL酶活性进行测定，结果表明同一枣树品种不同单株间四种酶活性的变化趋势在生长季节中没有太大的差异，但是婆枣中感病单株的POD、PPO、IAAO酶活性比抗病单株高，PAL酶活性比抗病株低；胡瓶枣中感病株POD、IAAO酶活性比抗病株高，PPO、PAL酶活性比抗病株低。这表明不同枣树品种对植原体的侵染反应是有差异的。 3．用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法对枣树叶片的POD、IAAO同工酶进行了研究和比较，结果表明婆枣抗病感病单株叶片的POD和IAAO同工酶酶谱在8月份的测定中差别都比较大，在7月和9月份的测定中差别不大；胡瓶枣不同单株间两种同工酶谱在3次测定中差别都不明显。 4．同一枣树品种不同单株叶片内酚类物质和绿原酸含量有一定差异。在7、8、9月3次测定中，婆枣抗病单株叶片总酚和绿原酸含量都比感病单株高。胡瓶枣中抗病株叶片的总酚和绿原酸含量也比感病株高。不同枣树品种叶片内总酚和绿原酸含量进行比较，结果表明抗病品系叶片内酚类物质和绿原酸含量也比感病品系高，因此酚类物质和绿原酸可以作为研究枣树抗病生理的一个重要指标。 5．同一枣树品种不同单株叶片内蛋白质含量有一定差异。在7、8、9月3次测定中，婆枣感病单株叶片内蛋白质含量都比抗病株高；胡瓶枣感病病株叶片蛋白质含量也比抗病单株高。不同枣树品种叶片蛋白质含量比较表明，感病品种叶片蛋白质含量均比抗病品系高。而氨基酸含量的变化在不同品种和同一品种内的变化都没有明显的规律性。
薛渝峰[2]2008年在《植原体诱导下抗枣疯病相关基因的差异表达研究》文中进行了进一步梳理枣(Ziziphus jujuba Mill.)为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Ziziphus Mill.)植物,是我国特有的宝贵种质资源和重要的特色果树。枣疯病由植原体引起,是枣树上最严重的毁灭性病害之一。利用现有的抗病种质资源,借助分子生物学手段和方法克隆抗病基因,开展分子辅助育种具有重要意义。本研究利用cDNA-AFLP技术,以感病品种‘赞皇大枣'为对照,进行了抗枣疯病品种‘星光'在植原体侵染后不同时期相关基因的差异表达分析。获得如下结果:1.获得了86条差异条带,其中26条为抗病相关条带,14条为感病相关条带,与植原体侵染相关的条带18条,感病品种特有条带24条,抗病品种特有条带4条。应用130对cDNA-AFLP引物对枣接种病原侵染前后的全部cDNA进行了分析和比对,获得20对能扩增出抗枣疯病品种不同时期与对照样品之间的差异表达量或者差异表达条带的AFLP引物,引物Eaa/Mgt扩增出的1条400bp差异表达片段,只出现在抗病品种病原侵染后的样品中。引物Ec/Maa扩增结果显示在250bp处有1条带与植原体侵染有关,非抗病相关也非感病相关。2.确定了‘星光'抗病机制诱导产生的不同时期。通过对嫁接侵染后55d到115d‘星光'体内产生的差异表达条带的数量进行分析,认为侵染后55d～75d为抗病机制的启动期,75d～115d是抗病机制的充分表达期,到115d以后进入抗病机制产生后的稳定期。3.初步确定了一条与枣疯病抗性相关的核酸序列,长度233bp。回收了4条差异片断,经过测序获得了其中3条差异片断的核酸序列,序列长度分别为399bp、233bp和240 bp。利用NCBI数据库,进行了Blast比对分析,其中一条233bp的片段与数据库中小麦条锈病诱导相关序列同源性达到了95%,与木薯胁迫抗性相关序列同源性达到了100%。初步确定该序列是植原体侵染后‘星光'体内产生的抗性相关片段。
于少帅[3]2016年在《植原体tuf基因启动子分子特征和枣树抗植原体物质研究》文中进行了进一步梳理植原体是一类引起众多植物病害、无细胞壁、不能分离培养的原核微生物,其寄主种类多,危害面积广,对经济和环境等影响严重。由植原体引起的泡桐丛枝病、枣疯病、苦楝丛枝病、桑萎缩病、莴苣黄化病等是我国泡桐、枣树等植物的一类毁灭性的病害,因此,从病原微生物遗传多样性、系统进化、关键基因调控、寄主抗病物质分析等角度来研究植原体生长繁殖和遗传变异机制及其与寄主之间的互作关系有助于解决相关病害研究的基础理论问题和提高病害防治水平,对于保障农林业的健康发展具有较为重要的生态意义和经济价值。本研究选用植原体的rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB,pyrG和rpoB共10个持家基因序列,结合16S rDNA序列,以全基因组序列已完成的洋葱黄化植原体(OY-M)、翠菊黄化丛枝植原体(AYWB)、澳大利亚葡萄黄化植原体(CPA)、草莓致死黄化植原体(SLY)和苹果簇生植原体(CPM)共5种植原体株系为参照,分析来自我国10个省的苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、泡桐丛枝和长春花绿变植原体共18个株系的遗传变异规律和系统发育关系,通过多重序列比对分析不同基因片段的序列多态性和变异程度。研究结果表明:我国18株苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、泡桐丛枝和长春花绿变植原体株系的rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB,pyrG和rpoB多位点序列共有15种序列类型,揭示了16SrI组不同植原体株系间丰富的遗传多样性。基于rp等10个基因多位点序列分析可将16SrI-B、D亚组的不同植原体株系清晰的分开。10株苦楝丛枝植原体株系与2株桑萎缩植原体株系统发育关系最近,多位点序列分析可将这两种基于16S rDNA序列难以区分的植原体株系加以清晰的区分。10株来自我国不同地区的苦楝丛枝植原体株系分为4个进化枝,其多位点序列存在8种序列类型,这4个分枝与植原体株系的地理分布关系密切。与我国长春花绿变和泡桐丛枝植原体株系相比,福建叁明2株莴苣黄化植原体株系与日本洋葱黄化植原体株系OY-M系统发育关系较近。在已检测分析的植原体不同基因序列片段中,dnaK基因序列片段的变异水平最高。利用热不对称交错式PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)扩增枣疯植原体(JWB)tuf基因上游未知序列,利用启动子探针载体pSUPV4成功构建了泡桐丛枝植原体(pawb)和jwbtuf基因上游序列的大肠杆菌异源表达体系,分析、验证了pawb、苦楝丛枝(cwb)、莴苣黄化(ly)、桑萎缩(md)、长春花绿变(pev)等16sri组和jwb、樱桃致死黄化(cly)、重阳木丛枝(biwb)、黄金槐丛枝(sowb)等16srv组株系tuf基因上游序列的遗传变异特征和启动子活性。研究结果表明:泡桐丛枝等16sri组植原体株系tuf基因和其上游fusa基因之间的间区序列长129-130bp,预测有完整的启动子保守结构。pawb-sdyz、ly-fjya1、pawb-fjfz株系tuf基因上游130bp片段和cwb-hnsy1株系tuf基因上游129bp片段具有启动子活性,此间区序列在5种35株16sri组株系中存在4种变异类型;枣疯病植原体等16srv组株系fusa和tuf基因间区长53-54bp,未预测到完整启动子结构。jwb-jsnj株系tuf基因上游144和346bp片段,jwb-hnpy株系tuf基因上游145和347bp片段均未检测到启动子活性,fusa和tuf基因间区序列在4种21株16srv组株系中存在2种变异类型。fusa-tuf基因间区序列相对保守,基于此序列构建的进化树可清晰区分不同组别的植原体株系。通过设计长片段pcr引物,进一步扩增了我国pawb-sdyz、pawb-fjfz和ly-fjya1植原体株系tuf基因及其上游6个基因rpll、rpob、rpoc、rps12、rps7、fusa序列,统计分析已研究的植原体基因启动子的保守区域序列特征。通过反转录pcr(reversetranscription,rt-pcr)等方法检测了植原体tuf基因及其上游部分基因在植原体中的转录表达情况。研究结果表明:扩增获得了pawb-sdyz、pawb-fjfz、ly-fjya1株系tuf基因上游12745-12748bp的序列,比较分析发现pawb-sdyz、pawb-fjfz、ly-fjya1、oy-m、aywb、paa、sly、at植原体株系tuf与其上游6个基因的结构顺序皆为5’-rpll-rpob-rpoc-rps12-rps7-fusa-tuf-3’。根据研究涉及的52个可能植原体基因启动子保守区域结构的序列特征,推测出可能的植原体基因启动子保守区域序列模式为:t90t100g92t75g67a85(-35区);t90a96t92a98t73t90(-10区)。基于8个植原体株系的rpll-tuf核苷酸序列编码基因、基因间区非编码序列、编码氨基酸序列的mlsa分析可将不同组别、不同亚组、不同寄主的植原体株系以较高的支持率清晰的区分,与rpll-tuf核苷酸编码区相比,不同植原体株系rpll-tuf核苷酸非编码区变异水平更高。通过植物化学手段抽提抗枣疯病枣树叶片中的活性成分,并检测枣树提取液对部分细菌的抑菌活性,利用高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography,hplc)等技术检测分析枣树提取液中相关抗病物质及其含量。通过用不同浓度枣树提取液处理枣疯病和泡桐丛枝病组培苗分析其对组培苗生长和症状的作用。研究结果表明:在已抽提的20份抗枣疯病能力不同、嫁接传病后的枣树提取液中均检测到水杨酸,且含量差异显着(P=0.000<0.05)。茉莉酸仅在表现严重丛枝症状(IV-V级)的中抗品系87、138号枣树叶片提取液中检测到,而在表现严重丛枝症状的感病品系,和抗病接穗嫁接到病砧木上或表现轻症状(I-III级)或恢复无症(0级)的枣树叶片中皆未检测到;水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯在20份抗病和感病枣树提取液中均未被检测到。不同的枣树材料甲醇提取液对坚强芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌等细菌的生长具有较为明显的抑制作用,143、55、103号抗病枣树材料提取液处理的蕈状芽孢杆菌抑菌圈直径在5.75~8.5mm之间,差异显着(P=0.004<0.05)。枣疯病和泡桐丛枝病组培苗外植体会因MS培养基中甲醇溶剂和枣树提取液浓度过高而产生药害或致死。MS培养基中甲醇或枣树提取液含量变化会对枣疯病和泡桐丛枝病组培苗外植体生长和症状有一定的影响。多位点序列分析可做为一种对植原体鉴定、区分以及株系遗传多样性全面检测的有效、可靠的方法。在以后的研究中该方法可广泛应用于深入探讨植原体不同组间或亚组间株系的遗传变异和系统发育关系。关于植原体启动子、相邻基因结构解析和枣树抗病物质研究所建立的方法和所获得的结果有助于对植原体关键基因结构、代谢调控、遗传变异规律等的深入研究和理解,为揭示植原体生长与繁殖、生境多样性和适应性、与寄主植物和介体昆虫的互作关系、致病机理和枣树抗病机制奠定了坚实基础。对于进一步筛选和开发新型枣疯病及其它植原体病害治疗药剂和充分合理利用抗病资源、增强植物抗病能力和降低因病菌变异导致的寄主抗病性丧失,从根本上提高植原体病害的综合防治水平等都具有较为重要的理论意义和实用价值。
苑赞[4]2014年在《植原体胁迫下枣树抗病相关基因的应答》文中进行了进一步梳理植物有一套复杂的应答系统来应对病原菌的胁迫,植物抗病是一整套抗病相关的信号传递、抗病相关基因表达以及次级代谢物生成的级联反应结果。枣疯病是枣树生产中的重要病害,刘孟军等前期筛选出了抗病品种‘星光’,并构建了其在植原体侵染前后的SSH文库,其中筛选出了一系列的信号转导及抗性相关基因序列。在此基础上,本研究利用同源克隆技术,首先克隆这些抗病信号转导及抗性相关的基因,包括ZjCIPK (CBL-interacting protein kinase,与CBL作用的蛋白激酶),ZjbZIP (Basic leucine zipper,碱性亮氨酸拉链),ZjERF (Ethylene-responsive element binding factor,乙烯反应因子结合蛋白),ZjTLP (Thaumatin-like protein,类甜蛋白), ZjPR10 (Pathogenesis-related protein 10,病程相关蛋白10)和ZjHSP70 (Heat shock protein 70,热休克蛋白70),并利用RT-qPCR技术研究各基因在植原体胁迫下的表达模式；同时,克隆枣疯病植原体胸苷酸激酶(TMKZ)基因,并利用该基因和枣ZjH3基因在核酸水平的比较,建立患病枣树中植原体相对含量及繁殖活性的检测方法。取得的主要结果如下：1利用同源序列克隆法,首次克隆得到了6个枣抗病相关基因(ZjCIPK:KC559754.1,1313bp; ZjbZIP:924bp; ZjERF3’端序列：959bp; ZjTLP:KC559753.1,809bp; ZjPR10:KC559756.1, 623bp; ZjHSP70: KC559755.1,1965bp)和1个植原体TMKZ基因(KC493615.1),全长639bp,编码213个氨基酸。2生物信息学分析表明,ZjERF属于B2亚族,ZjTLP定位于细胞膜外,ZjERF和ZjbZIP定位于细胞核内；进一步利用GFP融合蛋白对ZjTLP进行了亚细胞定位,确定其定位于细胞膜外。3利用qPCR技术首次建立了植原体的含量及活性检测方法。即以枣ZjH3基因为内参,用患枣疯病叶片中植原体TMKZ基因DNA水平的相对含量表示植原体浓度,以其RNA水平的相对含量表示植原体繁殖活性。4枣疯病植原体侵染后,感病品种‘婆枣’中病原浓度随侵染时间的延长呈递增趋势,抗病品种‘星光’中的病原浓度也呈递增趋势,但是显着低于‘婆枣’。侵染后40d至95d‘婆枣’中植原体繁殖活性逐渐增强,115d后开始下降；而‘星光’叶片中的病原一直没有繁殖活性。5植原体胁迫下,在侵染前期抗病品种‘星光’中本研究克隆的抗病相关基因(ZjCIPK, ZjbZIP, ZjERF, ZjTLP, ZjPR10和ZjHSP70)表达明显上调,而感病品种‘婆枣’中各基因表达普遍下调。在不同病情级别的叶片中,病情越重,抗病相关基因表达越高。
张小娟[5]2013年在《基于代谢组学技术的铜钱树砧对枣疯病的抗性机理研究》文中指出枣属鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Zizyphus）植物。枣树是我国重要的干果和特色经济树种之一，是我国最古老而又独有的树种之一，已有8000多年的栽培历史。因为它容易管理，结果早，营养丰富和用途广泛的特点，被30多个国家引入并推广到全世界。我国除了黑龙江地区没有栽植外，其他地区均有栽植。尤其以山西、河北、山东、河南、陕西五省栽培面积较大，已经成为农业生产的重要组成部分，对繁荣农村经济，提高人民生活水平起到了积极作用。西山焦枣是安徽池州的传统名特产果树品种，枣树栽培曾受枣疯病的严重危害，早在1984年，安徽农业大学园艺学院王谷媛教授提出改用铜钱树作为抗枣疯病砧木，多年来证实铜钱树作为砧木确实具有抗枣疯病的能力，而且迄今仍在枣栽培中大规模使用，有效的防止了枣疯病，且树势较旺，果实品质也有一定程度提高。本实验以铜钱树砧和西山焦枣本砧的新梢为试材，采用代谢组学技术研究，结合植物材料本身的特点，通过对枣树新梢的代谢产物进行代谢组学分析，分别制备铜钱树砧接种组和对照组新梢样品、枣本砧接种组和对照组新梢样品，通过研磨、称量、浸提、衍生化后得到各处理的水相提取物，利用气-质联用技术（GC-MS）进行样品分析，并根据NIST和Wiley数据库，检测这些代谢物在枣树生长发育过程中的代谢流变化，比较不同的处理间的主要代谢物差异。这些研究工作将为研究和揭示枣疯病的抗病机理提供依据。建立了枣树新梢水相提取物的代谢谱分析技术平台，并对枣树新梢水相供试样品进行GC-MS分析。结果表明，枣树新梢各处理的色谱峰区分度较好，分离效果很好，多种糖酸得到了有效的分离，证实了衍生化方法得当可行，优化后的色谱条件适宜枣树新梢水相样品。利用NIST质谱数据库对图谱中的代谢物逐一进行检索和鉴定，从分离得到的质谱峰中鉴定出183个峰，得出枣树新梢各处理水相提取物中最主要的成分是糖类，糖苷类，醇类，有机酸类和氨基酸类。对枣树各处理水相提取物的GC-MS检测数据进行PCA和PLS分析，结果显示，各处理样品能进行很好的区分，说明各个处理的代谢物质组成差异不大，但是同种砧木的分布形态几乎相似，表明铜钱树砧和枣本砧中两种砧木的物质组成差异很大。同一处理的不同生育时期枣树新梢样品的集中度较好，说明本实验的的重复性较好。根据枣树新梢水相提取物的PLS-DA分析，鉴定后得到VIP组分信息，在按VIP值的大小依次排列的前20种代谢物组分中，主要包括糖和糖苷类，有机酸类和氨基酸类。由此可知，铜钱树砧西山焦枣和本砧西山焦枣两种砧木的新梢样品中，被嫁接枣疯病后，枣树的糖酸代谢和氨基酸代谢发生了显着变化，为揭示枣疯病侵入枣树后，枣树哪些代谢途径的变化提供了重要依据，对研究枣树枣疯病的抗病机理也具有十分重要的意义。
申永锋[6]2008年在《抗枣疯病相关蛋白的双向电泳分析》文中进行了进一步梳理枣(Ziziphus jujuba Mill.)是我国重要的特色和优势果树树种。枣疯病是由植原体(Phytoplasma)引起的致死性传染病害,对枣产业危害极大。本课题组最近在国内外首次选育出了高抗枣疯病新品种“星光”,为揭示其抗病机制,本研究利用双向电泳和质谱分析技术,对其在植原体侵染前后不同时期的蛋白进行了蛋白质组学分析,旨在寻找抗枣疯病相关蛋白,进而通过氨基酸序列预测基因序列,为抗病基因克隆奠定基础。主要结果如下:1建立了枣韧皮部蛋白的双向电泳体系本试验通过对TCA-丙酮法和甲醇/醋酸铵法的比较,确定甲醇/醋酸铵法适宜枣韧皮部总蛋白提取,可解决枣枝皮中多糖、色素等对双向电泳的干扰问题。适宜的蛋白上样量为380μL(约200 ug),最佳平衡时间为30min-40min,第二向SDS-PAGE电泳的最佳电泳值为200V;通过考马斯亮蓝和硝酸银染色方法的比较,确定了硝酸银染色适宜于枣韧皮部蛋白染色。确定了枣韧皮部蛋白主要集中在pI4～7之间。利用本试验建立的蛋白质提取及双向电泳体系,对枣韧皮部蛋白采用pH4～7的线性IPG胶条进行分离,经硝酸银染色后获得了重复性好、分辨率高的蛋白质双向电泳图谱,经PDQuest图像分析软件处理,得到500-700个可识别的蛋白质斑点。2枣疯病抗性相关蛋白分析通过单向电泳分析,发现在枣疯病病树上嫁接的“星光”接穗与健康树上相比,在70d、90d时没有明显差异,而在嫁接后110d时,有叁条谱带(分子量为31.2 kDa、30.4 kDa、29.0 kDa)表达量显着增加。通过双向电泳和蛋白斑点比对分析,发现枣疯病病树上嫁接的“星光”接穗在嫁接后90d及110d时,在酸性端出现一随发育阶段后延而表达增强的区域(分子量27-32KD、等电点pI4.2～5.0),在对照健康树上嫁接的接穗均没有此变化。此结果与单向电泳结果一致。确定了与枣疯病抗性相关的蛋白范围为分子量27～32KD、等电点pI4.2～5.0。3获得了3个同源性较好的蛋白序列选取其中10个蛋白差异点进行了质谱分析,获得了3个同源性较好的蛋白点,分别为可溶性的NSF附着蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和网格蛋白接合蛋白,另外7个为未知新蛋白。对鉴定出的蛋白进行了分析,探讨了可能的抗病机理,为进一步研究抗性蛋白的相关基因信息打下了良好的基础。
杨艳荣[7]2008年在《骏枣不同品系间枣疯病抗性多样性研究》文中认为枣疯病(Jujube witche's broom)是由植原体引起的维管束系统侵染性病害,是枣树生产上发生最普遍、危害最严重的传染性病害,筛选高抗枣疯病种质对开展抗枣疯病育种及类似植原体病害研究具有重要意义。本课题组在前期试验中发现相同品种不同品系间对枣疯病抗性具有明显差异。据此,本研究以抗性较强的骏枣品系为材料,对其27个品系的枣疯病抗性多样性进行了研究,并从形态性状、营养学指标及基因组水平对不同骏枣品系进行了分析和评价,旨在为筛选出高抗枣疯病的骏枣品系及其进一步应用打下基础。获得的主要研究结果如下:1筛选出对枣疯病有高度抗性的骏枣品系4个。以不同品种的疯树为砧木嫁接骏枣的不同品系,进行高强度的抗性筛选。根据两年的试验结果,筛选出始终未表现症状的骏枣抗性品系:在赞皇大枣疯树上表现高度抗性的品系:T7、T15、J2、J5、J6、J8;在阜平大枣疯树上表现高度抗性的品系:T8,T15,T16,J2,J10,J7,J8,J5。在不同品种砧木上表现一致的枣疯病抗性的品系为T15、J2、J5、J8。2不同骏枣品系对枣疯病抗性表现出显着差异。根据骏枣不同品系对枣疯病的抗性表现,可分为4种情况:①感病型,整个生长期表现症状;②延迟感病型,生长前期正常,后期表现症状;③延迟抗病型,前期表现症状,在后期转为正常;④抗病型,整个生长期不表现症状。嫁接侵染后用不同时期接穗的田间症状表现与病原(植原体)的荧光检测和PCR检测结果基本一致。3骏枣品系的枣疯病抗性与形态学及营养学性状不存在显着相关性。通过对骏枣不同品系16个形态学指标的分析,发现骏枣不同品系间亲缘关系很近,枣疯病抗性品系与感病品系没有表现出显着差异;同时利用合理满意度对骏枣不同品系的营养学指标进行了评价,表明大部分骏枣品系的营养学指标没有明显差异。本研究筛选出的抗病品系T15、J2、J5、J8合理满意度分别为0.60、0.48、0.67及0.58,在骏枣品系中处于较高水平。4具不同枣疯病抗性的骏枣品系存在基因组水平的差异。通过引物筛选,利用10对多态性较高的引物对不同骏枣品系的基因组DNA进行了AFLP分析,扩增出差异条带104条,其中抗病品系特有条带2条,感病品种特有条带92条,延迟抗病和延迟感病品系中特异条带10条。
乔勇[8]2009年在《抗枣疯病相关基因的克隆与分析》文中提出枣(Ziziphus jujuba Mill.)为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Ziziphus Mill.)植物,是我国特有的宝贵种质资源和重要的特色果树。枣疯病由植原体(phytoplasma)引起,是枣树上最严重的毁灭性病害之一。利用抗病种质资源,借助分子生物学手段和方法克隆抗病基因,对开展分子育种具有重要意义。前期研究中本课题组已经发现在骏枣品种中存在对枣疯病的抗病和感病品系。本研究利用AFLP和SON-PCR技术,以骏枣抗病和感病品系为试材,进行了基因组水平上的差异表达分析,并利用获得的差异片段进行了侧翼序列的延伸。主要结果如下:1.通过骏枣抗病和感病品系的AFLP分析,获得了11条差异片段。应用56对选择性引物对对骏枣的枣疯病抗性和感病品系进行AFLP分析,最终利用筛选出的10对特异性较好的引物进行扩增和差异片段的筛选,最终确定并分析了了11条差异片段,其中6条是与抗病相关的,5条是与感病相关的。2.建立了一套适合于枣未知基因侧翼序列扩增的SON-PCR技术体系。本试验应用传统的SON-PCR技术体系不能获得理想的试验结果,经在原有体系基础上进行改进和优化,即将第二、叁轮嵌套扩增由原来的一步扩增都分为两步进行。主要是将第二、叁轮的嵌套扩增中的线性延伸单独列出,从而增加了反应的特异性和高效性。试验证明改进后的SON-PCR体系能够有效地得到目的差异条带,获得理想结果。3.利用本试验建立的改进SON-PCR技术将一条抗性相关片段(165bp)延伸到了1119bp。利用改进的SON-PCR技术将抗性相关片段R1(165bp)上游延伸了390bp,下游延伸了564bp,拼接后长度为1119bp。利用NCBI数据库,进行了Blast比对分析,此序列与白杨中编码SAUR家族蛋白(SAUR3)的mRNA序列有80%的相似性;通过开放阅读框的寻找,结果显示此序列含有一个不完整的开放阅读框,多个起始密码子,不含终止密码子,此部分开放阅读框编码161个氨基酸,其中在第24个氨基酸和第121个氨基酸之间存在SAUR(Small auxin-up RNAs)超家族蛋白的保守序列。
杨海旭[9]2010年在《枣疯病抗性的分子机制研究》文中研究指明枣(Ziziphus jujuba Mill.)是我国特有的宝贵种质资源和重要的特色果树树种。枣疯病(Jujube witches’broom disease,JWB)是由植原体(Phytoplasma)引起的高致死性传染病害。抗枣疯病品种的选育已经取得了一些进展,但抗病机制研究尚处于起步阶段。本试验以前期课题组选出的抗枣疯病骏枣品系‘交2’为试验材料,对其嫁接到冬枣和赞皇大枣砧木上出现的抗病性状差异和嫁接后在相同砧木上同种接穗间出现的抗病性状差异进行基因组和转录水平分析,以期在分子水平探讨抗病性产生差异的可能机制,为鉴定抗病基因及后续的抗病育种奠定基础。获得的主要结果如下:1.明确了DNA提取过程中苯酚抽提对枣疯病病原检测有显着影响。利用苯酚抽提与否获得的基因组DNA进行枣疯病病原检测和AFLP分析,发现苯酚抽提后,在感染枣疯病病原的基因组DNA中,病原检出率降低,尤其是病原含量较低时,甚至检测不到病原;但苯酚抽提与否对AFLP分析的扩增效果及图谱没有明显影响。2.确定了赞皇大枣、冬枣等12个品种寄主中枣疯病植原体的分子分类地位。通过对16S rDNA保守序列的分析,证明赞皇大枣、冬枣寄主中枣疯病植原体都可归于榆树黄化组(16SrⅤ组),二者同源性达到99.86%。3.初步明确了‘交2’在表观症状上枣疯病抗性出现差异的分子机制。AFLP分析表明,‘交2’在不同品种砧木上出现的表型差异应该是由于砧木基因型对接穗产生了影响导致的;cDNA-AFLP分析表明,‘交2’在同种砧木上出现的抗、感表型差异是因为在RNA表达水平产生了显着差异。4.通过AFLP分析,获得了5条枣疯病抗性相关序列,这些片段都与毛果杨cc-nbs-lrr抗性蛋白的mRNA同源性达到了70%以上。这5条DNA片段中,4条为嫁接到冬枣砧木上‘交2’接穗中的特异条带,1条是嫁接到赞皇大枣砧木上‘交2’接穗中的特异条带。5.通过相同砧木上出现不同抗病表现的‘交2’的cDNA-AFLP分析,得到了94条差异条带,其中8条与嫁接后期特异性表达相关;74条与抗病机制的充分表达密切相关;12条生长发育持续表达相关条带。其中,7条序列与大肠杆菌BL21(DE3)中葡萄糖基转移酶、DNA指导的RNA聚合酶等序列同源性均达到97%以上;1条序列与葡萄contig vv78x075502.6同源性为78%;2条序列与葡萄contig vv78x205215.10全序列同源性均为78%;2条与毛果杨预测蛋白mRNA同源性都为72%。
刘志国[10]2014年在《枣树对植原体侵染的光合响应及其抗性诱导研究》文中提出枣树（Ziziphus jujuba Mill.）是我国第一大干果树种，枣疯病是由植原体引起的传染性致死病害，已成为枣产业可持续发展的严重障碍之一。叶片黄化是植原体类病害的最主要症状之一。前期研究表明，植原体侵染引起病株叶片叶绿素含量下降、光合能力减弱，但是尚无植原体侵染对枣树光合作用影响的系统报道，并且光合作用与枣疯病抗性的关系也未见报道。本研究以具有不同抗枣疯病能力的枣树品种（抗病品种‘星光’和感病品种‘婆枣’）为试材，在理化代谢水平和分子水平上，系统比较植原体侵染后抗、感病品种光合作用的差异，旨在揭示枣树光合作用与枣疯病抗性的关系，进而为抗病品种选育提供理论参考。同时，以植物诱导抗病性理论为基础，利用本实验室创立的枣疯病抗病诱导方法，人工诱导感病品种对枣疯病的抗性，以探索枣树抗枣疯病诱导的可能形成机制。主要研究结果如下：1.首次获得5个枣光合作用相关基因全长序列，分别为：ZjGluTR（KF530842）、ZjCBP （KF530838）、 ZjRubisco （KF530841）、 ZjRCA1（KF530839）和ZjRCA2（KF530840）。2.本试验所获得两个RCA基因是由两个独立基因所编码，且在枣树中起活化Rubisco作用的主要是ZjRCA2。3.利用实时荧光定量PCR技术，对植原体侵染后抗病和感病品种中不同时期的病原进行了检测。结果发现，感病品种‘婆枣’接穗中病原的相对含量和活性随侵染时间的延长均呈递增趋势；而抗病品种‘星光’接穗中只在侵染后期才检测到少量植原体病原存在，并且无繁殖活性。4.通过对抗病和感病品种在植原体侵染后叶绿素和类胡萝卜素含量的测定发现，感病品种‘婆枣’中光合色素含量在侵染初期与‘婆枣’/健树对照差异不大，从中期开始明显下降，在侵染后期显着降低；而抗病品种‘星光’中，光合色素含量在侵染初期和中期一直显着高于‘星光’/健树对照。5.通过对抗病和感病品种在植原体侵染后一系列叶绿素荧光参数进行比较，发现感病品种‘婆枣’在植原体侵染后，叶片中光系统Ⅱ的光合活性（Fv/Fm、ΦPSII）和潜在活性（Fv/Fo）从嫁接侵染第15周后极显着低于‘婆枣’/健树对照；而抗病品种‘星光’中，Fv/Fm、ΦPSII、Fv/Fo在侵染初期极显着低于‘星光’健树对照，随后恢复正常水平。6.利用实时荧光定量PCR技术发现，植原体侵染后，感病品种‘婆枣’中光合相关基因（ZjGluTR、ZjCBP、ZjRubisco、ZjRCA2）的表达在侵染后期（嫁接后第12周至第18周）呈明显下调趋势；而此时期这些基因在抗病品种‘星光’中均表现出明显的上调表达。7.本研究认为抗病品种‘星光’中发生的光抑制属于光保护，而感病品种‘婆枣’中发生的光抑制属于光系统Ⅱ伤害。综合抗病、感病品种中不同的光合应答模式，‘星光’中的应答机制与其枣疯病抗性相关。8.以感病品种‘冬枣’组培苗为试材，利用微嫁接（病原侵染）和四环素（杀灭病原）交替进行的方法进行了抗病诱导，获得抗病诱导1次、2次和3次的组培苗单株分别为59株、63株、135株。利用实时荧光定量PCR技术，发现随着抗病诱导次数的增多，抗病诱导组培苗中抗病相关基因（ZjNBS-LRR、ZjCIPK、ZjERF、ZjbZIP、ZjTLP、ZjPR10和ZjHSP）的表达量总体呈逐渐增加趋势，并且抗病能力逐渐提高。9.对不同抗病诱导次数的‘冬枣’组培苗进行了SSR分析，经67对SSR引物分析，在不同诱导次数的材料中没有发现差异条带，说明抗病诱导组培苗没有发生基因水平的变异或仅发生了难以检测到的点突变。
参考文献：
[1]. 枣树抗枣疯病生理机制的研究[D]. 张淑红. 河北农业大学. 2004
[2]. 植原体诱导下抗枣疯病相关基因的差异表达研究[D]. 薛渝峰. 河北农业大学. 2008
[3]. 植原体tuf基因启动子分子特征和枣树抗植原体物质研究[D]. 于少帅. 中国林业科学研究院. 2016
[4]. 植原体胁迫下枣树抗病相关基因的应答[D]. 苑赞. 河北农业大学. 2014
[5]. 基于代谢组学技术的铜钱树砧对枣疯病的抗性机理研究[D]. 张小娟. 安徽农业大学. 2013
[6]. 抗枣疯病相关蛋白的双向电泳分析[D]. 申永锋. 河北农业大学. 2008
[7]. 骏枣不同品系间枣疯病抗性多样性研究[D]. 杨艳荣. 河北农业大学. 2008
[8]. 抗枣疯病相关基因的克隆与分析[D]. 乔勇. 河北农业大学. 2009
[9]. 枣疯病抗性的分子机制研究[D]. 杨海旭. 河北农业大学. 2010
[10]. 枣树对植原体侵染的光合响应及其抗性诱导研究[D]. 刘志国. 河北农业大学. 2014